王玉喜 姜宜惠 張志偉 董 佳 楊 敏 謝 英

截至2018 年，慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）在中國中老年人群的患病率已接近14%，相比2007 年上升了約5%[1]，即將成為世界第三大死亡原因[2]。炎癥反應和免疫功能紊亂與COPD 發(fā)病關系密切，程清等[3]研究發(fā)現(xiàn)，p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）在COPD 患者肺泡巨噬細胞中被激活，并與患者肺動脈高壓、肺功能等病情嚴重程度密切相關。同時多項研究表明，COPD 患者外周血、支氣管黏膜下層、支氣管肺泡灌洗液、氣道上皮及肺組織中輔助性T 細胞17（T helper cell 17，Th17）數(shù)量較非COPD 吸煙者和健康人群均有所增加，且Th17 細胞數(shù)量越多，患者氣流受限程度越嚴重[4-5]。六君子湯是臨床常用中藥方劑，具有健脾益氣、和中止嘔、化痰止咳等功效。本研究通過觀察六君子湯對COPD 穩(wěn)定期肺脾氣虛證患者的臨床療效及p38MAPK/Th17 信號通路相關細胞因子表達的影響，探討六君子湯治療COPD 穩(wěn)定期肺脾氣虛證可能的作用靶點。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2021 年12 月至2022 年9 月在杭州市臨安區(qū)中醫(yī)院呼吸科就診的COPD 穩(wěn)定期肺脾氣虛證患者92 例，按隨機數(shù)字表法隨機分為實驗組和對照組，每組46 例。本研究經(jīng)杭州市臨安區(qū)中醫(yī)院倫理委員會審核通過（批件號：lazyyII202003 10-01），患者均簽署知情同意書。

1.2 納入、排除及退出標準 納入標準：（1）西醫(yī)診斷符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2021 年修訂版）》[6]、《COPD 診斷、治療與預防全球策略》[7]COPD診斷標準；（2）中醫(yī)辨證分型符合2002 年《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]和全國中醫(yī)藥高等院校教材《中醫(yī)內科學》[9]肺脾氣虛證標準。（3）病情處于穩(wěn)定期，COPD 分級為Ⅰ～Ⅱ級者[6]。排除標準：（1）入組前4 周內因COPD 急性加重住院的患者；（2）預計生存期不超過半年的患者；（3）其他胸肺疾患（如支氣管哮喘、肺結核等）者；（4）合并其他臟器較嚴重的原發(fā)性疾病者。退出標準：（1）因已知或未知因素，患者不愿或不可能再繼續(xù)進行臨床試驗；（2）治療期間出現(xiàn)嚴重不良事件（如過敏反應、器官功能損傷、心血管事件等），根據(jù)醫(yī)生判斷應停止試驗者。

2 方 法

2.1 治療方法 兩組患者均給予西醫(yī)常規(guī)治療：布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑（瑞典阿斯利康制藥有限 公 司，規(guī) 格：160 μg/4.5 μg/吸×60 吸，批 號20210105、20220125），1 次1 吸，1 天2 次；噻托溴銨粉吸入劑（德國勃林格殷格翰制藥有限公司，規(guī)格：18 μg×10 粒；批號20210502、20220602），1 次1 吸，1天1 次。對照組在西醫(yī)常規(guī)治療基礎上予安慰顆粒劑（培力藥業(yè)有限公司，批號20201244），由煎藥室統(tǒng)一制成水劑，真空包裝，每袋200 mL，1 次1 袋，1 天2 次，早晚飯后溫服。實驗組在西醫(yī)常規(guī)治療基礎上加服六君子湯（黨參15～30 g，茯苓15 g，炒白術15～30 g，半夏9～12 g，陳皮9～12 g，炙甘草6 g），中藥購于銅陵禾田中藥飲片股份有限公司（批號依次為20210501、20210312、20210510、20210301、20210415、20210101），由煎藥室統(tǒng)一代煎成200 mL 1 袋，1 次1 袋，1 天2 次，早晚飯后溫服。兩組療程均為3 個月，若在治療期間患者出現(xiàn)急性加重等病情變化，按照指南提出的規(guī)范治療方案予以相應治療[6]。

2.2 觀察指標及方法

2.2.1 中醫(yī)證候積分 參考《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]擬定，主癥為咳嗽、咯痰、喘息、氣短，按無、輕、中、重分別予0、2、4、6 分；次癥為乏力、自汗，按無、輕、中、重分別予0、1、2、3 分（見表1）。取總分即為中醫(yī)證候積分，分值越高，癥狀越重。證候積分減少率=（治療前證候積分-治療后證候積分）/治療前證候積分×100%。

