張涵漪，王天一，路惠添，張濤

（北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206）

0 引言

許多類型的細胞生長和增殖均需要黏附表面，尤其是原代細胞和干細胞，為了其維持穩(wěn)定的生長分化狀態(tài)，需要在培養(yǎng)基中添加專門的生長基質(zhì)[1-2]?；|(zhì)膠(Matrigel)因含有細胞基底膜幾乎所有已知組分，能夠為細胞生長發(fā)育和功能提供類似細胞外基質(zhì)的作用，成為應用最廣泛的基底膜基質(zhì)。因其在培養(yǎng)箱中形成凝膠狀態(tài)，為細胞的三維增殖分化提供了固體細胞外基質(zhì)構(gòu)成的三維空間環(huán)境[3]，尤其在類器官培養(yǎng)中起到了不可替代的作用[4]。目前，高質(zhì)量的基質(zhì)膠產(chǎn)品主要依賴于從國外Corning 等公司進口，近年來由于中美貿(mào)易戰(zhàn)和新冠疫情等的影響，基質(zhì)膠在中國曾經(jīng)大面積缺貨，給很多企事業(yè)的生產(chǎn)和服務(wù)、科研實驗等帶來嚴重影響，成為21世紀生命科學研究中最具前景的“卡脖子”生物材料。為了較全面了解基質(zhì)膠的價值，更好地指導相關(guān)實驗研究，及為中國基質(zhì)膠產(chǎn)品的開發(fā)提供參考，系統(tǒng)綜述了基質(zhì)膠的提取制備方法及其應用領(lǐng)域。

1 基質(zhì)膠概述

基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)。1983 年，Hynda Kleinman 等研究一種被稱為Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤時，將提取制備的基底膜基質(zhì)產(chǎn)品命名為“基質(zhì)膠”進行銷售。其主要成分包括4種基底膜細胞外基質(zhì)蛋白，即層黏連蛋白（約占60%）、Ⅳ型膠原（約占30%）、巢蛋白（約占8%）和硫酸肝素蛋白多糖（約占2%～3%），以及生長因子和酶等腫瘤來源蛋白，有成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、類胰島素生長因子、TGF-β、組織纖溶酶原、金屬蛋白酶等[5]。基質(zhì)膠組分的種類和含量因其提取組織的類型和分化程度而變化，其中層黏連蛋白和Ⅳ型膠原組分的功能多樣。層黏連蛋白包括多種亞型，其中層黏連蛋白1 含有多個黏附位點，能夠為干細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞等多種類型細胞的黏附提供條件。此外，層黏連蛋白1衍生的IKVAV和YIGSR肽促進細胞分化、血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。膠原蛋白中Ⅳ型膠原最豐富，也發(fā)現(xiàn)有I、III、VI和XVIII型等膠原的存在[5]。

在冰箱冷藏或?qū)⑵渲械鞍紫♂屩凛^低濃度時，基質(zhì)膠將以液體狀態(tài)存在；而在溫度高于10℃及其中蛋白濃度不低于3 mg/mL 時，基質(zhì)膠聚合形成具有生物活性的凝膠狀態(tài)，能夠提供類似于天然細胞外基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和作用。低濃度的基質(zhì)膠可用來包被細胞培養(yǎng)器皿，在培養(yǎng)器皿表面形成薄薄的蛋白層，有利于細胞的黏附生長；而基質(zhì)膠形成凝膠狀態(tài)時能為細胞的分化提供有利條件，使其在體外呈現(xiàn)近似體內(nèi)的生長發(fā)育狀態(tài)，尤其為類器官的培養(yǎng)提供不可或缺的載體[6]。

2 基質(zhì)膠提取制備的研究現(xiàn)狀

2.1 基質(zhì)膠的生物組織來源

在正常組織中，基底膜含量甚微，是一種相對不溶的結(jié)構(gòu)。如前所述，基質(zhì)膠起源于小鼠EHS肉瘤組織提取物，該腫瘤組織相對溫和，在小鼠體內(nèi)生長迅速，可提供大量的基底膜組分，是當前基質(zhì)膠提取制備的主要生物組織來源。1944年，瑞典Engelbreth-Holm博士捕獲一只野生型小鼠，并切除了腫瘤組織；1961年，美國Swarm博士獲得該腫瘤組織并進行了研究[7]。為了紀念Engelbreth-Holm博士的發(fā)現(xiàn)，及Swarm博士對該組織的保存與特征研究，將其命名為EHS 腫瘤，在分類上屬于低分化軟骨肉瘤，在生物學特性上具有明顯異質(zhì)性[8]。此后，層黏連蛋白、硫酸類肝素蛋白多糖等組分逐漸從中得到分離、鑒定，1990年，商品化的基質(zhì)膠出現(xiàn)。由于EHS 肉瘤細胞難以在體外培養(yǎng)和大規(guī)模擴增，所以，基質(zhì)膠提取制備所需的腫瘤組織需要在小鼠體內(nèi)接種生長，這也帶來了一些有關(guān)動物福利等的問題。

