崔 平，王惠霞，李本科

濱州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東濱州 256600

0 引言

奶牛受多種病毒侵害，其中傳染性較強(qiáng)的鼻氣管炎是一種危害性極強(qiáng)的病毒性傳染病。牛傳染性鼻氣管炎又稱“壞死性鼻炎”或“紅鼻病”，常由于牛傳染性鼻氣管炎病毒（牛皰疹病毒Ⅰ型）引起的一種急性、熱接觸性傳染病。該病毒入侵牛的呼吸道，主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、鼻炎、鼻竇炎，有時(shí)引發(fā)結(jié)膜炎、腦炎、子宮炎、腸炎、膿包性外陰陰道炎及產(chǎn)奶量下降，導(dǎo)致母牛流產(chǎn)或死胎等，治療成本較大，給養(yǎng)殖場造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病最早于20世紀(jì)50年代在美國科羅拉多的育肥肉牛中被發(fā)現(xiàn)，以鼻氣管炎為主要癥狀，之后蔓延到加利福尼亞和洛杉磯等地，被命名為牛傳染性鼻氣管炎[2]。1956年Madin從病牛體內(nèi)首次分離出了牛皰疹病毒Ⅰ型，證明牛傳染性鼻氣管炎由該病毒引起[3]。雖然奶牛感染牛傳染性鼻氣管炎病毒后病死率不高，但會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，極易感染其它病原體[4]。該病臨床上具有潛伏感染期和隱性感染的特征，感染后自愈奶牛仍攜帶病毒，且無明顯病癥，為隱性感染，能向其他健康奶牛傳播病毒，導(dǎo)致奶牛患病，這也是該病持續(xù)感染、難以治療清除徹底的主要原因[5]。該病可通過多種方式傳播且速度極快，在大型集約養(yǎng)殖場，感染后陽性率可達(dá)70%以上，對肉牛生長和奶牛產(chǎn)奶量造成巨大影響?；疾?yán)重的地區(qū)會(huì)被列為疫區(qū)，禁止出口相關(guān)畜產(chǎn)品，造成養(yǎng)殖場經(jīng)濟(jì)損失[6]。牛傳染性鼻氣管炎被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的B類動(dòng)物疾病，我國將該病列為二類動(dòng)物疫病，是牛類進(jìn)出口的必檢項(xiàng)目[7]。因?yàn)樵摬《局挥幸环N血清型，目前預(yù)防該病最有效方式是注射相關(guān)疫苗[8]。為最大程度降低該病帶來危害，需研究牛皰疹病毒Ⅰ型的病原學(xué)、理化特性和基因組成結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特性，選擇合適快捷的診斷方法，了解流行現(xiàn)狀，做好預(yù)防，降低危害。

1 鼻氣管炎病毒的生物學(xué)特征

1.1 病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及理化特性

牛傳染性鼻氣管炎由皰疹病毒屬的牛皰疹病毒Ⅰ型引起，是皰疹病毒科的a皰疹病毒亞科水痘病屬[9]。牛傳染性鼻氣管炎病毒具有皰疹病毒類似外形，為正二十面體的對稱結(jié)構(gòu)，外表類似球形，直徑150～220 nm，主要由外層囊膜、內(nèi)部衣殼和核心三部分組成[10]。該病毒的衣殼外觀呈六角形，直徑80～120 nm，囊膜由宿主細(xì)胞來源的脂質(zhì)和病毒編碼的蛋白或糖蛋白構(gòu)成，核心是由雙股的DNA與蛋白質(zhì)相互纏繞構(gòu)成[11]。

牛皰疹病毒Ⅰ型對外界具有較強(qiáng)抵抗力，37 ℃能存活10 d， -4 ℃能存活30 d，-20 ℃能存活數(shù)月，-70 ℃能存活數(shù)年，但在56 ℃溫度下21 min即失去活性，因此實(shí)驗(yàn)室中該病毒常在超低溫冰箱中（-80 ℃）保存[12]。該病毒對乙醚、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑較敏感，多種消毒劑（如0.5% NaOH溶液、1%酚類衍生消毒劑、1%季銨堿溶液、5%甲醇溶液和75%的酒精等）均可滅殺該病毒[13]。Straub[14]發(fā)現(xiàn)牛傳染性鼻氣管炎病毒在0.5% NaOH、0.01%HgCl2、1%漂白粉和1%酚類中數(shù)秒鐘即可被滅殺，在5%甲醛溶液中1 min即可滅活。該病毒在10 次以內(nèi)的凍融時(shí)毒價(jià)不會(huì)降低，但經(jīng)過胰蛋白酶消化后病毒感染力下降，且耐堿不耐酸，pH值6～9時(shí)可穩(wěn)定存活，所以常保存在pH值7.0的細(xì)胞培養(yǎng)液中[15]。

