施 佳 王天香 耿艷華 梁木鳳 王 新

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種傳染病，根據(jù)《2022 年全球結(jié)核病報告》，2021 年有1060萬人患結(jié)核病，并且有160 萬人死于結(jié)核病[1]。研究[2]表明，肺結(jié)核與癌癥風(fēng)險增加有關(guān)，其中與肺癌相關(guān)性最高。近年來，腫瘤的免疫治療獲得了廣泛研究，其中相關(guān)靶點程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）、程序性死亡配體1（PD-L1）和細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）的免疫檢查點抑制劑已經(jīng)成為肺癌的一線治療用藥，并且為患者提供了生存益處[3-4]。研究[5-6]表明，結(jié)核感染和肺癌均可發(fā)生T 細胞相關(guān)的免疫逃逸，使共抑制分子的表達增加。因此，本研究探討肺癌合并肺結(jié)核患者病變組織中CTLA-4、PDL1 的表達與臨床病理特征的關(guān)系，旨在進一步探索結(jié)核感染與肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集杭州市紅十字會醫(yī)院2013—2022 年胸外科及結(jié)核外科收治的96 例患者為研究對象，其中肺癌合并肺結(jié)核患者38 例（肺癌合并肺結(jié)核組）、單純肺結(jié)核患者29 例（肺結(jié)核組）、單純肺癌患者29 例（肺癌組）。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核通過，批準編號：【2022】研審第（79）號。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）所有患者均經(jīng)臨床、影像學(xué)檢查及病理診斷證實[7-8]，肺癌合并肺結(jié)核組需患者肺結(jié)核及肺癌病灶位于同一側(cè)肺；（2）首次接受手術(shù)治療者；（3）臨床資料完整。排除標準：（1）術(shù)前接受抗腫瘤治療者；（2）伴其他部位原發(fā)性腫瘤者；（3）合并自身免疫性疾病的患者。

1.3 免疫組織化學(xué)實驗 分別取肺結(jié)核組患者的結(jié)核病灶組織及肺癌組和肺癌合并肺結(jié)核組患者的肺癌病灶組織作為研究標本，經(jīng)10%中性甲醛固定，按常規(guī)標準石蠟包埋、制片，并進行蘇木精伊紅染色（HE）和免疫組化染色。免疫組化實驗片經(jīng)過烤片、脫蠟、3%雙氧水封閉、乙二胺四乙酸（EDTA）高壓修復(fù)20 min 后，按照SP 法二抗試劑盒進行孵育，二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精襯染，DM1000 光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）下觀測CTLA-4、PD-L1 的蛋白表達。濃縮型兔抗人CTLA-4 抗體（一抗，工作濃度：1∶500，批號1005930-6）購自英國Abcam 公司；PDL1（批號220507C02X）購自廈門艾德生物公司；羊抗兔/小鼠IgG 聚合物（二抗，批號22011）購自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司；抗體稀釋劑（批號23081401）、DAB 顯色劑（批號221101）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判讀[9]CTLA-4 和PD-L1 定位于細胞膜，出現(xiàn)完整的棕黃色膜染色判定為陽性細胞。隨機選取5 個高倍鏡視野，按陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比計分：＜3%為0 分；3%～9%為1 分；10%～24%為2分，≥25%為3 分。陽性細胞著色程度計分：陰性為0分，弱陽性為1 分，中等陽性為2 分，強陽性為3 分。將上述兩項評分的乘積作為最終結(jié)果：0～2 分為陰性表達，3～9 分為陽性表達。本實驗經(jīng)由兩名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生獨立閱片并進行判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用t 檢驗或非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。兩組間相關(guān)性分析，符合正態(tài)分布者，使用Spearman 相關(guān)性分析，不符合正態(tài)分布者使用Kendall's tau-b 等級相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組患者一般資料比較 96 例患者中男48例，女48 例，年齡18～84（52.54±15.70）歲，中位年齡55.5 歲。肺癌合并肺結(jié)核組38 例，其中男21 例，女17 例，年齡24～74（57.84±11.41）歲；肺結(jié)核組29 例，其中男18 例，女11 例，年齡18～46（37.76±2.13）歲；肺癌組29 例，其中男10 例，女19 例，年齡32～84（60.38±2.65）歲，三組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。肺癌合并肺結(jié)核組鱗癌11 例，腺癌27 例[8]；腫瘤分化程度高分化11 例，中+低分化27 例[8]；腫瘤最大徑（2.67±1.66）cm，≥2.7 cm 16 例，＜2.7 cm 22 例；TNM 分期[8]Ⅰ期25 例，Ⅱ～Ⅲ期13例。肺癌組鱗癌4 例，腺癌25 例；腫瘤分化程度高分化11 例，中+低分化18 例；腫瘤最大徑（1.85±0.20）cm，≥1.85 cm 10 例，＜1.85 cm 19 例；TNM 分期Ⅰ期26例，Ⅱ期3 例。