為了保護動物福利及降低基質(zhì)膠生產(chǎn)的組織成本，當前也有利用動物肌肉、皮膚、肝臟、子宮瘤等組織，甚至整只動物尸體進行提取制備基質(zhì)膠的報道[9]。Danielson 等[10]從EHS 腫瘤組織分離細胞，構(gòu)建了一個可傳40代以上的連續(xù)細胞系，該細胞系能夠保持EHS腫瘤細胞的表型和生物學特性，具有在小鼠體內(nèi)誘導EHS 樣腫瘤的能力，能夠合成層黏連蛋白的A/B鏈、Ⅳ型膠原、巢蛋白以及基底膜特異性硫酸類肝素蛋白聚糖，認為該細胞作為細胞外基質(zhì)來源用于檢測細胞黏附、遷移和分化方面具有應用價值。Barsky等[11]發(fā)現(xiàn)人的腺樣囊性癌和卵巢卵黃囊瘤與人其他大多腫瘤不同，它們含有大量的基底膜基質(zhì)，異體移植給無胸腺小鼠，仍能保持組織特性，盡管只有EHS小鼠腫瘤基質(zhì)膠產(chǎn)量的一小部分，但通過使小鼠甲狀腺腫大可以提高人基底膜基質(zhì)的產(chǎn)量。Abberton等[12]研究了從骨骼肌組織提取細胞外基質(zhì)的方法，并成功從小鼠、大鼠、豬和人的骨骼肌中提取了肌質(zhì)膠(Myogel)，顯示了誘導脂肪細胞分化和脂肪形成的潛力。滕以剛等[13]報道，將小鼠或大鼠等動物尸體消毒處理，去除內(nèi)臟和皮膚，利用剩余組織提取制備了能滿足3D細胞培養(yǎng)要求的基質(zhì)膠，認為其取材方便且產(chǎn)量高。廖傳榮等[14]則利用體外培養(yǎng)的纖維肉瘤細胞或骨肉瘤細胞，提取制備了基質(zhì)膠，認為其具有細胞外基質(zhì)的主要成分，有利于類器官培養(yǎng)。此外，也有利用全合成材料制備基質(zhì)膠的報道[11]，但全合成材料往往缺乏細胞生長所需的細胞因子，且生物相容性較差。因此，盡管小鼠EHS 肉瘤作為組織來源制備基質(zhì)膠仍存在一些問題，但與其他方法相比，其仍是當前基質(zhì)膠制備的主要組織材料。

2.2 小鼠EHS肉瘤模型的復制

腫瘤的接種傳代可以用分散的EHS腫瘤組織，也可以用單細胞懸液，后者可以從美國菌種保藏中心(ATCC)購買獲得。重約4 g的EHS腫瘤可以接種給至少10只小鼠，并在接種后3～4周收獲。一般使用2—3月齡C57BL/6小鼠，該小鼠是標準的近交系，也是第一個完成基因組測序的小鼠品系，基因背景清晰[15]。雌性小鼠較溫順，比雄性小鼠更容易處理，更適于作為腫瘤受體。Pili等[16]研究表明，老齡小鼠也可以用來生產(chǎn)EHS腫瘤，但是生長速度較慢，且組織學研究表明，細胞外基質(zhì)相對于腫瘤細胞的面積提高，對細胞模型的作用也有不同，老齡小鼠來源基質(zhì)膠誘導的血管生成反應小于青年鼠。

腫瘤組織可以用含5% DMSO的PBS凍存于液氮中以后使用，使用凍存的組織時，需要離心除去凍存液，腫瘤的收獲期可能會長于新鮮組織。每只小鼠可用16 G 針頭接種1 mL 組織懸液，接種部位可在小鼠頸部皮下或者后肢肌肉。一般而言，腫瘤超過4 g時容易出現(xiàn)壞死，為了獲得最大的腫瘤組織產(chǎn)量，有必要根據(jù)腫瘤大小在接種后不同時間進行收集。由于小鼠日齡、腫瘤生長時間與狀態(tài)等會影響腫瘤組織的性狀，進而對基質(zhì)膠組分產(chǎn)生影響，故為了提取制備組分和性能穩(wěn)定的基質(zhì)膠，小鼠EHS 肉瘤模型復制時，保持小鼠日齡、接種部位、接種劑量、腫瘤組織收集時間等的規(guī)范與統(tǒng)一非常必要。