1.2 病毒的基因?qū)W特征和相關(guān)蛋白組成

牛皰疹病毒Ⅰ型含有一個(gè)線性的雙股DNA基因組，長度約138 kbp，G+C占71%～72%，全序列主要包含長度106 kbp的長獨(dú)特區(qū)、長度為10 bp且?guī)в?2 kbp重復(fù)序列的短獨(dú)特區(qū)。短獨(dú)特區(qū)兩端分別為反向的內(nèi)部重復(fù)序列和末端重復(fù)序列（各11 kbp）。在DNA復(fù)制期間，長獨(dú)特區(qū)和短獨(dú)特區(qū)可翻轉(zhuǎn)，在DNA內(nèi)串聯(lián)，生成病毒基因組的4 種異構(gòu)體[16]。

牛皰疹病毒Ⅰ型基因組中，目前已鑒定73 個(gè)開放閱讀框，其編碼的蛋白質(zhì)也已被定位[17]。該基因組能編碼33 種結(jié)構(gòu)蛋白，其中12 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白與囊膜形成有關(guān)，存在于病毒的粒子囊膜和病毒感染細(xì)胞的漿膜上。編碼的囊膜蛋白中，糖基化的蛋白10個(gè)，未糖基化的2 個(gè)。10 個(gè)糖基化蛋白基因位于基因組長獨(dú)特區(qū)有6 個(gè)（gL（UL1）、gM（UL10）、gH（UL22）、gB（UL27）、gC（UL44）、gK（UL53）），位于短獨(dú)特區(qū)有4個(gè)（gE（US8）、gI（US7）、gG（UL4）、gD（UL6））[18]，其中g(shù)B、gD、gH、gL和gK是病毒在細(xì)胞中生長的必需蛋白，而gB、gC、gD、gE為發(fā)揮毒性作用主要的糖基化蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。gB蛋白幫助病毒吸附和穿入宿主細(xì)胞，gC蛋白是病毒最重要的吸附蛋白，gD蛋白可刺激宿主機(jī)體產(chǎn)生持久的細(xì)胞免疫反應(yīng)，gE蛋白主要作用于病毒在細(xì)胞間的傳播[19]。

對gB蛋白的研究較多，已完成克隆、測序等。GenBank 公布的完整gB基因有2 799 個(gè)核苷酸，位于長特異區(qū)，成熟gB蛋白的分子質(zhì)量129 kDa，為2個(gè)74 kDa和55 kDa的多肽通過二硫鍵結(jié)合組成。該蛋白具有5 個(gè)能被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的位點(diǎn)，刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，還可與硫酸肝素結(jié)合代替gC蛋白的附著功能[20]。

gC蛋白同樣位于長特異區(qū)，分子質(zhì)量為91 kDa，存在于病毒囊膜表面，具有多個(gè)抗原表位，具有較強(qiáng)吸附作用，能協(xié)助病毒穿透細(xì)胞。研究者將gC蛋白的表達(dá)基因敲除后，發(fā)現(xiàn)病毒在牛上呼吸道中的復(fù)制滴度顯著降低，說明該蛋白可能與病毒復(fù)制相關(guān)[21]。

gD蛋白由399 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為71 kDa，是牛皰疹病毒Ⅰ型復(fù)制的必需基因和主要結(jié)構(gòu)蛋白。相比其他蛋白，gD蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)免疫反應(yīng)，能同時(shí)刺激體液免疫和細(xì)胞免疫。免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，單獨(dú)gD蛋白引起免疫反應(yīng)比gB蛋白和gC蛋白更強(qiáng)烈，因此gD蛋白常為研究牛傳染性鼻氣管炎特異性抗原的首要選擇[22]。

gE蛋白是主要的毒力因子，由575 個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為65 kDa，主要作用于病毒在細(xì)胞間傳播和誘導(dǎo)宿主機(jī)體免疫應(yīng)答。該蛋白屬于跨膜蛋白，且胞外區(qū)是機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別的靶向抗原，常暴露在病毒顆粒表面。通常gE蛋白會(huì)和gI蛋白形成異二聚體，在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮運(yùn)輸作用[23]。

