許文琳 姜 碩 譚曉嬋 孫丹紅 潘旭初 王 紅 王 聰

失眠屬睡眠障礙范疇，發(fā)病率逐年上升，我國成年人失眠發(fā)病率約為19.6%[1]。長期失眠會導(dǎo)致代謝性疾病的發(fā)生，如肥胖癥、血脂異常、2 型糖尿病、高血壓等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，青少年總睡眠時間減少與超重或肥胖具有顯著相關(guān)性[3]。研究顯示，睡眠不足可導(dǎo)致包括胰島素敏感性降低、葡萄糖耐量降低、夜間皮質(zhì)醇濃度升高、胃生長激素釋放激素升高、瘦素水平降低在內(nèi)的眾多內(nèi)分泌失調(diào)性疾病[4]。肝臟主要參與脂肪、糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝，對維持機(jī)體代謝至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪（sleep deprivation）可上調(diào)肝臟脂肪生成酶從而誘導(dǎo)脂肪變性和胰島素抵抗[5]。睡眠剝奪可引起模型小鼠肝臟中谷胱甘肽代謝、果糖和甘露糖以及丙酮酸代謝紊亂[6]。但睡眠對肝臟代謝影響的核心基因及關(guān)鍵通路仍未知曉。本研究基于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（gene expre-ssion omnibus，GEO），對睡眠剝奪條件下模型小鼠肝臟組織進(jìn)行基因及通路篩選，探討失眠對肝臟代謝影響的生物學(xué)機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)的獲取 本研究以GEO 數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)源，設(shè)定“sleep deprivation”為搜索詞，獲取GSE92913 數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集基于GPL16570 平臺（Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array）。將原始資料分為睡眠剝奪組及對照組，利用高通量測序檢測兩組小鼠肝臟中的基因表達(dá)水平。

1.2 差異基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選 下載GSE92913 數(shù)據(jù)集，使用R 語言對芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行探針轉(zhuǎn)化，剔除無對應(yīng)基因及重復(fù)探針數(shù)據(jù)。采用GEO 數(shù)據(jù)庫自帶的在線分析工具GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）進(jìn) 行DEGs 分析，設(shè)置篩選條件為：調(diào)整P 值（adj.P）＜0.05且|log2FC|≥1（FC 為fold change，差異倍數(shù)）。

1.3 DEGs 的功能富集分析 DAVID 平臺數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）提供大量基因、蛋白的生物功能信息，是進(jìn)行功能富集分析的常用數(shù)據(jù)庫。將DEGs 上傳到DAVID 平臺，設(shè)置物種為“Mus musculus（小鼠）”，選擇生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF） 進(jìn) 行 基 因 本 體（gene ontology，GO）富集分析；選擇Pathways 進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。設(shè)置設(shè)定篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，使用R 語言（ggplot2 包）將結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein Interaction，PPI）和樞紐基因的構(gòu)建 將DEGs 上傳至STRING 平臺（https://www.string-db.org/），設(shè)置生物種類“Mus musculus”，最小相互作用閾值設(shè)定成“最高置信度（highest confidence）”為0.4，構(gòu)建PPI，預(yù)測差異表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用。導(dǎo)出TSV 格式資料，將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.2 軟件中，運(yùn)用cytohubba插件進(jìn)一步分析，采用degree 算法選擇出排名前10的樞紐基因。

2 結(jié) 果

2.1 睡眠剝奪組與對照組DEGs 的篩選 GSE92913數(shù)據(jù)集共包含睡眠剝奪組樣本7 個和正常對照組樣本7 個，正常對照組樣品編號分別為GSM2440309、GSM2440312、GSM2440313、GSM2440314、GSM24403 16、GSM2440317、GSM2440319，睡眠剝奪組樣品編號分別為GSM2440306、GSM2440307、GSM2440308、GSM2440310、GSM2440311、GSM2440315、GSM24403 18。根據(jù)上述條件進(jìn)行篩選，共有54 個DEGs 發(fā)生變化，基因上調(diào)的有34 個，下調(diào)的有20 個，見圖1。利用R 語言（pheatmap 包）對54 個DEGs 進(jìn)行層次聚類分析，并繪制基因熱圖，見圖2。