在復制EHS肉瘤模型時，通過模型小鼠飼養(yǎng)條件和小鼠健康狀況的變化，改變腫瘤組織內(nèi)相關(guān)組分的含量，則可以制備非常規(guī)的基質(zhì)膠。例如，通過給小鼠飼喂動脈粥樣硬化日糧和含β-氨基丙腈日糧，可以制備含高水平Ⅳ型膠原的基質(zhì)膠，飼喂動脈粥樣硬化日糧時，可能會引起小鼠的自發(fā)性骨折，所以在飼喂2周后開始注意小鼠健康非常必要[17]。也可以用老齡化小鼠復制EHS模型，提取制備對內(nèi)皮細胞生存和分化的低支持能力的基質(zhì)膠，以模擬老齡化環(huán)境[16]；來自糖尿病小鼠或者其他疾病模型小鼠腫瘤組織制備的基質(zhì)膠，其提供的微環(huán)境對細胞功能也會有不同影響，例如，高血糖癥和氧化應激小鼠來源基質(zhì)膠對內(nèi)皮細胞成管實驗和血管生成能力有負面影響[18]。

2.3 基質(zhì)膠提取制備的方法

基質(zhì)膠的提取制備，一般是將EHS 腫瘤組織勻漿，用鹽溶液反復洗去可溶性蛋白成分，然后利用高濃度的中性鹽溶液（例如，胍鹽、尿素和硫酸銨溶液）沉淀提取不溶性蛋白成分，并進行透析純化獲得[13-14,19]，提取的基質(zhì)膠呈無色液體狀態(tài)。由于基質(zhì)膠在膠化后則不能恢復到液體形態(tài)，所以在其提取制備過程中必須要保持在4℃左右的環(huán)境，而且所有接觸基質(zhì)膠的移液管和注射器等器材也需要事先經(jīng)過低溫預冷處理。另一方面，基質(zhì)膠提取制備步驟的時間太長時，其活性會丟失，這要求其整個的分離和透析時間最好在4 d以內(nèi)完成。由于基質(zhì)膠濃度過低時不能形成固體狀態(tài)，提取制備的基質(zhì)膠蛋白濃度不應低于9 mg/mL，濃度較低的基質(zhì)膠提取物可以使用40%硫酸銨溶液進行沉淀，然后再用較小體積的溶液重懸和透析。一般來說，1 g腫瘤組織可以制備1.5 mL左右的基質(zhì)膠產(chǎn)品。若要降低基質(zhì)膠中的生長因子含量，在利用中性鹽溶液沉淀后，可以對獲得的不溶性蛋白再次利用20%氯化鈉溶液沉淀[20]。

3 基質(zhì)膠的主要用途

3.1 細胞分化實驗

基質(zhì)膠能夠促進多種不同類型細胞的分化，甚至一些細胞系和原代細胞，在接觸到基質(zhì)膠時會在不增殖的情況下分化[21-23]。該實驗中細胞一般接種在基質(zhì)膠的表面，但也可以在其凝膠化之前與細胞混合接種，通過觀察細胞形態(tài)和分析其基因表達可更好地反映細胞的分化狀態(tài)。諸如睪丸支持細胞等上皮細胞在膠頂部生長時多呈現(xiàn)柱狀，而當混在基質(zhì)內(nèi)部時形成腺體樣結(jié)構(gòu)，無論在哪種培養(yǎng)條件下，睪丸支持細胞的分化程度都比生長在塑料基底上高[24]。基質(zhì)膠上的分化反應依賴于細胞類型，細胞在基質(zhì)表面或內(nèi)部通常呈三維聯(lián)系，進而形成與其在來源組織內(nèi)相似的結(jié)構(gòu)。例如，上皮細胞形成管狀和腺體樣結(jié)構(gòu)[25]，而軟骨細胞則在基質(zhì)表面形成軟骨結(jié)節(jié)[26]。原代細胞和細胞系在基質(zhì)膠上均可呈現(xiàn)分化表型，如永生化的微血管內(nèi)皮細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞均形成幾乎一樣的毛細血管樣結(jié)構(gòu)[20]。

