劉槃 席德雙 黃瑞 滕益霖 劉睿 曾高峰 宗少暉

1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院骨科（河南新鄉(xiāng) 453000）；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科（南寧 530021）；3廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（南寧 530021）；4新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院（河南新鄉(xiāng) 453000）

γδT 細(xì)胞僅為T 淋巴細(xì)胞的一小部分，但這些細(xì)胞在宿主防御做出關(guān)鍵貢獻(xiàn)［1-2］。研究［3-4］表明腸道中γδT 細(xì)胞對感染或炎癥反應(yīng)迅速，可被募集到損傷部位促進(jìn)炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)后。腸道微生物群是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，在細(xì)胞代謝、消化和營養(yǎng)吸收以及免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持方面有著至關(guān)重要的作用［5-8］。有研究［9］表明腸道細(xì)菌產(chǎn)生的代謝物對免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞有著深刻的影響。短鏈脂肪酸作為腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物之一，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和維持抗/促炎平衡方面發(fā)揮著重要作用，它是腸道微生物群和免疫系統(tǒng)之間的橋梁［10-12］，可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生［9］。然而，短鏈脂肪酸對γδT 細(xì)胞的影響有待于進(jìn)一步的研究。為此，在本研究中，采用了腸道微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸對γδT 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，旨在明確短鏈脂肪酸對γδT 細(xì)胞的影響，并分析其內(nèi)在分子機(jī)制，以期為微生物代謝產(chǎn)物治療相關(guān)疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料SD雌性大鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量（200 ± 10）g；脫氧核糖核酸酶Ⅰ、中性蛋白酶、胰酶、Percoll 細(xì)胞分離液、RPMI-1640培養(yǎng)基、佛波酯、布雷非德菌素A 及動(dòng)物組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購于北京Solarbio 科技有限公司；膠原酶Ⅳ購于美國Gibco 公司；TCRγ/δ+T 細(xì)胞分離試劑盒、Atuo MACS Running Buffer、MS 分選柱購于德國Miltenyi 公司；乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉、離子霉素購于美國Sigma 公司；CCK-8 購于安徽白鯊生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；引物由上海生工公司合成，RNA 提取試劑盒購于TaKaRa 生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于啟衡星生物科技有限公司；Fixable Viability Dye eFlour ? 780、CD3 Monoclonal Antibody（FITC）、IL-17A Monoclonal Antibody（APC）、Biolegend anti-rat TCR γ/δ（PE）及Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set 購于美國eBioscience 公司；IL-17A，P-P65，P65，IKK，β-actin（一抗）購于美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 γδ 細(xì)胞的提取取大鼠腸道組織，去除腸系膜和脂肪組織，縱向切開腸管并用PBS 清洗，將組織剪成1 mm2的小塊后加入5 mL 腸道消化液，在恒溫?fù)u床上消化30 min，使用70 μm 濾網(wǎng)過濾，此步驟重復(fù)3 次。將消化的濾液加入PBS 進(jìn)行離心洗滌，使用Percoll 梯度法分離，收集中間層的單核淋巴細(xì)胞離心洗滌后備用。將收集的單核淋巴細(xì)胞用80 μL MACS 重懸，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×107個(gè)/mL。加入偶聯(lián)磁珠的γδ+TCR 抗體，4℃避光孵育25 min，MACS洗滌后使用500 μL MACS重懸。采用Miltenyi 分離柱吸附γδ+TCR 細(xì)胞，去除磁場后洗滌出陽性選擇的細(xì)胞，即為γδ T 細(xì)胞。分選后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖-毒性檢測（CCK-8）分別用含有不同濃度（0、0.125、0.25、5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的乙酸鈉（A）、丙酸鈉（P）、丁酸鈉（B）及混合短鏈脂肪酸（Mix）（乙酸鈉、丙酸鈉和丁酸鈉混合物，混合比例為12∶5∶3）的完全1640 培養(yǎng)基將γδT 細(xì)胞接種到96 孔板中，每孔培養(yǎng)基體積為100 μL，細(xì)胞密度為1 × 104個(gè)/孔。干預(yù)24 h 后，每孔中加入CCK-8 溶液10 μL，避光孵育1.5 h 后，酶標(biāo)儀測定在450 nm 處每孔的OD值。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測IL-17A 因子含量以2 × 106個(gè)/孔的濃度將γδT 細(xì)胞接種在6 孔板中，設(shè)為對照組（Control）、乙酸鈉組（sodium acetate， A）、丙酸鈉組（sodium propionate， P）、丁酸鈉組（sodium butyrate，B）及混合短鏈脂肪酸組（Mix）。使用適當(dāng)濃度的乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸干預(yù)γδT 細(xì)胞24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，2 000 r/min 離心5 min，收集上清液。按照試劑盒的步驟檢測γδT 細(xì)胞上清液中的IL-17A 因子含量。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）檢測IL-17A 因子的表達(dá)水平按照上述的方法進(jìn)行分組和干預(yù)γδT 細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)RNA 提取試劑盒的步驟提取各組細(xì)胞的RNA，根據(jù)吸光度比值檢測RNA 260 nm 和280 nm （A260/A280）評估RNA 的完整性。隨后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測各組IL-17A 因子的表達(dá)水平。各靶基因的相對表達(dá)量由2-ΔΔCT方法。引物序列列見表1。