圖1 睡眠剝奪小鼠肝臟差異基因火山圖

圖2 睡眠剝奪小鼠肝臟差異基因熱圖

2.2 DEGs 的GO 功能和KEGG 代謝通路富集分析將54 個DEGs 導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，共得到54 條GO 條目，按照P＜0.05 的顯著性富集篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到36 條顯著意義的條目，其中21 條（58.33%）聚集在BP，包括脂質(zhì)代謝、類固醇代謝、三酰甘油合成正調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）信號通路等眾多生物學(xué)過程；共有6 條（16.67%）聚集在CC，包括細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合的細(xì)胞器、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等多種復(fù)雜細(xì)胞組分；9 條（25.0%）聚集在MF，包括氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合、跨膜信號受體活性等，見表1。KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因參與氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信號通路、類固醇激素生物合成、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、視黃醇新陳代謝4 條信號通路，見表2。

表1 睡眠剝奪小鼠肝臟DEGs 的GO 富集分析

表2 睡眠剝奪小鼠肝臟DEGs 的KEGG 富集分析

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和樞紐基因篩選結(jié)果 將DEGs上傳至STRING 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape3.8.2 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，運(yùn)用cytohubba 插件進(jìn)一步分析，cytohubba 算法顯示PPARγ、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1（sterol regulatory bind factors1，SREBF1）、成纖維細(xì)胞生長因子21（fibroblast growth factors21，F(xiàn)GF21）、花生四烯酸細(xì)胞色素P450ω 羥化酶（arachidonic acid cytochrome P450 ω hydroxylase14，Cyp4a14）、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)DFFA 樣效應(yīng)蛋白C（cell death induced DFFA-like effector protein C，Cidec）、芳基烴受體核轉(zhuǎn)位因子樣蛋白1（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocation factor -like protein 1，Arntl）、磷脂酸磷脂酶1（phosphatidic acid phospholipase 1，Lpin1）、細(xì) 胞 色 素 酶2b10（cytochrome，Cyp2b10）、胰島素誘導(dǎo)基因2（insulin induced genes 2，Insig2）、脂滴包被蛋白5（perilipin5，Plin5）為睡眠剝奪所涉及的關(guān)鍵基因，見圖3。

圖3 睡眠剝奪小鼠肝臟差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

失眠為臨床常見病、多發(fā)病，我國失眠患病率遠(yuǎn)高于世界水平并呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[7]。失眠與代謝關(guān)系密切，而肝臟主要參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝過程，因此睡眠與肝臟功能密不可分。本研究基于GEO 數(shù)據(jù)庫通過對微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，識別出睡眠剝奪組和正常睡眠組之間的差異基因，并通過進(jìn)行GO、KEGG 富集分析、PPI 和樞紐基因篩選，揭示DEGs 的功能，以探究失眠的發(fā)病機(jī)制與肝臟代謝的關(guān)系。

運(yùn)用KEGG 通路分析得出影響失眠發(fā)病的信號通路為PPAR 信號通路。PPAR 信號通路屬于核受體超家族，在抑制神經(jīng)炎癥、延緩神經(jīng)退行性變、抗氧化過程中均發(fā)揮著重要作用[8-9]。有研究[10]表明，通過激活PPAR 信號通路可極化M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞，改善中樞神經(jīng)功能。有研究[11]顯示，中藥天王補(bǔ)心丹的有效成分可通過特定位點(diǎn)與PPAR 信號通路中特定的蛋白靶點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)能量代謝而發(fā)揮睡眠調(diào)節(jié)作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)類固醇激素生物合成通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路和視黃醇新陳代謝通路也參與了睡眠剝奪下的肝臟代謝途徑，這些通路均與肝臟物質(zhì)代謝有關(guān)。