3.2 內(nèi)皮細胞成管實驗

內(nèi)皮細胞是第一種表現(xiàn)出形態(tài)分化的細胞種類，一旦將其接種于膠化的基質(zhì)膠，它們將在1 h內(nèi)黏附，并在隨后數(shù)小時內(nèi)相互遷移，形成帶有內(nèi)腔的管狀，最后在12 h內(nèi)成為細胞與細胞、細胞與基質(zhì)緊密連接的狀態(tài)，而轉(zhuǎn)化細胞則可在約一半的時間內(nèi)完成上述過程[27-28]。這種形態(tài)分化為評價血管生成的許多方面及治療測試提供了強有力的實驗方法。該實驗模擬了血管生成的多個步驟，包括細胞黏附、遷移、蛋白酶分泌和管狀形成[29]，管狀結(jié)構(gòu)可攝入低密度脂蛋白。此方法不僅可以模擬體內(nèi)血管生成過程，而且有高度可重復性、可量化、易操作和適于高通量篩選的特點，所以可用于篩選血管生成和抗血管生成因子、鑒定血管生成信號通路、鑒定血管生成中基因的上調(diào)和下調(diào)、鑒定內(nèi)皮祖細胞、內(nèi)皮與腫瘤細胞相互作用等。

3.3 細胞侵襲實驗

細胞侵襲是指細胞分泌金屬蛋白酶消化細胞外基質(zhì)，向其他區(qū)域或組織遷移的過程，是正常細胞或腫瘤細胞應對化學和機械刺激的反應能力，對傷口修復、血管形成、炎癥反應、組織異常浸潤和腫瘤轉(zhuǎn)移等至關(guān)重要[30]。當前，侵襲實驗多在Transwell培養(yǎng)板或Boyden小室等中進行[31]，在上室的微孔濾膜上鋪一層基質(zhì)膠后接種細胞，下層小室中可置入誘導劑，一定時間后收集下室中的細胞，進行定量計數(shù)或功能分析。此實驗可用于評價細胞的侵襲能力、分選高侵襲能力的細胞、研究介導細胞侵襲的機制、篩選對細胞侵襲具有調(diào)控作用的藥物成分等；在多種細胞共存時也可以研究細胞的相互作用，可將2種以上的細胞都放入上室，或者上、下室中分別接種不同種類的細胞。細胞遷移實驗與侵襲實驗操作類似，二者不同之處在于，前者主要評價細胞的遷移能力，其上層小室的微孔膜一般不包被基質(zhì)膠[32]。

3.4 類器官培養(yǎng)

類器官(Organoid)是利用胚胎或成體干細胞等進行體外三維培養(yǎng)，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)及功能的類似器官的細胞團[33]。相比于傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)，類器官能夠使得細胞之間進行復雜的交互，更好地體現(xiàn)了體內(nèi)細胞間作用和微環(huán)境狀態(tài)，為生物醫(yī)學相關(guān)研究提供了強大工具，是近十年來生命科學領(lǐng)域發(fā)展最為迅速的前沿性科學技術(shù)之一，類器官技術(shù)已經(jīng)廣泛應用在組織發(fā)育、疾病模型、藥效評估、器官移植和再生醫(yī)學等領(lǐng)域[34-35]。基質(zhì)膠是類器官培養(yǎng)中最常用的關(guān)鍵基質(zhì)，是促進類器官正常生長的關(guān)鍵生物材料，由于與干細胞及其形成的類器官有良好相容性，且能提供必需的信號轉(zhuǎn)導細胞因子和結(jié)構(gòu)性細胞外基質(zhì)蛋白，使其中的細胞可以在三維空間聚集、增殖、分化并自組裝，在類器官培養(yǎng)中發(fā)揮著不可或缺的作用[36]。尤其對于腫瘤類器官，腫瘤組織來源的基質(zhì)膠更適于其生長，用于腫瘤類器官培養(yǎng)和功能評價具有天然優(yōu)勢[37]。有研究表明，用腫瘤類器官進行化療藥敏測試的結(jié)果指導臨床用藥，藥敏結(jié)果對患者的敏感性達100%，特異性達93%[38]，徹底改寫了腫瘤精準治療的理念。

