馮 濤，袁懿煒1，，李歸浦，趙 進1，＊，儲小軍

1 中國計量大學生命科學學院，食品營養(yǎng)與質(zhì)量安全研究所，浙江 杭州 3100182 特色農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與危害物控制技術(shù)浙江省重點實驗室，浙江 杭州 3100183 貝因美（杭州）食品研究院有限公司，浙江杭州 310058

0 引言

當前，國內(nèi)外研究者重視乳制品加工儲藏過程中的羰氨反應，在探索羰氨反應機理及特點過程中形成相關(guān)理論體系。乳制品羰氨反應主要分3 個階段：初級、高級和終級階段。初級階段主要是乳糖與賴氨酸反應生成希夫堿，經(jīng)Amadori分子重排轉(zhuǎn)化為乳糖基賴氨酸[1]，該階段會導致可利用賴氨酸和乳糖含量降低。高級階段主要是Amadori化合物分解形成糠醛類化合物[2]。終級階段較復雜且反應機制尚不清楚，主要是高級階段的中間產(chǎn)物與氨基化合物反應生成晚期糖基化終末產(chǎn)物和類黑精化合物[3]，該階段會導致賴氨酸進一步損失。

乳制品加工儲藏過程中發(fā)生羰氨反應不僅影響營養(yǎng)價值，同時對安全構(gòu)成較大隱患。在乳制品營養(yǎng)性方面，許多氨基酸都易與乳糖發(fā)生羰氨反應而失去其功能，其中最易在羰氨反應中損失的是賴氨酸。研究表明，牛乳在100 ℃、110 ℃、120 ℃ 3次滅菌20 min后，乳中的賴氨酸損失為1.1%、3.6%、9.6%[4]。即使在羰氨反應初級階段，賴氨酸與還原糖反應，產(chǎn)生糖基化賴氨酸如乳果糖賴氨酸，使大量賴氨酸被束縛和破壞。

在乳制品安全方面，羰氨反應產(chǎn)生影響人體健康的產(chǎn)物，主要包括糠醛類化合物（主要是糠氨酸和羥甲基糠醛）[5]和晚期糖基化終末產(chǎn)物（主要是羧甲基賴氨酸）。羥甲基糠醛已被證實能損害老鼠的DNA，誘發(fā)并促進大鼠結(jié)腸癌和引起中毒性腎損害[6]。歐洲食品安全委員會（EFSA）研究表明，糠醛類化合物對小鼠和大鼠具有明顯致癌性，且這種致癌性可遺傳。歐洲食品安全委員會推薦羥甲基糠醛最大限量為1.6 mg/人·d。Janzowski等[7]認為，攝入羥甲基糠醛 0.5～1.0 mg/kg沒有健康威脅。一項旨在研究糠醛類化合物對雄鼠生殖系統(tǒng)影響的研究發(fā)現(xiàn)，糠醛類化合物對雄性生殖系統(tǒng)具有毒害性[8]。晚期糖基化終末產(chǎn)物已被證明可引起氧化性應激和毒害神經(jīng)元細胞[9]，降低線粒體活力，導致能量衰竭，引發(fā)炎癥。

本試驗以嬰幼兒配方乳粉為對象，通過關(guān)鍵加工過程（生乳巴氏殺菌、配料乳混合、均質(zhì)、濃縮、濃縮乳）中羰氨反應相關(guān)評價指標（5-羥甲基糠醛、糠氨酸、可利用賴氨酸）檢測分析，為建立針對乳制品關(guān)鍵加工過程的羰氨反應綜合控制技術(shù)，創(chuàng)制基于該控制技術(shù)的新一代嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，對乳制品品質(zhì)保障、質(zhì)量安全及提高國人營養(yǎng)與健康等具有社會和經(jīng)濟意義。

