凌 玲，周 雨，袁 媛，安 娜

北京市石景山區(qū)疾病預(yù)防控制中心理化科，北京 100043

0 引言

酸奶以牛奶為原料，經(jīng)過殺菌、接種、發(fā)酵、包裝等工藝加工而成，因其加工過程添加有益菌，部分乳糖被分解，不但保留了牛奶的營養(yǎng)價值，還可減輕乳糖不適癥狀，適合更多消費群體。乙?；前匪徕浻置操惷郏且环N食品添加劑，具有強烈甜味。糖精鈉也是食品工業(yè)中常用的合成甜味劑，因其價格低廉被部分生產(chǎn)企業(yè)使用。酸奶中添加乙?；前匪徕?、糖精鈉等甜味劑可有效緩解發(fā)酵產(chǎn)生酸味，既滿足口感，又解決糖尿病人以及老年人和肥胖患者等特殊人群控制糖攝入量的困難。如今越來越多年輕人也更注重低糖低脂食品攝入，使添加乙?；前匪徕浐吞蔷c等甜味劑的無糖酸奶越來越受消費者喜愛。乙?；前匪徕洝⒈郊姿?、山梨酸和糖精鈉等添加劑的長期超量使用會對人體產(chǎn)生不同程度危害，但部分酸奶生產(chǎn)廠家為降低生產(chǎn)成本，獲取更大利益，濫用或超標使用食品添加劑。我國目前實施的乙?；前匪徕泧鴺藱z測方法只檢測單一成分，為同時檢測酸奶中更多食品添加劑，本文通過高效液相色譜儀，同時檢測酸奶中甜味劑乙?；前匪徕?、糖精鈉，以及防腐劑苯甲酸、山梨酸4 種添加劑的方法。通過檢測過程中可能影響檢測結(jié)果的有關(guān)因素進行不確定度分析，為檢測方法可行性、檢測結(jié)果準確性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000（DAD）高效液相色譜儀，Thermo Fisher公司；BS 224S電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司； KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司； 3-30KS高速冷凍離心機，SIGMA公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)；一次性針頭過濾器；0.22 μm水相微孔濾膜；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；乙酸銨（分析純，西亞試劑公司）；亞鐵氰化鉀（分析純，北京化學試劑公司）；乙酸鋅（分析純，北京化學試劑公司）；冰乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙?；前匪徕浫芤簶藴饰镔|(zhì)GBW（E）100171，1 000 μg/mL，北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司；苯甲酸溶液標準物質(zhì)GBW（E）100006，1.00 mg/mL，中國計量科學研究院；山梨酸溶液標準物質(zhì)GBW（E）100007，1.00 mg/mL，中國計量科學研究院；糖精鈉溶液標準物質(zhì)GBW（E）100008，1 000 mg/L，中國計量科學研究院。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取5 g（精確至0.001 g）酸奶樣品于50 mL容量瓶中，加純水40 mL，混勻，超聲20 min后分別加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）、乙酸鋅溶液（183 g/L）各1 mL，混勻后用純水定容至刻度。經(jīng)冷凍離心機13 000 r/min 離心15 min，將上清液過0.22 μm水相濾膜后上機檢測。

1.2.2 混合4 種添加劑標準使用液及標準系列的配制

分別取乙?；前匪徕洝⒈郊姿?、山梨酸和糖精鈉4 種添加劑標準溶液各1.00 mL至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，得到濃度為100 mg/L混合標準使用液。分別吸取適量濃度為100 mg/L混合標準使用液，加水稀釋并定容，配制成4 種添加劑混合標準系列工作液，濃度分別為1.00 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：C18柱（柱長250 mm、內(nèi)徑4.6 mm、粒徑5 μm）。

流動相：等度洗脫甲醇與乙酸銨溶液（0.02 mol/L）比例為10∶90。

運行時間：10 min。

流速：1.0 mL/min。

柱溫：40 ℃。

檢測波長：227 nm。

進樣量：10 μL。

2 結(jié)果

2.1 測量模型

試樣中每種添加劑含量按如下公式計算：

其中，X—試樣中每種添加劑的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

c—試樣溶液中添加劑的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（mg/L）；

V—被測試樣總體積，單位為毫升（mL）；

m—稱取試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；

1 000—換算系數(shù)。

2.2 混合標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)