表1 COPD 穩(wěn)定期肺脾氣虛證患者中醫(yī)證候積分評分標準

2.2.2 肺功能檢查 采用德國耶格肺功能儀（德國Vyaire Medical GmbH 偉業(yè)安醫(yī)療器械公司，型號MasterScreen）統(tǒng)一評估患者治療前后1 s 用力呼氣容積/用力肺活量（FEV1/FVC）、FEV1 占預計值百分比（FEV1%）。重復3 次，取最佳值。

2.2.3 COPD 臨床問卷（CCQ）評分 兩組患者采用CCQ[10]進行治療前后生存質量評分。評分表由10 個項目組成：癥狀4 項，功能狀態(tài)4 項，精神狀態(tài)2 項。每項記0～6 分，分數(shù)越高表示生存質量越差。

2.2.4 COPD 急性加重次數(shù) 急性加重嚴重程度[11]：（1）輕度：呼吸癥狀加重，可通過增加藥物劑量控制；（2）中度：需要使用全身糖皮質激素和（或）抗生素治療；（3）重度：需要住院或至急診治療。觀察記錄研究期間輕度及以上急性加重次數(shù)，若兩次間隔時間在5 d 內則算為1 次。

2.2.5 外周血單個核細胞分離 采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，肝素抗凝。按照單個核細胞分離試劑（美國SIGMA 公司，批號191104）說明書操作。最終取底部的單個核細胞沉淀經(jīng)0.4%臺盼藍染色，活細胞＞90%可用。

2.2.6 Th17 細胞水平測定 取分離得到的單個核細胞，根據(jù)Th17 細胞檢測試劑盒（美國BD 公司，批號200916）說明書配置抗體標記的細胞懸液，采用流式細胞儀（美國BD 公司，型號BD FACS Canto Plus）測定Th17 細胞水平。

2.2.7 外周血單個核細胞p38MAPK 檢測 取分離得到的單個核細胞，根據(jù)Trizol 試劑（美國Qiagen 公司，批號190525）和逆轉錄試劑盒（美國Qiagen 公司，批號190117）說明書提取總RNA 并逆轉錄為cDNA。根據(jù)2×SYBR Green PCR Master Mix（北京康為世紀公司，批號200110）說明書配置反應體系，采用實時熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)（美國ABI 公司，型號7500）進行分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2-△△Ct值表示p38MAPK 相對表達量。引物序列：p38-MAPK-F：AAGTTCCTGTCCACATTGCC；p38MAPK-R：TGGATTCAGTGTCAAGCTGC。GAPDH-F：TCAACAGCGACACCCACTCC；GAPDH-R：TGAGGTCCACCACCCTGTTG。

2.2.8 血清細胞因子水平檢測 采集患者外周靜脈血2 mL，肝素抗凝。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑（美國R&D 公司，批號20201201、20210311、202110101、20210415、20210715、20210201） 說明書操作，采用酶標儀（美國Benchmark 公司，型號MR9600）于450 nm 波長下測定白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-17（IL-17）、白細胞介素-22（IL-22）、白細胞介素-23（IL-23）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。

2.3 臨床療效評價[8]按中醫(yī)證候積分評價臨床療效。臨床控制：癥狀體征消失/基本消失，證候積分減少率≥95%；顯效：癥狀體征明顯改善，證候積分減少率≥70%；有效：癥狀體征有所好轉，證候積分減少率≥30%；無效：癥狀體征無明顯改善，甚至加重，證候積分減少率＜30%。總有效率=（臨床控制例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t 檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 兩組COPD 穩(wěn)定期患者一般資料比較 兩組患者均完成治療，無退出病例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表2。

表2 兩組COPD 穩(wěn)定期患者一般資料比較

3.2 兩組COPD 穩(wěn)定期患者中醫(yī)證候積分、肺功能、CCQ 評分和急性加重次數(shù)比較 與治療前比較，兩組患者治療后中醫(yī)證候積分、CCQ 評分和均降低，肺功能改善（P＜0.05），且實驗組效果優(yōu)于對照組（P 均＜0.01）。實驗組急性加重次數(shù)低于對照組（P＜0.01）。見表3。

表3 兩組COPD 穩(wěn)定期患者臨床觀察指標比較（±s）

表3 兩組COPD 穩(wěn)定期患者臨床觀察指標比較（±s）

注：對照組給予布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑加安慰劑治療；實驗組給予六君子湯聯(lián)合布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑治療；COPD 為慢性阻塞性肺疾??；FEV1/FVC 為1 秒鐘用力呼氣容積/用力肺活量；FEV1%為FEV1占預計值百分比；CCQ 為COPD 臨床問卷；與同組治療前比較，aP＜0.05