1 試驗方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 設備儀器

高效液相色譜（島津）；萬分之一分析天平（梅特勒）；電熱恒溫鼓風干燥箱（立德泰勀（上海）科學儀器有限公司）。

1.1.2 相關(guān)試劑

L-賴氨酸標準品（上海葉源生物）；5-羥甲基糠醛標準品（上海葉源生物）；糠氨酸標準品（上海葉源生物）；甲醇（色譜純，麥可林）；三氟乙酸（麥可林）；草酸（麥可林）；亞鐵氰化鉀（麥可林）；乙酸鋅（麥可林）；6 mol/L鹽酸溶液；在75 mL水中加入25 mL濃鹽酸，混勻；OPA衍生試劑；稱取0.134 3 g鄰苯二甲醛（麥可林）溶于7.5 mL甲醇溶液中，加入125 μL的β-巰基乙醇（麥可林）混合均勻，用0.4 moL硼酸鈉（麥可林）緩沖溶液（0.4 moL/L，pH值=9.5）定容至25 mL，置于冰箱內(nèi)4 ℃保存1 周。

1.2 試驗方法

本試驗按照嬰幼兒乳粉生產(chǎn)工藝，依次采集生乳（巴氏殺菌前后）、配料乳（均質(zhì)前后）、配料乳減壓濃縮、濃縮等各環(huán)節(jié)乳制品樣品。各環(huán)節(jié)采集樣品為同一批次，保證樣品選用原料奶本底一致。選取3 種產(chǎn)品的生產(chǎn)線進行樣品采集。

1.2.1 樣品采集方案

對3 條生產(chǎn)線產(chǎn)品的每種工藝環(huán)節(jié)均采集3 個樣品，每個樣品混合均勻后分成2 份，分別測定其中3 種物質(zhì)的含量指標。

1.2.2 檢測方法

（1） 5-羥甲基糠醛含量檢測

樣品前處理。液體樣品：準確量取液體樣品10 mL于具塞試管中，加入5 mL草酸溶液，混合均勻，沸水浴加熱25 min，冷卻至室溫。加入3 mL亞鐵氰化鉀溶液和3 mL乙酸鋅溶液，振搖后靜置15 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容。中速濾紙過濾，棄去初濾液，收集濾液并用0.45 μm濾膜過濾，待測。

色譜條件。ODS-C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（10∶90）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL；紫外檢測波長：280 nm。

（2） 糠氨酸含量檢測

樣品前處理。吸取10.00 mL液體樣品，置于耐壓瓶中，加入10.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，渦旋混勻。置于干燥箱，110 ℃加熱水解23 h以上。加熱結(jié)束后冷卻至室溫，將試管從干燥箱中取出，定容至20.00 mL后用中速定量濾紙過濾。移取1.00 mL試樣水解液，過0.22 μm水相濾膜，濾液供上機測定。

色譜條件。ODS-C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5 um）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL；紫外檢測波長：280 nm；流動相：A相（0.1%三氟乙酸溶液），B相（甲醇）；洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

（3） 可利用賴氨酸含量檢測

樣品前處理。同（2）中樣品前處理方法。

OPA衍生化。吸取100 μL水解液和400 μL OPA溶液混合均勻后，過0.22 μm水相濾膜，濾液供上機測定。

（3）色譜條件。ODS-C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：20 μL；紫外檢測波長：325 nm。

2 結(jié)果與討論

3 條生產(chǎn)線每個階段樣品中的賴氨酸、5-羥甲基糠醛、糠氨酸含量的檢測結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中賴氨酸、5-羥甲基糠醛、糠氨酸含量

2.1 5-羥甲基糠醛含量變化分析

3 條生產(chǎn)線各工藝階段5-羥甲基糠醛含量變化如圖1所示。3 條生產(chǎn)線產(chǎn)品在巴氏殺菌前后的5-羥甲基糠醛含量上升0.027～0.092 μg/mL，均有顯著性差異（P＜0.05）。均質(zhì)前后的配料乳的5-羥甲基糠醛含量沒有顯著性差異。減壓濃縮后的濃縮乳較配料乳5-羥甲基糠醛含量上升0.042～0.106 μg/mL，均有顯著性差異（P＜0.05）。因此，巴氏殺菌以及減壓濃縮階段的加熱過程促使牛乳發(fā)生羰氨反應，產(chǎn)生中間產(chǎn)物5-羥甲基糠醛。