以乙?；前匪徕?、苯甲酸、糖精鈉和山梨酸4 種混合標準系列工作液的濃度為橫坐標，以測得4 種添加劑相應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。由表1可知，濃度1.00～50.0 mg/L范圍內(nèi)4 種添加劑相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。

2.3 檢出限與定量限

對濃度1 mg/L混合標準溶液色譜圖分析可得，該濃度進樣時各添加劑峰高與基線噪聲的比值（信噪比）。計算信噪比（S/N）=3時對應(yīng)各添加劑進樣濃度，結(jié)合酸奶取樣量和定容體積可確定酸奶中4 種添加劑含量，得到檢出限。計算信噪比（S/N）=10時對應(yīng)各添加劑進樣濃度，結(jié)合酸奶取樣量和定容體積可確定酸奶中4 種添加劑含量，得到定量限。本試驗結(jié)果4 種添加劑的檢出限與定量限見表1。

2.4 回收率與精密度

向酸奶樣品中分別加入4 種添加劑的標準溶液，得到5 mg/L、10 mg/L、15mg/L3 個濃度的加標量，每個濃度分別取6 個平行樣共18 份酸奶樣品進行檢測。試驗結(jié)果4 種添加劑的回收率平均值為91.2%～104.8%，精密度均小于2%，試驗結(jié)果滿意（表2）。

表2 加標回收率和精密度（n=6）

3 討論

3.1 流動相選擇

乙酰磺胺酸鉀的國標檢測方法GB/T 5009.140—2003中流動相為：0.02 mol/L硫酸銨溶液+甲醇+乙腈+10 %H2SO4溶液[1]，2024年3月6日實施的新版國標檢測方法GB 5009.140—2023中流動相為：0.02 mol/L硫酸銨溶液+甲醇+乙腈[2]，配制都較復(fù)雜，且時間較長。本文以甲醇和乙酸銨溶液（0.02 mol/L）為流動相，配制簡單，不需加入甲酸調(diào)節(jié)流動相的pH值，只調(diào)整流動相的速度和比例就能使4 種添加劑完全分離。與加入甲酸的流動相相比，只是4 種添加劑出峰先后順序不同，并不影響分離效果[3]?？紤]盡可能縮短試驗時間，經(jīng)過多次不同比例的流動相試驗后，最終確定甲醇與乙酸銨溶液比例10∶90。4 種添加劑標準溶液分離效果及出峰順序見圖1。

圖1 10 mg/L 標準溶液色譜圖

3.2 波長選擇

通過二極管陣列檢測器檢測4 種添加劑在波長190～300 nm的特征吸收光譜圖。波長200～260 nm每種添加劑響應(yīng)峰值不同，4 種添加劑最大吸收波長分別為乙酰磺胺酸鉀224 nm、苯甲酸227 nm、糖精鈉200 nm、山梨酸255 nm。波長200 nm時山梨酸響應(yīng)較差，波長255 nm時糖精鈉響應(yīng)較差，波長227 nm時4 種添加劑同時響應(yīng)很好且出峰面積較均衡（圖1），最終選擇檢測波長227 nm（圖3） 。

圖3 4 種食品添加劑特征吸收光譜圖

3.3 樣品處理方法

4種添加劑的國標檢測方法中，一般樣品都經(jīng)過2 次提取[1～3]，再合并離心后的上清液定容。本方法在檢測酸奶樣品，樣品經(jīng)過稀釋混勻并超聲20 min的前處理方法一次提取4 種添加劑即可達滿意效果，通過加標回收率證明能滿足要求，縮減步驟，減少時間。

3.4 蛋白沉淀方法

不同樣品待測組份不同時，沉淀蛋白的方法不同。本方法處理酸奶樣品，采用蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅。通過多次試驗，調(diào)整2 種試劑用量，最終確定取樣量5.0 g時2 種試劑各加入1 mL沉淀蛋白效果最好，樣品加標回收率滿意。