表1 大鼠各基因引物序列Tab.1 Primers sequence of rat genes

1.6 流式細(xì)胞儀分析IL-17+γδT 細(xì)胞的比例調(diào)整細(xì)胞懸液密度，首先使用細(xì)胞死活染料FVD-780進(jìn)行染色鑒定細(xì)胞死活，CD45-PerCP-eFluor 710，CD3-FITC，TCR γ/δ-PE 流式抗體避光染色20 min用于表面標(biāo)記分析。用固定和滲透緩沖液固定和滲透后，加入IL-17A 抗體孵育30 min。洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，采用美國Beckman Coulter 公司的CytExpert 2.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 Western blot收集6 孔板中各組的γδT 細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入相應(yīng)體積的裂解液，渦旋震蕩冰上裂解后高速離心，收集管里的上清液即是提取的總蛋白。使用BCA 法測定各組蛋白濃度并調(diào)整到一致，上樣緩沖液充分混勻后金屬浴中變性。各組蛋白等量上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜120 min，脫脂牛奶室溫封閉90 min，4 ℃下?lián)u床孵育一抗過夜，室溫避光孵育二抗1 h，TBST漂洗條帶后使用Odyssey掃描儀系統(tǒng)采集Western blot 條帶圖像，Image J 軟件對Western blot 條帶進(jìn)行分析，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)條帶蛋白與各自內(nèi)參的數(shù)值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，單因素方差分析用于比較不同組別之間的差異，P＜ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 檢測SCFAs 對γδT 增殖活性的影響短鏈脂肪酸干預(yù)24 h 后通過CCK-8 法檢測γδT的增殖活性。乙酸鈉的濃度在0.5 mmol/L 及以下時(shí)，對γδT 細(xì)胞的增殖無抑制作用（P＞ 0.05），濃度＞ 0.5 mmol/L 時(shí)對γδT 細(xì)胞的增殖有抑制作用（P＜ 0.001）。丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸的濃度在0.25 mmol/L及以下時(shí)，對γδT細(xì)胞的增殖無抑制作用（P＞ 0.05），濃度大0.25 mmol/L 時(shí)對γδT細(xì)胞的增殖有抑制作用（P＜ 0.001）。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，濃度設(shè)置為乙酸鈉0.5 mmol/L、丙酸鈉0.25 mmol/L、丁酸鈉0.25 mmol/L、混合短鏈脂肪酸0.25 mmol/L 來對γδT 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。見圖1。

圖1 SCFAs 以劑量依賴方式抑制γδT 細(xì)胞的增殖Fig.1 SCFAs inhibit the proliferation of γδT cells in a dose-dependent manner