本研究中PPI 和樞紐基因篩選結(jié)果提示，PPARγ為睡眠剝奪過程中參與肝臟代謝的關(guān)鍵基因。PPARγ功能主要涉及誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化、維持脂代謝穩(wěn)態(tài)[12]。此外PPARγ 還具有維持糖代謝平衡的功能，進(jìn)而能夠改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，PPARγ 通過直接調(diào)控攜帶有PPREs 的糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)脂肪細(xì)胞分泌因子，下調(diào)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和Resistin 等的表達(dá)來提高胰島素敏感性。PPARγ 還可以通過促進(jìn)肌肉中葡萄糖的利用，并減少肝臟中葡萄糖的生成達(dá)到控制糖代謝的作用[13]。PPARγ 亦有神經(jīng)保護(hù)功能，有研究顯示可通過促進(jìn)PPARγ 的核轉(zhuǎn)位并激活PPARγ來緩解神經(jīng)損害[14]。PPARγ 也能夠調(diào)節(jié)睡眠-覺醒過程，在嚙齒類動物下丘腦注射PPARγ 激動劑可減少慢波睡眠并提高覺醒量，而PPARγ 拮抗劑則產(chǎn)生相反效果，在小鼠模型中也可以觀察到類似結(jié)果[15]?？梢奝PARγ 為影響睡眠與肝臟代謝的關(guān)鍵基因。

SREBF1 基因也是睡眠剝奪過程中肝臟代謝所涉及的關(guān)鍵基因。SREB1 屬于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBPs 的主要編碼基因，可以啟動脂質(zhì)生物合成和攝取，并且在肝臟脂質(zhì)合成中起作用，其表達(dá)失常與胰島素抵抗、肥胖癥、糖尿病、脂肪肝等肝臟代謝性疾病關(guān)系密切[16-17]。在限制飲食所造成的睡眠-覺醒晝夜節(jié)律紊亂動物模型中發(fā)現(xiàn)，由SREBF1 基因調(diào)控的SREBPs蛋白表達(dá)失常會造成睡眠-覺醒晝夜節(jié)律紊亂[18]?；谌梭w的研究發(fā)現(xiàn)，在睡眠剝奪受試者中SREBF1 基因表達(dá)水平明顯下降，而這種下降程度與睡眠剝奪敏感程度相關(guān)[19]。在睡眠剝奪人群中，SREBF1 基因表達(dá)的晝夜節(jié)律性明顯失調(diào)[20]。這些結(jié)果均提示SREBF1 基因?yàn)檫B接睡眠與肝臟代謝的重要基因。

FGF21 是肝細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以作為機(jī)體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)劑，對機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)和葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有多效調(diào)節(jié)作用[21]。FGF21 可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生抗應(yīng)激劑或酮體來影響睡眠-覺醒，導(dǎo)致機(jī)體對社會壓力的恢復(fù)[22]。臨床研究顯示，健康成年人急性睡眠不足導(dǎo)致FGF21 節(jié)律性水平升高[23]。LPIN1 也是睡眠剝奪所涉及的關(guān)鍵基因，在脂質(zhì)合成中起關(guān)鍵作用，同時作為轉(zhuǎn)錄輔助活化因子對脂質(zhì)代謝過程起效[24]。部分LPIN1 突變患者表現(xiàn)為脂代謝紊亂、體脂含量異常，在脂肪組織和骨骼肌組織中表現(xiàn)尤為明顯[25]。在一項(xiàng)機(jī)制研究[26]中發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪引起的肝臟脂肪變性和肝臟胰島素抵抗是通過上調(diào)LPIN1 等脂肪生成酶介導(dǎo)的，足見其與失眠關(guān)系緊密。此外，Cyp4a14、Cidec、Arntl、Cyp2b10、Insig2、Plin5 基因也是睡眠剝奪影響肝臟代謝的關(guān)鍵基因。

因此，睡眠剝奪影響機(jī)體肝臟代謝的諸多過程，涉及眾多信號通路，此過程可能與神經(jīng)炎癥、抗氧化、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、視黃醇新陳代新等生物途徑密切相關(guān)。此外，本研究通過分析預(yù)測了睡眠剝奪相關(guān)疾病影響代謝的可能機(jī)制并篩選出參與其中的核心基因，提示PPARγ、SREBF1、FGF21、Insig2、Plin5 等基因表達(dá)失調(diào)與此過程緊密相關(guān)，這可能為治療睡眠類和代謝失調(diào)性疾病提供分子靶標(biāo)和診斷標(biāo)志物，為失眠等睡眠障礙的基礎(chǔ)研究與臨床診治提供新的思路。本研究具有一定的局限性，本研究完全基于GEO 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，篩選出的核心基因仍需后期進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。