3.5 不確定度分析

分析本方法建立的測量模型，可總結(jié)試驗結(jié)果的不確定度來源，主要包括進樣液濃度檢測過程引入的相對標準不確定度、樣品定容體積引入的相對標準不確定度、樣品的質(zhì)量測量引入的相對標準不確定度等。以乙?；前匪徕浐繛槔M行分析。

3.5.1 測量模型中進樣液濃度檢測過程引入的相對標準不確定度

本試驗中乙?；前匪徕洏藴饰镔|(zhì)證書標明相對擴展不確定度為1%，k=2，由標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度為：

本試驗使用10 mL容量瓶的允許誤差為±0.020 mL，按均勻分布計算，k=，由容量瓶引入的相對標準不確定度為：

本試驗使用10 mL容量瓶已在20 ℃校準，實驗室溫度（20±4） ℃，水的體積膨脹系數(shù)（2.1×10-4）℃-1，假設(shè)溫度變化是矩形分布，k=，由實驗室溫度變化引入的相對標準不確定度為：

本試驗標準系列取5 個濃度，采用線性擬合，得到乙酰磺胺酸鉀濃度和響應(yīng)值的標準曲線y=0.3812x，對加標（10 mg/L）樣品進行6 次測定，由標準曲線計算加標樣品濃度，可求出加標樣品濃度的平均值為x=9.828 mg/L，由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

式中：s—標準溶液峰面積的標準偏差；x—樣品測定液平均濃度；b—標準曲線斜率；m—樣品測定次數(shù)；n—繪制標準曲線的標準點個數(shù)；—繪制標準曲線標準點的平均濃度；xi—繪制標準曲線各標準點濃度；yi—各標準點峰面積實際測得值（表3）。

表3 標準曲線擬合數(shù)據(jù)計算表

由上述4 個分量合成進樣液濃度檢測過程引入的相對標準不確定度為：

3.5.2 樣品定容體積引入的相對標準不確定度

本試驗樣品處理時定容于50 mL容量瓶，該容量瓶允許誤差為±0.050 mL，按均勻分布計算，k=，由容量瓶引入的相對標準不確定度為：

原理同3.5.1，此處略。計算可得由實驗室溫度變化引入的相對標準不確定度為：

上述兩個分量可合成樣品定容體積引入的相對標準不確定度為：

3.5.3 樣品的質(zhì)量測量引入的相對標準不確定度

本試驗的樣品取樣量5.023 g，電子天平分辨力為0.001 g，則區(qū)間半寬度可假設(shè)為均勻分布，k=，由分辨力引入的標準不確定度為：

上述兩個不確定度分量不相關(guān)，所以合成樣品質(zhì)量測量引入的相對標準不確定度為：

3.5.4 合成不確定度

由測量模型以及各不確定度分量的分析，合成相對標準不確定度為：

高效液相色譜儀測得進樣液濃度9.828 mg/L，由測量模型計算樣品中乙?；前匪徕浐縳=9 7.8 3 mg/kg，合成標準不確定度為uc（x）=0.006 817×97.83=0.67 mg/kg。

3.5.5 擴展不確定度

取包含因子k=2，由合成不確定度計算擴展不確定度U=2×0.67=1.34 mg/kg。樣品中乙?；前匪徕浐?7.83 mg/kg時，結(jié)果表示為X=（97.83±1.34）mg/kg，k=2。

由不確定度分析和評定可知，采用高效液相色譜儀同時檢測酸奶中的4 種添加劑含量時，最主要的不確定度來源于進樣液濃度檢測過程。在實際檢測工作中，可通過選擇高純度標準物質(zhì)，嚴格控制標準曲線配制，定期檢定儀器設(shè)備等來提高檢測結(jié)果準確性，降低檢測結(jié)果的不確定度。

4 結(jié)論

本文建立采用高效液相色譜儀同時檢測酸奶中的4 種添加劑含量的方法。通過亞鐵氰化鉀與乙酸鋅試劑沉淀蛋白的方法處理酸奶樣品，操作簡單。通過優(yōu)化高效液相色譜儀的流動相比例及相關(guān)儀器參數(shù)，使酸奶樣品中的乙酰磺胺酸鉀等4 種添加劑色譜峰良好分離，檢測速度快，可實現(xiàn)同時檢測目的。