潘 峰

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是位于直腸至結(jié)腸黏膜及黏膜下層的慢性非特異性炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉和黏液膿血便反復(fù)發(fā)作[1]。常見(jiàn)病因包括腸道通透性改變、腸道菌群失調(diào)、黏膜免疫應(yīng)答、心理因素以及腸神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能異常[2]。目前，臨床尚無(wú)根治性治療手段，治療難度大，并且需要長(zhǎng)期維持治療，有進(jìn)展為結(jié)腸癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。根據(jù)UC 的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“泄瀉”“痢疾”范疇[4]。脾虛、濕熱內(nèi)蘊(yùn)是UC 活動(dòng)期的的核心病機(jī)，治療以清熱解毒、健脾化濕、斂瘡生肌為大法[5]。白及苦、甘、澀，微寒，歸肺、肝、胃經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌的作用，可用于治療瘡瘍腫毒、潰瘍病出血。藥理學(xué)研究[6]發(fā)現(xiàn)，白及及其有效成分具有抗菌、抗腫瘤、止血、抗?jié)?、促進(jìn)傷口愈合等作用。國(guó)醫(yī)大師朱良春提出辨證加用白及或單用白及粉可廣泛用于治療UC、腸潰瘍等病。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)白及治療UC 的潛在作用機(jī)制進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 白及活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選 將“白及”作為關(guān)鍵詞在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）平臺(tái)中進(jìn)行檢索，并設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選出白及的有效活性成分，利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取有效成分的SDF 文件，將篩選出的有效成分利用SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，設(shè)置概率（probability）＞0.1，最后利用Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.prg）將所得到的靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 UC 靶點(diǎn)的獲取 將“Ulcerative Colitis”作為關(guān)鍵詞，在Genecards、OMIM 和Disgenet 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，并將得到的靶點(diǎn)去重后進(jìn)行匯總。利用R 語(yǔ)言軟件繪制白及有效活性成分作用靶點(diǎn)和UC 疾病相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖。

1.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Uniport 網(wǎng)站將白及的有效藥物成分及對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為Gene Symbol，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件繪制“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件中的Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)度（degree）值高低將各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，篩選出關(guān)鍵成分。

1.3.1 靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將白及和UC 交集的靶基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種限定為“人類（homo sapiens）”，最低交互置信度設(shè)置為“高置信度（high confidence）0.9，獲取相關(guān)數(shù)據(jù)并導(dǎo)出，再進(jìn)一步導(dǎo)入Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化，應(yīng)用Cytoscape 軟件中Cytohubber 插件的degree 功能篩選出排名前15 的Hub 基因。

1.3.2 基因本體（gene onto-logy，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用Metscape 對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，導(dǎo)出分析數(shù)據(jù)結(jié)果，再利用R4.2.0 軟件中對(duì)應(yīng)的包對(duì)富集分析進(jìn)行可視化處理。

1.3.3 分子對(duì)接 根據(jù)繪制的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)圖篩選出degree 值排名前10的核心靶點(diǎn)和排名前5 的關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接。通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，利用Pymol 軟件和AutoDockTools1.5.7 軟件對(duì)蛋白和有效成分的3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、去除原有配體、加氫以及計(jì)算結(jié)合能等處理，最后將處理后的結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 白及活性成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 設(shè)定OB≥30%，DL≥0.18，白及活性成分共9 個(gè)，見(jiàn)表1。將有效成分導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索其作用靶點(diǎn)，得到Probability＞0.1 的靶點(diǎn)蛋白277 個(gè)。

表1 白及高活性的9 種化合物

2.2 UC 靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過(guò)檢索Genecards、OMIM和Disgenet 三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，并將所獲取的靶點(diǎn)去重后得到UC 相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白共1159 個(gè)。利用R 語(yǔ)言軟件繪制藥物和疾病相關(guān)靶點(diǎn)交集圖，得到交集基因68 個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 白及有效活性成分和潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖

2.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”可視化結(jié)果“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。經(jīng)計(jì)算后得到degree值排名前5 的活性成分分別是1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對(duì)羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對(duì)羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇。

