朱沛文,張勤生,張廣玉,孫曉娜,李明彥,李振華

（河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002）

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)以胰酶異常激活、胰腺組織局部炎性反應(yīng)為主要特征,常伴有其他組織器官功能改變[1]。AP的主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)性、急性腹痛,常伴有惡心、停止排便、發(fā)熱和嘔吐等[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對AP的主要治療方法為抑制胰酶分泌及活化、補(bǔ)充液體和對癥支持治療。AP歸屬中醫(yī)“脾心痛”“腹痛”“結(jié)胸”“脾實”等范疇,常見陽明腑實、瘀熱互結(jié)、肝膽濕熱、熱毒互結(jié)等證型[3-4]。大陷胸湯出自《傷寒論》,由大黃、芒硝、甘遂組成,具有泄熱逐水之功。已有研究證實,大黃能抑制胰蛋白酶的活性及中性粒細(xì)胞過度活化,從而減少炎性反應(yīng),治療AP時可有效控制炎癥程度,進(jìn)而促進(jìn)胃腸道功能恢復(fù)[5]。甘遂能促進(jìn)胃腸道排出積聚的宿垢、毒素,并可促進(jìn)胃腸蠕動,降低AP患者的腹內(nèi)壓,減輕腹脹,緩解全身的中毒癥狀[6]。筆者基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討大黃-甘遂藥對治療AP的潛在作用機(jī)制,分析該方劑中的核心作用靶點,初步構(gòu)建藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò),以期為臨床治療AP用藥提供理論支撐。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)依次檢索大黃、甘遂,獲取上述2味中藥的活性成分信息,以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對檢索的活性成分進(jìn)行篩選。結(jié)合PubChem 數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取篩選到的活性成分的簡短有機(jī)分子結(jié)構(gòu)式(smiles結(jié)構(gòu))。

1.2 藥物-疾病作用靶點篩選 ①基于藥物活性成分的smiles結(jié)構(gòu),結(jié)合化合物靶標(biāo)預(yù)測(SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫,http://www.swisstargetprediction.cn/),提取每一個藥物活性成分的作用靶點,以probability≥30%為條件對獲得的靶點進(jìn)行篩選。整合Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫與TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選獲得的大黃、甘遂主要成分的作用靶點,通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。②基于人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards,https://www.genecards.org/)與在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM,http://www.omim.org/),以“acute pancreatitis”為關(guān)鍵詞,獲得與AP相關(guān)的疾病靶點,以-lgP＞5為條件進(jìn)行疾病靶點篩選。

1.3 藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選獲得的大黃、甘遂的主要成分、主要成分對應(yīng)的作用靶點及與AP相關(guān)的疾病靶點依次導(dǎo)入Venny 2.1 軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),獲取藥物-疾病共同靶點,繪制韋恩圖?；赟TRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/),以0.90為最低相互作用閾值,隱藏游離點,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,檢索藥物-疾病共同靶蛋白,構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)模型,并篩選出核心作用靶點。將藥物的主要活性成分及其與疾病的共同作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件,構(gòu)建藥物-活性成分-靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體論(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將篩選預(yù)測出的主要活性成分的核心靶心通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO 功能分析與KEGG 通路分析。GO 功能富集分析涉及生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子功能(MF)3個過程。KEGG 通路富集分析得到關(guān)聯(lián)性較大的作用通路。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件,共找到大黃的主要化學(xué)成分16種,甘遂的主要化學(xué)成分8種。見表1。

表1 大黃-甘遂藥對藥物主要化學(xué)成分信息

2.2 藥物-疾病作用靶點 將大黃、甘遂的主要活性成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫,以Probability≥30%為篩選條件,將所得靶點與TCMSP 數(shù)據(jù)庫中所得的靶點合并,共得到133 個主要作用靶點。檢索GeneCards與OMIM 數(shù)據(jù)庫,共得到936個-lgP＞5且與AP相關(guān)的作用靶點。將藥物的所有靶點與AP相關(guān)的靶點導(dǎo)入Venny2.1.0軟件,最終獲得藥物-疾病共同作用靶點(交集靶點)41個,并繪制韋恩圖。見圖1(掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將篩選得到的41個交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫,以度值(Degree值)＞15 為核心靶點篩選標(biāo)準(zhǔn),共得到19 個核心作用靶點,導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件,構(gòu)建核心作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2(掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片)。

2.4 GO 功能分析 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫對19個核心作用靶點進(jìn)行GO 功能分析。設(shè)定閾值P＜0.05,共富集到214條結(jié)果,按BP、CC和MF分類并分別篩選出前10 條,通過GraphPad Prism 5.0 軟件繪圖。BP主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、脫氧核糖核酸(DNA)轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、一氧化氮(NO)生物合成的正調(diào)控,CC主要涉及凋亡的負(fù)調(diào)控等,細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、受體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)等,MF主要涉及細(xì)胞因子活性、蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶、蛋白酪氨酸激酶活性等。見圖3(掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片)。