組別實驗組對照組t 值P 值例數(shù)46 46中醫(yī)證候積分（分） FEV1/FVC FEV1% CCQ 評分（分）治療前17.61±5.99 17.33±4.62 0.253 0.801治療后6.52±1.53a 9.23±2.45a 6.377＜0.001治療前54.93±10.89 52.50±13.30 0.961 0.339治療后64.48±11.97a 58.07±9.80a 2.812 0.006治療前58.43±12.71 57.01±13.81 0.518 0.606治療后65.52±11.65a 61.80±12.78a 2.693 0.009治療前3.88±0.58 3.94±0.41 0.620 0.537治療后1.77±0.12a 2.44±0.59a 7.563＜0.001急性加重次數(shù)（次）0.72±0.62 1.22±0.81 3.313 0.001

3.3 兩組COPD 穩(wěn)定期患者外周血Th17 細胞水平比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血Th17細胞水平均明顯降低（P＜0.05），且實驗組效果優(yōu)于對照組（P＜0.01）。見表4。

表4 兩組COPD 穩(wěn)定期患者外周血Th17 細胞水平比較（%，±s）

表4 兩組COPD 穩(wěn)定期患者外周血Th17 細胞水平比較（%，±s）

注：對照組給予布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑加安慰劑治療；實驗組給予六君子湯聯(lián)合布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑治療；COPD 為慢性阻塞性肺疾?。籘h17 為輔助性T 細胞17；與同組治療前比較，aP＜0.05

組別實驗組對照組t 值P 值例數(shù)46 46治療前6.20±1.01 6.20±1.00 0.009 0.993治療后2.18±0.81a 3.41±0.58a 8.350＜0.001

3.4 兩組COPD 穩(wěn)定期患者外周血單個核細胞p38MAPK 表達比較 與治療前比較，兩組患者治療后外周血單個核細胞p38MAPK 水平均下降（P＜0.05），且實驗組效果更明顯（P＜0.01）。見表5。

表5 兩組COPD 穩(wěn)定期患者外周血單個核細胞p38MAPK 表達水平比較（±s）

注：對照組給予布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑加安慰劑治療；實驗組給予六君子湯聯(lián)合布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑治療；COPD 為慢性阻塞性肺疾?。籶38MAPK 為p38 絲裂原活化蛋白激酶；與同組治療前比較，aP＜0.05

組別實驗組對照組t 值P 值例數(shù)46 46治療前49.79±5.54 49.70±4.53 0.089 0.930治療后40.79±3.83a 44.36±5.26a 3.727＜0.001

3.5 兩組COPD 穩(wěn)定期患者血清細胞因子水平比較與治療前比較，兩組患者治療后血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α 水平均降低（P＜0.05），且實驗組低于對照組（P＜0.01）。見表6。

表6 兩組COPD 穩(wěn)定期患者血清細胞因子水平比較（ng/L，±s）

表6 兩組COPD 穩(wěn)定期患者血清細胞因子水平比較（ng/L，±s）

注：對照組給予布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑加安慰劑治療；實驗組給予六君子湯聯(lián)合布地奈德福莫特羅吸入粉霧劑和噻托溴銨粉吸入劑治療；COPD 為慢性阻塞性肺疾??；IL-6 為白細胞介素-6；IL-8 為白細胞介素-8；IL-17 為白細胞介素-17；IL-22 為白細胞介素-22；IL-23 為白細胞介素-23；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與同組治療前比較，aP＜0.05

組別實驗組對照組t 值P 值例數(shù)46 46治療前52.57±8.01 53.06±8.78 0.293 0.771 IL-6 IL-8 IL-17治療后25.64±6.84a 38.10±7.91a 20.914＜0.001治療前74.44±6.84 73.39±7.23 0.817 0.420治療后45.35±4.57a 56.89±6.38a 16.060＜0.001治療前42.93±5.01 41.78±6.28 0.235 0.815治療后21.37±4.91a 30.59±5.24a 15.654＜0.001組別實驗組對照組t 值P 值例數(shù)46 46治療前23.38±3.45 22.85±2.22 0.227 0.822 IL-22 IL-23 TNF-α治療后9.67±2.12a 15.55±3.49a 10.874＜0.001治療前98.44±13.48 99.49±12.11 0.433 0.667治療后56.93±6.93a 73.23±8.36a 18.976＜0.001治療前46.73±15.31 48.21±13.56 1.710 0.097治療后19.98±6.94a 29.37±9.81a 20.743＜0.001