圖2 白及治療潰瘍性結(jié)腸炎潛在活性成分及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出白及治療UC 排名前15 的Hub 基因，如圖3 所示，顏色越深代表degree 值越大，degree 值排名前10 的基因分 別 為：CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC、PTGS2、MCL1、IGF1R。

圖3 白及治療潰瘍性結(jié)腸炎的Hub 基因篩選圖

2.5 GO 和KEGG 分析結(jié)果 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析后，結(jié)果獲得生物過(guò)程（biological process，BP）297 條、細(xì)胞組分（cellular component，CC）58 條、分子功能（molecular function，MF）62 條。將各自結(jié)果根據(jù)P 值由小到大排序后選取前10 條進(jìn)行可視化分析，如圖4 所示。由圖可知，BP 主要涉及信號(hào)傳導(dǎo)（signal translation）、肽基-酪氨酸磷酸化（peptidyl-tyrosine phosphorylation）、蛋白磷酸化（protein phosphorylation）等過(guò)程。CC 可能主要與質(zhì)膜（plasma membrane）、胞漿（cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）有關(guān)。MF 可能主要涉及蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、ATP結(jié)合（ATP binding）等功能。KEGG 通路富集分析結(jié)果共獲得143 條相關(guān)作用通路，按照P 值從小到大選取前20 條通路進(jìn)行可視化分析，結(jié)果顯示白及治療UC 的靶點(diǎn)基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺腫瘤、Rap1、MAPK 等信號(hào)通路，見(jiàn)圖5。

圖4 白及治療潰瘍性結(jié)腸炎的GO 功能富集分析

圖5 白及治療潰瘍性結(jié)腸炎的KEGG 通路富集分析

2.6 分子對(duì)接結(jié)果 為進(jìn)一步明確白及治療UC 潛在活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白之間的分子結(jié)合能力，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，選取degree 值排名前5 的活性成分1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對(duì)羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對(duì)羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇與degree 值排名前10 的核心靶點(diǎn)CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC、PTGS2、MCL1、IGF1R 進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果詳見(jiàn)表2。自由結(jié)合能越小說(shuō)明分子與蛋白之間對(duì)接越好，結(jié)合能＜-5 kcal/mol 說(shuō)明有效成分和靶點(diǎn)之間結(jié)合活性強(qiáng)。白及活性成分與UC 核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能基本＜-5 kcal/mol，其中有20 個(gè)結(jié)合能＜-7 kcal/mol，由此可見(jiàn)白及的潛在有效成分與UC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)之間關(guān)聯(lián)性很強(qiáng)，這些成分與靶點(diǎn)很有可能是白及治療UC 的物質(zhì)基礎(chǔ)與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。使用PyMOL 軟件對(duì)白及治療UC 中結(jié)合能最強(qiáng)的活性成分和靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化（MOL005773-HRAS、MOL0057 73-SRC、MOL005768-SRC、MOL005756-SRC），見(jiàn)圖6。菲螺醇與HRAS 的ASP-119、LYS-117、SER-145、LYS-147、ALA-146 殘基各形成1 個(gè)氫鍵，與SER-17 殘基形成2 個(gè)氫鍵，氫鍵的長(zhǎng)度分別為1.8、2.2、1.9、2.2、2.4、1.9、2.3 nm。菲螺醇與SRC 的ARG-293、ARG-296、ASP-224、ARG-296 殘基各形成1 個(gè)氫鍵，與ARG-217 殘基形成2 個(gè)氫鍵，氫鍵長(zhǎng)度分別為2.1、2.5、1.9、2.8、2.0、2.5 nm。4，7-二羥基-1-對(duì)羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲與SRC 的ASN-292殘基形成2 個(gè)氫鍵，與HIS-163、CLN-192 殘基形成各3 個(gè)氫鍵，氫鍵的長(zhǎng)度分別為2.8、1.9、2.1、1.9、1.8、1.6、1.9、2.8 nm。2，3，4，7-四甲基菲與SRC 的HIS-163 形成3 個(gè)氫鍵，與ARG-296 殘基形成4 個(gè)氫鍵，氫鍵的長(zhǎng)度分別為1.9、2.1、2.1、1.9、2.2、2.8、2.3 nm。