3.5 填塞物血管生成實驗

填塞物血管生成實驗是一種廣泛用來評價體內(nèi)血管生成的簡單方法，可以確定局部或全身性血管生成刺激因子和抑制因子、腫瘤細胞的血管生成活性、宿主源性因子的作用等[39-40]。實驗一般用C57BL/6小鼠，將300～500 μL基質(zhì)膠注射在其背部或腹股溝處皮下，檢測促血管新生因子時使用減生長因子基質(zhì)膠，而檢測抗血管新生因子時用正常或添加活性因子的基質(zhì)膠。填塞后5～7 d 對基質(zhì)膠填塞物，采用免疫組化方法檢測血管標志分子，或注射熒光標記葡聚糖后檢測其中熒光素，或采用Drabkin試劑盒檢測血紅蛋白，或采用PCR方法檢測內(nèi)皮和炎癥相關(guān)基因的表達。

3.6 異種移植

腫瘤生物學及其治療方法研究中，對動物模型的需求強烈，基質(zhì)膠可用于提高癌癥細胞、癌癥干細胞和非癌癥細胞的生長。簡單做法是，將腫瘤細胞與基質(zhì)膠混合后直接注射。腫瘤的生長速度和收取量取決于基質(zhì)膠的濃度、腫瘤細胞類型和數(shù)量、注射部位、其他類型細胞的有無以及受體動物的種類。例如，MCF-7細胞直接注射到小鼠體內(nèi)不成瘤，而與基質(zhì)膠混合后可在皮下形成腫瘤[41]；B16F10細胞單獨注射到小鼠體內(nèi)成瘤率極低，使用基質(zhì)膠后成瘤率顯著增加[42]。將基質(zhì)膠作為腫瘤細胞載體移植時，作用機制與其促進血管生成和阻止腫瘤細胞的失巢凋亡有關(guān)[43]。因此，在移植腫瘤細胞時加入基質(zhì)膠能加速實驗進程，可以節(jié)約經(jīng)費和時間。

3.7 其他應用

除了前述幾種體內(nèi)外實驗的應用外，基質(zhì)膠的新用途還在不斷地被開發(fā)。例如，由于基質(zhì)膠可促進細胞分化為腺體腺泡、骨小管和髓鞘等功能性結(jié)構(gòu)，故也許可利用體外在基質(zhì)膠誘導分化細胞替代或支持體內(nèi)組織功能，已有利用基質(zhì)膠培養(yǎng)的胰腺腺泡細胞移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，維持了數(shù)天的血糖降低[44]；鑒于基質(zhì)膠在血管生成、細胞分化或組織轉(zhuǎn)化方面作用，可將其用于促進傷口愈合或組織修復，一些初步研究已表現(xiàn)出基質(zhì)膠修復心臟和腸道組織的希望[44]。

4 總結(jié)與展望

基質(zhì)膠因其特殊的生物學特性體現(xiàn)了在生命科學研究中的重要價值，尤其隨著類器官培養(yǎng)等前沿技術(shù)的快速發(fā)展，及其潛在應用的不斷開發(fā)，已成為當前生命科學研究領(lǐng)域最為緊俏的生物材料之一。本研究綜述了基質(zhì)膠的生物組織來源、最主要來源組織EHS腫瘤模型的復制方法、提取制備方法及主要用途等，為基質(zhì)膠的實驗應用及中國高質(zhì)量基質(zhì)膠產(chǎn)品的開發(fā)提供了有價值的參考。

基質(zhì)膠雖然為細胞的三維培養(yǎng)和類器官生成提供了必需的物理支持，但不可否認的是，僅靠基質(zhì)膠構(gòu)成的微環(huán)境無法實現(xiàn)類器官的生長發(fā)育，還需要多種細胞因子、營養(yǎng)素的關(guān)鍵作用[45]。為了更好地模擬在體基底膜細胞外基質(zhì)的生物學特性，需要在以基質(zhì)膠為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中添加細胞因子或基質(zhì)蛋白質(zhì)，構(gòu)建具有組織器官特異性的特定基質(zhì)膠產(chǎn)品。盡管當前對組成成分完全明確的標準化基質(zhì)膠體系構(gòu)建仍存在困難，但必將是未來基質(zhì)膠產(chǎn)品發(fā)展的方向之一。另一方面，類器官的生長大小和均一性受到基質(zhì)膠所構(gòu)筑空間結(jié)構(gòu)的限制[46-48]，為了調(diào)控類器官生長分化的大小和密度，對基質(zhì)膠構(gòu)筑微孔的形狀和大小進行控制也非常必要，這也是未來提高基質(zhì)膠產(chǎn)品質(zhì)量和針對性的重要發(fā)展方向之一。