2.2 三組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 陽性表達率比較 免疫組化結(jié)果顯示，CTLA-4 表達于肺癌及肺結(jié)核病灶的淋巴細胞，PD-L1 表達于肺結(jié)核病灶的間質(zhì)巨噬細胞及肺癌病灶的腫瘤細胞及間質(zhì)巨噬細胞。CTLA-4 在肺癌合并肺結(jié)核組、肺結(jié)核組、肺癌組患者病變組織淋巴細胞中的陽性表達率分別為65.79%、24.14%、20.70%，肺癌合并肺結(jié)核組的陽性表達率高于其余兩組，差異均具統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。PD-L1 在肺癌組、肺癌合并肺結(jié)核組患者的腫瘤細胞中陽性表達率分別為6.90%、10.53%，兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。PD-L1 在肺結(jié)核組、肺癌組、肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織間質(zhì)巨噬細胞中的陽性表達率分別為48.28%、31.03%、39.47%，肺癌合并肺結(jié)核組與其他兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖1、表1。

表1 肺結(jié)核組、肺癌組、肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 陽性表達率比較[例（%）]

圖1 肺結(jié)核組、肺癌組、肺癌合并肺結(jié)核組CTLA-4、PD-L1 的表達情況及肺癌合并肺結(jié)核組病變組織HE 染色情況

2.3 肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達情況與臨床病理特征的關(guān)系 CTLA-4陽性表達率在鱗癌、低+中分化癌、腫瘤最大徑≥2.7 cm 的病例中顯著高于腺癌、高分化癌、腫瘤最大徑＜2.7 cm 的病例（均P＜0.05）；CTLA-4 陽性表達率與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期無關(guān)（均P＞0.05）。腫瘤細胞的PD-L1 陽性表達率在TNM 分期Ⅱ～Ⅲ期的病例中高于TNM 分期Ⅰ期的病例（P＜0.05），與其他特征無關(guān)（均P＞0.05）。間質(zhì)中的PDL1 陽性表達率在不同的臨床病理特征中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達情況與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.4 肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達與臨床病理特征的相關(guān)性 CTLA-4 表達與腫瘤類型具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.460，P＜0.05；與腫瘤分化程度和腫瘤大小相關(guān)系數(shù)分別為0.268、0.395，無明顯相關(guān)性（P 均＞0.05）。腫瘤細胞中PD-L1 表達與腫瘤分期無相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.105，P＞0.05。見表3。

表3 肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1表達與臨床病理特征的相關(guān)性

2.5 肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4、PD-L1 表達的相關(guān)性 肺癌合并肺結(jié)核組患者腫瘤細胞中PD-L1 表達與淋巴細胞中CTLA-4 表達之間的相關(guān)系數(shù)為0.067，間質(zhì)巨噬細胞中PD-L1 表達與淋巴細胞中CTLA-4 表達之間的相關(guān)系數(shù)為0.128，均無顯著相關(guān)性（P 均＞0.05）。見表4。

表4 肺癌合并肺結(jié)核組患者病變組織中CTLA-4與腫瘤/間質(zhì)中PD-L1 表達的相關(guān)性

3 討 論

免疫耐受和逃逸近年來在腫瘤和慢性感染方面均是研究熱點。結(jié)核感染與腫瘤微環(huán)境在免疫方面具有很多相似性，兩者均可以導(dǎo)致T 細胞進行性損害，使免疫細胞表面的免疫抑制分子表達升高，導(dǎo)致機體發(fā)生免疫逃逸，促進疾病的發(fā)生發(fā)展[10]，因此結(jié)核感染可能為腫瘤的發(fā)展提供了有利的微環(huán)境。