圖6 白及主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接圖

表2 白及活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能（kcal/mol）

3 討 論

隨著生活水平的提高，UC 近年發(fā)病率不斷攀升，UC 長(zhǎng)期遷延難愈，導(dǎo)致患者消化能力逐步下降、腸道吸收功能不良，進(jìn)而出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良、免疫功能失調(diào)等并發(fā)癥，臨床治療頗為棘手[7]。治療UC 的關(guān)鍵是抑制腸道炎癥活動(dòng)，目前臨床上包括免疫抑制劑、抗腫瘤壞死因子-α、單克隆抗體在內(nèi)的治療手段大多都存在價(jià)格昂貴、療程長(zhǎng)、副作用多以及復(fù)發(fā)率高等問(wèn)題[8]。中醫(yī)藥在治療UC 方面具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，并且不良反應(yīng)少、患者可接受度高[9-10]。謝晶日教授在治療UC 方面主張?jiān)谛袣饣钛幕A(chǔ)上加用白及、白蘞斂瘡生肌，以達(dá)祛瘀生新的效果[11]。徐喆等[12]通過(guò)對(duì)國(guó)家專利數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)治療UC 的高頻藥物共49 味，其中白及排名第5，在多種治療UC 的中藥復(fù)方中被頻繁使用。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究白及治療UC 的作用機(jī)制，提示中藥白及可以通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療UC 的作用，其中主要的活性成分包括1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對(duì)羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對(duì)羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇，后四種活性物質(zhì)都屬于菲類化合物，其中二氫菲類化合物是白及塊莖中含量最多的化合物，也是白及中的主要活性成分[13]，具有抗炎、抗癌等藥理作用[14]。俞蘇杭等[15]研究證實(shí)白及中的菲類化合物大多對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌以及枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有中等強(qiáng)度的抗菌作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)互作分析結(jié)果提示，白及可能通過(guò)作用于CCND1、ESR1、EGFR、HRAS、HSP90AA1、ERBB2、SRC 等核心靶點(diǎn)來(lái)治療UC。細(xì)胞周期蛋白（cyclin D1，CCDND1）作為重要調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控細(xì)胞周期，通過(guò)使周期抑制蛋白失活促進(jìn)細(xì)胞由C1 向S 期轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，以此加速組織的修復(fù)促進(jìn)創(chuàng)面愈合[16-17]。雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）是一種參與多種細(xì)胞信號(hào)傳遞的轉(zhuǎn)錄因子，具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的功能[18]，可以改變組織細(xì)胞的增殖和分化，減輕疼痛的傳導(dǎo)[19]。表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGFR）是跨膜酪氨酸激酶受體表皮受體家族的成員，可以介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、生長(zhǎng)和遷移，組織損傷時(shí)刺激EGFR 表達(dá)上調(diào)，EGFR 激活后可以減輕早期腸道炎癥，促進(jìn)結(jié)直腸傷口的愈合[20]。HRAS 屬于Ras 家族中的一員，是細(xì)胞外向細(xì)胞核傳遞生長(zhǎng)信號(hào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，激活Ras可以上調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化[21]。HSP90AA1 可特異性激活細(xì)胞毒T 細(xì)胞，HSP90AA1 表達(dá)與白介素6（IL-6）表達(dá)成正相關(guān)，通過(guò)抑制HSP90AA1 可以抑制細(xì)胞免疫并減少炎癥因子的分泌[22]。ERBB2 編碼HER-2，HER-2 在免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)中起著重要作用，HER-2 與酪氨酸激酶結(jié)合后可通過(guò)激活PI3KAkt 通路和MAPK 通路改善炎癥反應(yīng)[23]。SRC 蛋白具有酪氨酸蛋白激酶活性，參與細(xì)胞內(nèi)外重要信號(hào)的傳遞，參與生物活動(dòng)的周期轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞粘附、免疫反應(yīng)、細(xì)胞周期等過(guò)程的調(diào)控，抑制SRC 磷酸化可以抑制缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[24]，并且SRC-3 具有促進(jìn)腸道黏液分泌的功能，可以保護(hù)腸道免受腸腔內(nèi)細(xì)菌的侵襲、抑制毒素的擴(kuò)散[25]。綜上所述，白及可能通過(guò)調(diào)節(jié)上述靶點(diǎn)蛋白的功能，減輕腸道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制細(xì)菌侵襲、促進(jìn)潰瘍愈合進(jìn)而達(dá)到治療UC 的目的。