除以上基因和蛋白外，TK基因也是牛傳染性鼻氣管炎病毒主要的毒力因子之一，在核酸代謝過程中起主要作用，是病毒復(fù)制過程中的非必需基因，也調(diào)節(jié)著病毒在神經(jīng)細(xì)胞中的潛伏能力。缺失TK基因的病毒復(fù)制能力、毒力和潛伏能力大幅度下降，所以通常該基因被選為編輯基因缺失疫苗的首選靶基因[24]。同時(shí)，病毒中Vhs蛋白會(huì)加速細(xì)胞中mRNA降解，破壞細(xì)胞多聚核糖體結(jié)構(gòu)；其中VP8蛋白能夠改善病毒的復(fù)制，當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)下降后會(huì)導(dǎo)致病毒的感染滴度下降，還會(huì)影響gB、gC和gD蛋白的表達(dá)量。這也是牛傳染性鼻氣管炎病毒具有較強(qiáng)傳播性、潛伏性和致病性的原因[25]。

2 鼻氣管炎病毒的診斷方法

對牛傳染性鼻氣管炎病毒感染的鑒定診斷有多種方式，常通過細(xì)胞分離鑒定、組織病理學(xué)、血清學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和電子顯微鏡等。其檢測樣本采集通常根據(jù)臨床癥狀不同進(jìn)行選擇，如呼吸道型采集鼻拭子、生殖道型公牛采集精液、母牛采集陰道分泌物、流產(chǎn)型采集胎兒胸水、肺等組織液。

2.1 病毒的分離鑒定

通過細(xì)胞進(jìn)行病毒的分離鑒定是最簡單的方法，目前最常用的是牛胎腎傳代細(xì)胞和牛氣管傳代細(xì)胞，可將病毒接種到細(xì)胞上，觀察細(xì)胞病變程度，判斷病毒分離結(jié)果。該方法約需3 d。細(xì)胞從細(xì)長貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形且聚集漂浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中，說明出現(xiàn)病變，之后取細(xì)胞培養(yǎng)物與病毒陽性血清或單克隆抗體進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)。該方法被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織定為國際貿(mào)易試驗(yàn)方法之一[26]。雖然該檢測方法較可靠，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用于大批量檢驗(yàn)檢疫。

2.2 組織切片和電子顯微鏡觀察

該病毒能在牛的多個(gè)組織細(xì)胞生長繁殖（如腎、睪丸、皮膚和肺等），且能形成核內(nèi)包涵體，所以可選取牛病變部位制備切片，進(jìn)行熒光桃紅和酒石黃染色法觀察。通過顯微鏡可看到細(xì)胞核被染為藍(lán)色，包涵體為紅色，膠原為黃色[27]。在疾病早期感染階段，可通過電子顯微鏡觀察樣本中病毒顆粒的形態(tài)特征，從而快速診斷。

2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是用于檢測病毒最常用、可信度最高的檢測方法，可在幾小時(shí)內(nèi)獲得檢測結(jié)果，適用于大批量樣本快速檢測。1993年Wiedmann等[28]首次將PCR用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒，建立相應(yīng)檢測方法，數(shù)小時(shí)內(nèi)可獲得結(jié)果。PCR檢測技術(shù)被認(rèn)為和病毒分離、斑點(diǎn)免疫雜交等手段具有相同準(zhǔn)確性。但PCR常由于樣品污染或操作不當(dāng)而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)成為新選擇。

實(shí)時(shí)熒光PCR相比普通PCR具有更高靈敏度、更強(qiáng)特異性和更好重復(fù)性，且隨著反應(yīng)時(shí)間推移，檢測信號被逐步放大，能有效降低污染風(fēng)險(xiǎn)。劉占悝等[29]通過優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其檢測下限最低可到3.04×101 copies/μL，有較好靈敏度。

2.4 血清學(xué)檢測方法

2.4.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可以用來診斷疾病是否受細(xì)菌或病毒感染，具有操作簡單、靈敏度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，是國際貿(mào)易中較認(rèn)可的檢測方法。特別是牛傳染性鼻氣管炎病毒中的gB、gC、gD、gE和gG蛋白都具有良好的免疫原性，常被作為ELISA檢測的靶蛋白，這也側(cè)面提高ELISA檢測的準(zhǔn)確性。目前已有阻斷ELISA法和間接ELISA法試劑盒應(yīng)用于該病毒檢測，且阻斷ELISA試劑盒的敏感性相比間接ELISA試劑盒更高[30]。

2.4.2 中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)在血清學(xué)診斷檢測方法中是最標(biāo)準(zhǔn)和經(jīng)典的牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測技術(shù)[31]。由于該病毒的血清型只有1 種，可將樣品與病毒的陽性血清混合后判斷結(jié)果，缺點(diǎn)是靈敏度不高，容易出現(xiàn)假陽性。

2.4.3 膠體金技術(shù)