2.5 KEGG 通路分析 將19 個核心作用靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集,設(shè)定閾值P＜0.05,共富集到77條通路,以核心靶點個數(shù)及相關(guān)性進(jìn)行綜合評價排序,排名前20位的信號通路通過Omicshare軟件以高級氣泡圖的形式呈現(xiàn)。KEGG 通路主要涉及TNF、MAPK、PI3K-Akt、NOD 樣受體、VEGF、Toll樣受體信號通路。見圖4(掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片)。

2.6 藥物-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將大黃-甘遂藥對的7個主要活性成分、19個核心作用靶點、6條通路通過Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,繪制藥物-活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。此網(wǎng)絡(luò)共包括34個節(jié)點、78條邊,對應(yīng)成分最多的活性成分為β-谷固醇、兒茶素、澤蘭黃醇、大黃酸、決明內(nèi)酯、蘆薈大黃素、千槲皮素。見圖5(掃描標(biāo)題右側(cè)二維碼查看圖片)。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中并無“胰腺”這一臟腑名,但《難經(jīng)》《十四經(jīng)發(fā)揮》《本草綱目》《醫(yī)林改錯》等相關(guān)古籍中有與胰腺現(xiàn)代解剖相吻合的位置、形態(tài)描述,從胰腺的生理功能及解剖位置分析,胰腺應(yīng)歸屬脾臟。《三因極一病證方論》中關(guān)于“厥心痛”“脾心痛”“胃心痛”的描述,是確定AP的中醫(yī)病名歸屬的重要參考依據(jù)。大黃味苦,性寒,歸胃、大腸、肝、脾經(jīng),具有攻積滯、清濕熱、瀉火涼血、祛瘀解毒的作用。研究表明,大黃可通過降低血液、腹水中的炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平而減輕胰腺病理損傷,并能降低血中炎性介質(zhì)丙二醛(MDA)含量,升高保護(hù)性因子超氧化物歧化酶(SOD)含量,對AP 起到治療作用[7]。甘遂味苦,性寒、有毒,歸肺、腎、大腸經(jīng),具有瀉水逐飲、破積通便之效。研究顯示,在疾病發(fā)展初期,盡早應(yīng)用甘遂或聯(lián)合大黃,以“通”為治則,在防治AP方面的臨床療效顯著[8-9]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,大黃-甘遂藥對治療AP的主要活性成分可能為β-谷固醇、兒茶素、澤蘭黃醇素、大黃酸、決明內(nèi)酯、蘆薈大黃素、槲皮素,治療AP的主要作用靶點為TP53、MAPK3、SRC、TNF、JUN、MYC、CASP3、PTGS2、ESR1、HSP90AA1、MDM2、MAPK14、IL-1B、KDR、IGF1R、HIF1A、PPARG、NR3C1、NOS2,可能作用的主要通路有TNF、MAPK、PI3K-Akt、NOD 樣受體、VEGF、Toll樣受體信號通路。

炎癥風(fēng)暴為AP 發(fā)生、進(jìn)展、惡化的主要因素,抑制炎癥因子表達(dá)是治療AP 的主要手段[10]。TNF、PI3K-Akt、MAPK、Toll樣受體信號通路均與炎癥因子密切相關(guān)。白細(xì)胞介素-17是T 細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子,其在多種炎癥性疾病中扮演著重要角色,能夠快速磷酸化MAPK,誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[11]。有研究證實,大黃酸血藥濃度與促炎因子水平呈顯著負(fù)相關(guān),大黃酸可保護(hù)腸道黏膜屏障,增加胃腸激素分泌,促進(jìn)腸鳴音恢復(fù),增加排便次數(shù),降低腹腔壓力[12]。蘆薈大黃素可抑制AP 大鼠血清血小板活化因子(PAF)、IL-6、TNF-α水平[13]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測β-谷固醇、兒茶素、澤蘭黃醇素、大黃酸、決明內(nèi)酯、蘆薈大黃素、槲皮素可能是治療AP的有效成分,但蘆薈大黃酸、大黃酸治療AP 是否與TNF、PI3K-Akt、MAPK、Toll樣信號通路有關(guān),尚需進(jìn)一步驗證。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對大黃-甘遂藥對干預(yù)AP的作用機(jī)制進(jìn)行分析,預(yù)測得到7個主要活性成分與19個核心作用靶點,這些活性成分可能通過抗炎、抗氧化、反向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)胰腺分泌等方式發(fā)揮藥效。另外,本研究共分析出了6條大黃-甘遂藥對干預(yù)AP 的信號通路,為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)。本研究也有一定的局限性,如中藥復(fù)方成分復(fù)雜;藥物的主要成分主要基于生物藥劑學(xué)分類理論(BCS),以O(shè)B為主要篩選依據(jù),對于方劑中活性成分的含量、成分間的相互作用對藥物溶解性、吸收和生物利用度的影響,以及某些成分可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物的非入血途徑發(fā)揮治療作用并未進(jìn)行考慮,導(dǎo)致一些膜滲透性強(qiáng)的成分如槲皮素、山柰酚、木犀草素類成分總能高分入選,而公認(rèn)的藥物主要活性成分往往并未受到重點關(guān)注,造成推測的結(jié)果可信度低。此外,本文并未對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行實驗驗證,研究結(jié)論僅基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的聚焦分析,仍需后續(xù)研究進(jìn)行驗證。