3.6 兩組COPD 穩(wěn)定期患者臨床療效比較 實驗組總有效率（93.48%）優(yōu)于對照組（78.26%）（P＜0.05）。見表7。

表7 兩組COPD 穩(wěn)定期患者臨床療效比較[例（%）]

4 討 論

中醫(yī)認為，COPD 的主要病因為氣血虛弱、外邪入侵、痰濕內生，病位首先在肺，繼而延及脾、腎，又根據(jù)其喘息、氣促、咳嗽、咯痰等癥狀歸屬于“肺脹、喘證”范疇?！夺t(yī)宗金鑒》云：“肺脹者，喘滿而不舒者也，方治胸中脹滿不舒，按之如堵，氣滯之為病?！薄杜R證指南醫(yī)案》記載：“肺脹，心胸支滿，不能舒胸，時作似哮痰鳴聲，每于此時皆喘不能臥者，為肺脹也，當吐之。”李瑞祥等[12]研究發(fā)現(xiàn)COPD 急性期多以邪實為主，穩(wěn)定期多以虛證為主，且以脾肺虛多見。本研究顯示，六君子湯能顯著減輕COPD 脾肺氣虛證患者臨床癥狀、降低急性加重次數(shù)、改善肺功能、提高生活質量，與以往研究結果一致[13-14]。六君子湯中君藥黨參歸肺脾二經(jīng)，性甘平，可補益肺脾且作用緩和，常用于慢性疾病的治療。茯苓配白術健脾益氣、利水滲濕；陳皮祛濕化痰、寬胸行氣；半夏健脾化濕、降逆止嘔；此五藥為臣，既杜生痰之源，又消已生之痰。甘草調和諸藥，補益氣血。全方共奏補肺健脾，燥濕化痰之功效，可以從根本上調節(jié)慢阻肺患者痰、瘀、虛的基本病機，標本兼治。

p38MAPK/Th17 信號通路在炎癥反應的發(fā)生和維持階段都扮演著重要角色。CD4+T 淋巴細胞在受到促炎因子（如IL-6、TNF-α、IL-23）的刺激后可以轉化為Th17 細胞，后者主要分泌IL-22 和IL-17 等細胞因子[15]。IL-17 可刺激中性粒細胞分泌IL-6、IL-8 等細胞因子，調節(jié)氣道內肺巨噬細胞的趨化和激活，將炎癥刺激信號不斷級聯(lián)放大，加重肺損傷；IL-22 一方面可通過增強TNF-α 分子下游的信號轉導途徑從而起到促進氣道炎癥的作用，另一方面正反饋促進Th17 細胞的繼續(xù)分化成熟[16]。同時IL-17 可與其相應受體結合激活下游p38MAPK 信號通路[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，p38MAPK 信號通路參與了COPD 患者體內中性粒細胞介導的炎癥反應，抑制p38MAPK 活性可顯著抑制巨噬細胞和中性粒細胞以及細胞因子的合成，減輕COPD 患者氣道炎癥，是COPD 治療的重要靶點。有研究[19-20]表明，COPD 患者血清IL-23 濃度升高，且程度與疾病進展相關，IL-6 和IL-17 可通過刺激支氣管上皮細胞，導致氣道黏液分泌失衡，引起COPD。本研究顯示，服用六君子湯后，COPD 脾肺氣虛證患者外周血單個核細胞中p38MAPK 表達水平降低，Th17 水平下調，血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α 等細胞因子水平也均有不同程度的降低（P＜0.05）。從藥理學角度分析，黨參具有改善肺泡相關物質結構和功能的作用，其中含有的多糖能提高機體的抗應激和抗缺氧能力，增加機體免疫力；白術中的內酯類成分具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛的功效，可以清除過量自由基，減緩COPD 的氧化應激過程，進而保護肺組織；茯苓中的β-茯苓聚糖可提高腫瘤壞死因子、白細胞介素-2 和自然殺傷細胞的活性，增強細胞免疫功能而起到抑制慢性炎癥、抗腫瘤的作用；陳皮揮發(fā)油中的檸檬烯具有較強的抗菌作用；半夏提取物可通過抑制TNF-α 等炎癥因子的釋放從而上調肺水通道蛋白-5 的表達，減輕肺部炎癥，起到肺保護作用[21-23]。

綜上所述，我們認為六君子湯治療COPD 脾肺氣虛證，主要通過抑制p38MAPK/Th17 信號通路及其相關細胞因子表達而發(fā)揮作用。