2.2 ELISA 檢測γδT 細(xì)胞中IL-17A 因子含量ELISA 結(jié)果顯示，丙酸鈉組、丁酸鈉組及混合短鏈脂肪酸組處理的γδT 細(xì)胞上清液中IL-17A 的含量較Control 組均顯著降低，其中丁酸鈉組抑制的最明顯（P＜ 0.001），丙酸鈉和混合短鏈脂肪酸次之（P＜ 0.001），乙酸鈉組無明顯抑制（P＞ 0.05）。見圖2。

2.3 RT-qPCR 檢測γδT 中IL-17A 因子表達(dá)水平丙酸鈉組、丁酸鈉組及混合短鏈脂肪酸組處理的γδT 細(xì)胞中IL-17A 的表達(dá)水平較Control 組均顯著降低，其中丁酸鈉組降低的最明顯（P＜0.001），丙酸鈉組和混合短鏈脂肪酸組次之（P＜0.001）。RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)也在mRNA 水平印證了丙酸鈉、丁酸鈉及混合短鏈脂肪酸可以顯著抑制γδT 細(xì)胞分泌IL-17A（P＜ 0.001）。見圖3。

圖3 RT-qPCR 檢測γδT 細(xì)胞中IL-17A 因子的表達(dá)水平Fig.3 Expression of IL-17A in γδT cells was determined by RT-qPCR

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-17+γδT 細(xì)胞的數(shù)量與Control 組相比，IL-17+γδT 細(xì)胞的比例在經(jīng)過乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉以及混合的短鏈脂肪酸干預(yù)后都有明顯的下降。和乙酸鈉組相比，丙酸鈉組、丁酸鈉組和混合短鏈脂肪酸組抑制IL-17+γδT 的能力更明顯，但是丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸三者之間抑制IL-17+γδT 的能力無明顯差別。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-17+γδT 細(xì)胞的數(shù)量Fig.4 Frequency of IL-17+γδT cells was detected by flow cytometry

2.5 SCFAs 可能通過抑制組蛋白去乙?；福℉DAC）的表達(dá)來減少γδT細(xì)胞IL-17A的分泌將混合的短鏈脂肪酸（Mix）、HDAC 的抑制劑TSA、Mix + TSA 和γδT 共培養(yǎng)24 h，然后檢測IL-17+γδT細(xì)胞的比例。與Control 組相比，三組經(jīng)過處理后的IL-17+γδT 細(xì)胞的比例均明顯下降（P＜ 0.001），Mix、TSA 和Mix+TSA 三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖5。

圖5 SCFAs 可能通過抑制HDAC 的表達(dá)來影響γδT 細(xì)胞IL-17A 的分泌Fig.5 SCFAs may affect IL-17A secretion in γδT cells by inhibiting HDAC expression

2.6 SCFAs 可通過抑制IL-17A 和NF-κB 信號通路來減輕炎癥反應(yīng)通過Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測γδT 細(xì)胞內(nèi)IL-17A 的表達(dá)水平及NF-κB 信號通路關(guān)鍵蛋白。與Control 組比較，丙酸鈉、丁酸鈉和混合短鏈脂肪酸可抑制IL-17A、IκB 激酶（IKK）以及NF-κB 磷酸化水平的表達(dá)（P＜ 0.05），而乙酸鈉對IL-17A、IKK 以及NF-κB 的磷酸化水平無明顯抑制（P＞ 0.05）。見圖6。

圖6 短鏈脂肪酸對IL-17A 和NF-κB 信號通路的影響Fig.6 Effect of short-chain fatty acids on IL-17A and NF-κB signaling pathway

3 討論

γδ T細(xì)胞是一種獨(dú)特的T細(xì)胞亞群，在如皮膚、腸道黏膜和脂肪組織等外周組織中富集，尤其在腸道中非常豐富［13］。它們不受主要組織相容性復(fù)合體限制，具有先天免疫細(xì)胞的多種特性，在先天和免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用［14］。γδT 細(xì)胞不僅對感染或炎癥反應(yīng)迅速，還能促進(jìn)干擾素-γ、IL-17A 和IL-23 的分泌，這可能會(huì)嚴(yán)重影響中樞神經(jīng)疾病的預(yù)后［15］。短鏈脂肪酸具有較為豐富的生物學(xué)作用，可參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)免疫細(xì)胞分化成熟［16-17］。因此，深入研究短鏈脂肪酸作用于γδT 細(xì)胞的分子機(jī)制，可為這些小分子代謝物用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的依據(jù)。本研究采用短鏈脂肪酸對γδT 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，以探索短鏈脂肪酸對γδT 細(xì)胞的影響。本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的短鏈脂肪酸對γδT 細(xì)胞沒有毒性作用，并且可以影響到γδT 細(xì)胞IL-17A 和NF-κB 信號通路的表達(dá)。這些研究結(jié)果均提示短鏈脂肪酸能通過抑制γδT 細(xì)胞來抑制炎癥反應(yīng)。

