徐靈佳，郭欣桐

（寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

隨著質(zhì)譜分析技術(shù)迅速發(fā)展，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析已經(jīng)成為最廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)復(fù)合物分離鑒定研究方法[1-3]。而前端采用納流液相色譜的液質(zhì)聯(lián)用方法，更是大大突顯了液質(zhì)聯(lián)用高效率、高分辨、高靈敏度以及低進(jìn)樣量的優(yōu)勢[4]。因此，如何進(jìn)一步提高前端色譜分離的效率和效果是目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析亟需解決的問題。

球包球填料[5]是一種新型的殼-核色譜填料，它優(yōu)化了色譜動力學(xué)過程，在之前的研究中色譜分離效果良好[6]。通過改變表面納米小球的殼厚度，可以將色譜填料調(diào)整到適宜尺寸的孔隙，從而適用于分離生物大分子。

本實驗采用這種新型球包球殼-核式反相色譜填料填充納流液相色譜柱，探究色譜柱的柱性能，并構(gòu)建了液質(zhì)聯(lián)用平臺，探究此平臺在牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物分析中的應(yīng)用，從而預(yù)測其未來在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用潛能。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與試劑

材料：內(nèi)徑100 μm，外徑375 μm 的透明涂層毛細(xì)管（永年銳灃色譜器件有限公司）。

試劑：乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）、超純水、尿素、NH4HCO3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA）、胰蛋白酶。

樣品：牛血清白蛋白（BSA）。

1.2 實驗儀器及數(shù)據(jù)處理

實驗儀器：Vario EL III 元素分析儀（Elementar，Germany）；日立S-4800 掃描電鏡（Hitachi，Japan）；納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用平臺由Waters ACQUITY 超高壓液相色譜系統(tǒng)（Waters，Milford，MA，USA）和QExactive 高性能臺式四級桿-軌道阱質(zhì)譜儀（Thermo Scientific，USA）組成，分析柱由球包球填料填充而成。

數(shù)據(jù)處理：將Q-Exactive 質(zhì)譜分析得到的raw 文件用Proteome Discoverer（Version 1.40，Thermo Fisher）進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫為Uniprot-Bovine。

1.3 球包球填料毛細(xì)管柱性能檢測

1.3.1 柱截面填充情況檢測 采用勻漿法填充3 根15 cm 長的球包球填料毛細(xì)管柱，每根色譜柱以每2 cm 為1 節(jié)點(diǎn)按照垂直于色譜柱方向截斷，用掃描電鏡觀察其柱床填充情況。

1.3.2 球包球填料元素含量分析 將球包球填料（SOS-ODS）、A scentis Express C18、HALO C18（AMT，Inc.）、Kinetex C18（Phenomenex）、Poroshell 120（Agilent）5 種填料各取適量，分2 份包裹在錫箔中，稱重之后放入自動樣品進(jìn)樣器的旋轉(zhuǎn)式進(jìn)樣盤中進(jìn)行元素分析。

1.4 納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析

1.4.1 牛血清白蛋白的酶解 蛋白質(zhì)酶解樣品是通過胰蛋白酶在溶液里酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白而獲得的。首先，蛋白質(zhì)被溶解在8 mol/L 尿素、0.05 mol/L NH4HCO3的溶液中。然后，蛋白質(zhì)被DTT 分解，被IAA 烷基化。最后，胰蛋白酶以50∶1 的比例加進(jìn)去，酶解過夜。

1.4.2 納流液相色譜體系流動相的配制 分別配制流動相，A 相（水相）：H2O+0.1%TFA；B 相（有機(jī)相）：ACN+0.1%TFA；C 相：50%ACN。

1.4.3 梯度洗脫 液相的流量為300 nL/min。流動相梯度為0～5 min，2%～10%B；5～85 min，10%～35%B；85～105 min，35%～65%B；105～110 min，65%～95%B；110～120 min，95%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱截面的掃描電鏡

為了解球包球填料填充的納流液相色譜柱的柱床微觀結(jié)構(gòu)，探求其對色譜分離效能的影響，使用掃描電鏡對色譜柱截面進(jìn)行了觀察，見圖1。由圖1 可以看出，球包球填料高度均一，但由于填料表面布滿了納米小球，表面比較粗糙，納米小球彼此之間擠壓，造成填充柱床中的空腔較多，孔隙較大。柱床中的大孔隙雖然可以降低色譜分離時的背壓，提高分離速度，但是對于復(fù)雜多肽混合物的分離效果可能不利。

圖1 球包球填料毛細(xì)管柱的掃描電鏡圖

2.2 球包球填料元素含量分析

對于反相色譜填料來說，C18 的修飾決定了蛋白多肽等生物分子的保留情況，因此，探究色譜填料的碳載量尤為重要。本實驗對球包球填料和4 種商業(yè)化的反相色譜填料進(jìn)行元素分析，見表1。

表1 5 種色譜填料的元素分析表

由表1 可以看出，球包球填料的平均碳載量相對較低，這可能會影響到色譜分離時生物分子的保留情況，可能需要更長的洗脫時間和洗脫梯度才能達(dá)到較好的分離效果。

2.3 納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析

利用球包球填料填充的毛細(xì)管柱構(gòu)建納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析平臺，對標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白（BSA）酶解進(jìn)行分離，得到BSA 酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜總離子流圖見圖2。由圖2 可知，球包球填料對小分子多肽的混合物分離效果良好。由圖3 可知，在此平臺下對BSA 酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，肽段匹配很高。通過搜庫結(jié)果可知，肽段的覆蓋率可達(dá)63.90%，由此證明了球包球填料高效的色譜分離能力和液質(zhì)聯(lián)用在蛋白質(zhì)組學(xué)分析的應(yīng)用潛能。

圖2 BSA 酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜總離子流圖

圖3 BSA 酶解產(chǎn)物中肽段匹配情況

3 結(jié)語

本實驗利用球包球填料填充納流液相色譜分析柱，對其柱床性能進(jìn)行了簡單考察，成功構(gòu)建了納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析平臺，并采用液質(zhì)聯(lián)用法對牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行了分析鑒定。球包球填料的納流液相色譜柱床孔隙較大，可能與其表面過于粗糙有關(guān)。球包球填料平均碳載量相對較低，影響生物分子保留，后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化。盡管如此，球包球填料依舊顯示出它在色譜上的高效分離，由其建立的液質(zhì)聯(lián)用在蛋白質(zhì)組學(xué)分析上具有巨大應(yīng)用潛能。