膠體金技術(shù)是以膠體金為顯色物質(zhì)，檢測抗原或抗體的分子免疫標(biāo)記技術(shù)，常用的是斑點(diǎn)免疫滲濾法和膠體金免疫層析法，具有便攜、靈敏度高、隨時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)。我國研究者利用膠體金技術(shù)建立了牛皰疹病毒Ⅰ型膠體金檢測方法，其普通PCR相比其陰性符合率高達(dá)99.17%[32]。

3 鼻氣管炎的傳播特性和流行現(xiàn)狀

自然條件下牛傳染性鼻氣管炎病毒的唯一宿主是牛，且各品種、年齡和性別的牛均有被感染的風(fēng)險(xiǎn)。秋冬季由于溫度、濕度和通風(fēng)環(huán)境變化，會(huì)使該病的發(fā)病率上升。該病毒可通過空氣和接觸傳播，感染后病牛常有10～20 d潛伏期，之后出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。感染后常體溫升高、食欲下降、精神不佳、呼吸不暢且鼻腔伴有潰爛，流出大量粘液，哺乳期母牛產(chǎn)奶量減少等，給奶牛養(yǎng)殖造成嚴(yán)重影響[33]。

該病最早發(fā)生在北美洲，Madin等學(xué)者分離出病毒毒株。隨著對該病毒不斷深入研究，大量病毒從健康牛，子宮炎、肺炎、呼吸道感染和乳腺皰疹性皮炎的牛中分離出來[34]。Saundeks等[35]對加拿大薩斯喀徹溫省1 077 頭牛開展血清抗體臨床調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其中518 頭含有病毒的中和抗體，陽性率達(dá)48.1%。除了北美洲，歐洲也是較早存在該病毒的地區(qū)。馮學(xué)平[36]對瑞士弗里堡和澳大利亞的多起牛傳染性鼻氣管炎調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于進(jìn)口白星公牛為隱性攜帶者，導(dǎo)致該病傳播。Wiseman等[37]對英國西部不同牛種群（肉牛、奶牛、犢牛）暴發(fā)的15 次傳染性鼻氣管炎進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)奶牛群中的發(fā)病率最高，達(dá)90%，且泌乳量明顯下降。大洋洲是奶牛養(yǎng)殖大洲，陳國強(qiáng)等[38]對大洋洲進(jìn)口奶牛的病毒感染進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)澳大利亞和新西蘭廣泛存在牛皰疹病毒1型感染，且澳大利亞不同的牛群病毒陽性率為15%～96%，感染率極高。Patil等[39]對印度安達(dá)曼和尼科巴群島11 個(gè)村莊的418 份牛血清樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)107 份為陽性，陽性率25.60%。我國也有較多奶牛傳染性鼻氣管炎報(bào)道?；矢推降萚40]對河南省5 個(gè)不同區(qū)域的12個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的440 份樣本調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，陽性患病奶牛68 頭，總體患病率15.45%，每個(gè)養(yǎng)牛場均有陽性樣本被檢測出，且陽性率最高的養(yǎng)牛場達(dá)68%。葉麗娜[41]對北京市不同地區(qū)的2 582 份牛血樣本分析發(fā)現(xiàn)，總陽性樣本數(shù)902 份，平均陽性率34.93%，其中房山區(qū)樣本的陽性率達(dá)100%。孫慶宇等[42]對內(nèi)蒙古16 個(gè)奶牛養(yǎng)殖場進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均陽性率75.7%。希尼尼根等[43]對內(nèi)蒙古的457 頭牛進(jìn)行血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)中東部地區(qū)較嚴(yán)重，某些養(yǎng)牛場的陽性率達(dá)100%，全自治區(qū)的平均陽性率29.5%。王永艷等[44]對山西省12 個(gè)區(qū)縣的665 頭奶牛檢測發(fā)現(xiàn)，陽性率49.6%。蘇姣秀等[45]對廣西27 個(gè)奶牛群的717 頭奶牛采樣檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率26.74%?？傊?，牛傳染性鼻氣管炎病毒在全世界廣泛流傳，我國各地也廣泛流傳。預(yù)防該病毒傳播，降低影響，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。

4 小結(jié)

隨著研究深入，對牛傳染性鼻氣管炎病毒的認(rèn)知逐漸清晰，特別對其結(jié)構(gòu)、形態(tài)、功能和感染機(jī)制越來越了解。而對于該病毒的分離檢測和鑒定手段也在不斷更新，更簡單、快速、便捷和高效的檢測方法是未來疾病檢測手段的發(fā)展趨勢。因此，加強(qiáng)對該病及病毒認(rèn)知，做好病毒的檢測工作，做好牛傳染性鼻氣管炎防控，有利于降低該病對奶牛機(jī)體健康及生產(chǎn)性能的影響，保證奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。