圖1 各工藝階段5-羥甲基糠醛含量變化

2.2 糠氨酸含量變化分析

3 條生產(chǎn)線各工藝階段糠氨酸含量變化如圖2所示。生產(chǎn)線樣品的糠氨酸含量變化趨勢一致，在巴氏殺菌前后糠氨酸含量上升1.110～2.416 μg/mL，均有顯著性差異（P＜0.05）。巴氏殺菌乳添加輔料后糠氨酸含量有顯著性差異（P＜0.05），配料乳濃縮后糠氨酸含量上升11.731～24.442 μg/mL，有極顯著差異（P＜0.01）。

圖2 各工藝階段糠氨酸含量變化

糠氨酸含量的檢測結(jié)果表明，濃縮階段羰氨反應大量產(chǎn)生糠氨酸導致含量大幅度上升。巴氏殺菌前后以及配料導致的糠氨酸含量顯著性變化。此外，配料階段糠氨酸含量上升24%～56%，但由于本底中糠氨酸含量極低，所以糠氨酸含量在巴氏殺菌乳和配料乳中含量維持在低水平。影響樣品中糠氨酸上升的最主要階段為濃縮階段。

2.3 可利用賴氨酸含量變化分析

3 條生產(chǎn)線各工藝階段可利用賴氨酸含量變化如圖3所示。3 條生產(chǎn)線樣品的可利用賴氨酸含量變化趨勢一致。生乳在巴氏殺菌后可利用賴氨酸含量降低7%～26%，說明巴氏殺菌階段高溫引起羰氨反應消耗賴氨酸，含量變化不顯著（P＞0.05）。巴氏殺菌乳配料后賴氨酸含量顯著性增加（P＜0.05），可能是配料中含有賴氨酸或蛋白質(zhì)成分。減壓濃縮后賴氨酸含量升高25%～65%，有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 各工藝階段賴氨酸含量變化情況

3 結(jié)論

分析結(jié)果表明，3 條生產(chǎn)線樣品由于工藝不同，3 個檢測指標變化程度存在差異，但整體變化趨勢一致。嬰幼兒配方乳粉各關(guān)鍵加工過程中羰氨反應主要集中在巴氏殺菌階段和濃縮階段。其中巴氏殺菌階段，生產(chǎn)線樣品中可利用賴氨酸含量降低7%～26%，糠氨酸含量上升46%～113%，5-羥甲基糠醛含量上升32%～72%。羰氨反應消耗賴氨酸，生產(chǎn)5-羥甲基糠醛和糠氨酸。同時由于本底中5-羥甲基糠醛和糠氨酸含量很低，巴氏殺菌階段生成5-羥甲基糠醛和糠氨酸總量仍在較低水平。

濃縮階段樣品脫去水分，各組分濃度上升。生產(chǎn)線樣品中可利用賴氨酸含量上升25%～65%，糠氨酸含量上升176%～444%，5-羥甲基糠醛含量上升12%～47%?？钒彼岷孔兓潭冗h大于可利用賴氨酸，說明除濃縮導致原糠氨酸濃度上升以外，濃縮階段羰氨反應大量產(chǎn)生糠氨酸。5-羥甲基糠醛含量上升程度低于可利用賴氨酸含量變化，說明在濃縮階段5-羥甲基糠醛繼續(xù)參與反應導致含量下降。

本研究羰氨反應的原料賴氨酸、中間產(chǎn)物5-羥甲基糠醛以及后期產(chǎn)物糠氨酸，可作為評價嬰幼兒配方乳粉各關(guān)鍵加工過程中羰氨反應程度的重要指標。同時結(jié)果表明，各關(guān)鍵加工過程中羰氨反應主要集中在巴氏殺菌階段和減壓濃縮階段?？赏ㄟ^監(jiān)控3個指標變化情況對巴氏殺菌和減壓濃縮階段的工藝參數(shù)進行調(diào)整，為嬰幼兒配方乳粉加工工藝優(yōu)化提供參考。