炎癥的發(fā)生、發(fā)展和終止需要基因激活、表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄翻譯和翻譯后調(diào)控，所有這些都受到不同酶的嚴(yán)格調(diào)控［18］。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase， HDACs）可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，直接影響炎癥的過程［19］。短鏈脂肪酸是HDACs 的天然抑制劑［20］。本研究發(fā)現(xiàn)使用一定濃度的短鏈脂肪酸處理γδT 細(xì)胞后，丙酸、丁酸及混合的短鏈脂肪酸顯著抑制γδT 細(xì)胞中IL-17A的表達(dá)。在使用泛HDAC 抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）干預(yù)γδT 細(xì)胞后，其分泌的IL-17A 同樣得到明顯的抑制。然而，當(dāng)把短鏈脂肪酸和TSA 混合起來干預(yù)γδT 細(xì)胞，其抑制γδT 細(xì)胞分泌的IL-17A與兩者分別干預(yù)后的無明顯差異。因而，推斷短鏈脂肪酸可能是通過抑制HDAC 來起到抑制γδT 來分泌IL-17A 的。

轉(zhuǎn)錄因子NF-кB 在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)中的作用是基礎(chǔ)性的。它上調(diào)特定基因，包括細(xì)胞因子、趨化因子、主要組織相容性復(fù)合體以及免疫細(xì)胞黏附和遷移所需的受體，以及細(xì)胞增殖和凋亡［21-22］。IL-17 是機(jī)體重要的炎癥因子，它通過誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子，招募中性粒細(xì)胞，激活T 細(xì)胞和B 細(xì)胞，在各種炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用［23-24］。IL-17R可識別IL-17 并介導(dǎo)NF-κB 信號通路的激活，誘導(dǎo)p65 表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)IL-17 自分泌［25］。IL-17 可以與其他細(xì)胞因子（如TNF-α）相互作用以激活NF-κB并促進(jìn)和延長炎癥反應(yīng)［26］。而阻斷IL-17 可有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的肺組織中NF-κB 的表達(dá)和激活，并抑制NF-κB 的核轉(zhuǎn)位［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸可抑制IL-17A、IKK 的表達(dá)以及NF-κB 磷酸化水平，這提示短鏈脂肪酸可能通過阻礙γδT 細(xì)胞的IL-17A 和NF-κB 信號通路，進(jìn)而減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，短鏈脂肪酸可抑制γδT 細(xì)胞IL-17A和NF-κB 的激活，從而減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是短鏈脂肪酸通過調(diào)控HDAC 來實(shí)現(xiàn)的。本研究通過初步證實(shí)了短鏈脂肪酸可抑制γδT 細(xì)胞減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并探究了其可能的分子機(jī)制，為這些小分子代謝物用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。但該研究尚有不足之處，目前只在從流式實(shí)驗(yàn)中推斷短鏈脂肪酸可能是通過HDAC 影響到γδT 來分泌IL-17A 的。然而，短鏈脂肪酸怎樣通過HDAC 影響到γδT 細(xì)胞，以及到底抑制了HDAC 的哪個(gè)亞型來發(fā)揮作用，后續(xù)本課題組還將繼續(xù)對其作用機(jī)制進(jìn)行深入探討并加以驗(yàn)證。

【Author contributions】LIU Pan performed the experimental research and wrote the article. XI Deshuang analyzed the experimental data. HUANG Rui， TENG Yilin and LIU Rui collectedand organized the literature. ZONG Shaohui and ZENG Gaofeng formulated the article ideas and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.