CTLA-4 是免疫球蛋白超家族成員，表達于T 淋巴細胞表面，通過與T 細胞表面的共刺激分子CD28競爭結(jié)合抗原提呈細胞表面的配體B7 分子（CD80、CD86）發(fā)揮作用，結(jié)合后產(chǎn)生抑制性信號，抑制T 細胞的增殖與活化[11]。CTLA-4 抑制T 細胞增殖與活化的作用，可能與白細胞介素-2（IL-2）產(chǎn)生減少[12]和B淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）等抗凋亡因子表達上調(diào)有關(guān)[13]。研究[14]表明，CTLA-4 在乙肝等慢性感染疾病中存在差異表達，并且參與了病原體的致病過程。在小鼠實驗中證實了CTLA-4 阻斷可增強慢性感染中的T 細胞反應(yīng)[15]。結(jié)核桿菌在人體中被巨噬細胞吞噬之后，刺激T 細胞增殖，使Th1/Th2 型T 細胞平衡失調(diào)，CD8+T 細胞表面的CTLA-4 等共抑制分子表達增加[5]。上述T 細胞平衡失調(diào)現(xiàn)象在肺癌患者體內(nèi)亦被發(fā)現(xiàn)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，三組患者病變組織中CTLA-4 表達于肺結(jié)核及肺癌病灶的淋巴細胞，并且肺癌合并肺結(jié)核組的表達率顯著高于其余兩組（P＜0.01），提示結(jié)核感染可能促使CTLA-4 在肺癌組織中的表達升高。在結(jié)核肉芽腫以及腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞逐漸轉(zhuǎn)化為M2 型，M2 巨噬細胞有助于促進血管的生成和免疫抑制因子的表達，促進腫瘤生長[18]。實驗[19]證實CTLA-4 表達的上調(diào)能促進結(jié)核相關(guān)巨噬細胞由M1 向M2 極化。由此推測在肺癌合并肺結(jié)核的病例中，結(jié)核免疫導(dǎo)致CTLA-4 的表達升高，有助于腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞向M2 型極化。綜上所述，CTLA-4 在免疫調(diào)節(jié)中主要發(fā)揮了負性作用，并且結(jié)核感染可能是通過提高CTLA-4 的表達和巨噬細胞向M2 型極化這兩個途徑促進免疫逃逸和形成適宜微環(huán)境，促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。

PD-1/PD-L1 是協(xié)同抑制分子，PD-L1 與CTLA-4 的作用相似，PD-L1 作為PD-1 的配體主要表達于腫瘤細胞與抗原提呈細胞的表面，兩者結(jié)合后能夠通過啟動胞內(nèi)磷酸化級聯(lián)反應(yīng)抑制T 細胞的活化和增殖，使免疫細胞耐受并減弱其抗腫瘤免疫反應(yīng)的能力[20]。PD-L1 在活動性肺結(jié)核患者的巨噬細胞上表達，并且當(dāng)PD-1/PD-L1 通路阻斷時，巨噬細胞的吞噬作用顯著增加，說明在結(jié)核患者中此通路抑制巨噬細胞的功能發(fā)揮[21]。在一項結(jié)核促進腫瘤發(fā)展的研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌可以促進CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細胞（Tregs）增殖，使非小細胞肺癌的腫瘤細胞增長，誘導(dǎo)PD-L1 表達，促進免疫逃逸[22]。也有相關(guān)研究提出，PD-1/PD-L1 信號通路是結(jié)核感染導(dǎo)致T 細胞耗竭和促進腫瘤在肺中轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑[23]。本研究顯示，PD-L1 在TNM 分期更高的肺癌合并肺結(jié)核病例中表達更高，說明PD-L1 的表達升高可能有利于腫瘤的發(fā)展。但PD-L1 與肺結(jié)核促進肺癌發(fā)展的相關(guān)性需要更多實驗來證實。

CTLA-4 和PD-L1 作為重要的免疫負性分子，均通過受體-配體結(jié)合的方式發(fā)揮抑制T 細胞免疫和促進腫瘤發(fā)展的作用，相關(guān)的免疫檢查點抑制劑已廣泛應(yīng)用。但免疫抑制通路具有多樣性，不同人、不同疾病的機制都可能不同，因此單靶點抗體藥物具有一定的局限性。目前臨床實驗發(fā)現(xiàn)，PD-L1 和CTLA-4 的聯(lián)合靶向治療比單獨治療更有效[24]，并且單獨阻斷PD-1/PD-L1 會導(dǎo)致CTLA-4 表達上調(diào)，從而發(fā)生治療抵抗[25]，由此可以推測兩者可能存在協(xié)同作用，由它們導(dǎo)致的雙重免疫抑制可以促進疾病的發(fā)展。但本研究樣本量較小，有一定的局限性，兩者之間的相關(guān)性有待進一步研究探討。

綜上所述，我們推測CTLA-4、PD-L1 均可能在結(jié)核感染過程中發(fā)生免疫負性調(diào)節(jié)，進而促進肺癌發(fā)生發(fā)展。由此，可以認為CTLA-4、PD-L1 是未來免疫調(diào)節(jié)治療的潛在藥物靶點，可能對肺癌的治療以及結(jié)核等慢性感染的治療有積極意義，可能干預(yù)結(jié)核進一步發(fā)展為癌癥的進程。