GO 功能富集分析結(jié)果提示，白及治療UC 的機(jī)制可能與促進(jìn)質(zhì)膜、胞漿、細(xì)胞質(zhì)的生成，正向調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基-酪氨酸磷酸化、蛋白磷酸化等生物過(guò)程，促進(jìn)蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP 能量結(jié)合等功能相關(guān)。KEGG 通路富集分析結(jié)果提示PI3K-Akt、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺腫瘤、Rap1、MAPK 等信號(hào)通路與白及治療UC密切相關(guān)。PI3K/Akt/核因子κB（NF-κB）與UC 進(jìn)展關(guān)系密切[26]，抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路可以改善小鼠的UC[27]。線粒體動(dòng)力學(xué)失衡誘發(fā)的能量代謝障礙是UC 的核心病理過(guò)程，PI3K/Akt 通路可以促進(jìn)下游抗氧化系統(tǒng)表達(dá)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），加速氧自由基的清除，促進(jìn)細(xì)胞能量代謝恢復(fù)[28]。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是細(xì)胞內(nèi)多種生理活動(dòng)和新陳代謝調(diào)節(jié)的重要信號(hào)分子，PKA-Rap1 及Epac1/Rap1 信號(hào)通路均可介導(dǎo)cAMP 信號(hào)的調(diào)節(jié)，通過(guò)下調(diào)Rap1 可以減輕氧化應(yīng)激損傷[29]。MAPK 信號(hào)通路與結(jié)腸炎癥反應(yīng)相關(guān)，EPK、p38 是MAPK 家族的成員，調(diào)節(jié)EPK MAPK 通路，可以促進(jìn)潰瘍的愈合[30]，抑制結(jié)腸組織中的p38 MAPK，可以減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)以及創(chuàng)口愈合[31]。

氫鍵長(zhǎng)度不超過(guò)3.5 nm 提示對(duì)接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[32]。本研究分子對(duì)接結(jié)果中，白及中的菲螺醇與靶點(diǎn)SRC 之間的結(jié)合活性最強(qiáng)（-11.15 kcal/mol），菲螺醇與SRC 殘基共形成6 個(gè)氫鍵，最短的氫鍵長(zhǎng)度為1.9 nm，最長(zhǎng)的氫鍵長(zhǎng)度為2.8 nm，均小于3.5 nm，由此可見(jiàn)，白及中的活性成分與潛在核心靶點(diǎn)蛋白之間能形成穩(wěn)定的相互作用的氫鍵，白及可以有效發(fā)揮治療UC 的作用。

綜上，本研究提示白及可能通過(guò)1-4 叔丁基芐基哌嗪、2，3，4，7-四甲基菲、3-對(duì)羥基芐基-4-甲氧基-9，10-二氫菲、4，7-二羥基-1-對(duì)羥基芐基-2-甲氧基-9，10-二氫菲、菲螺醇等關(guān)鍵成分，作用于CCND1、ESR1、EGFR 等核心靶點(diǎn)，通過(guò)抑制腸道炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)腸道免疫功能、促進(jìn)腸道黏液分泌以及加速腸道潰瘍愈合等功能，實(shí)現(xiàn)治療UC 的藥理作用。本項(xiàng)研究結(jié)果為臨床使用白及治療UC 提供了理論基礎(chǔ)，后期可進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)該機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。