鄭 朗，洪 瀾，王圣坦，成 潔，莊珩之，葉克潤

（海南省人民醫(yī)院，海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院婦科，海南 ?？?570311）

卵巢癌（OV）是女性常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有25 萬人被診斷為OV，其中約有15 萬人因此疾病死亡[1]。年齡、遺傳因素、家族史、肥胖、乳腺癌、吸煙、酗酒等與OV 的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)[2-3]。OV 細(xì)胞具有高度侵襲性和耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳[4]。鐵死亡是由細(xì)胞內(nèi)鐵離子過載和氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡方式[5]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，可以通過多種機制調(diào)控基因的表達(dá)[6-7]，影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)行為[8-9]。lncRNA在腫瘤中扮演著多種重要角色，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關(guān)。目前關(guān)于OV 中鐵死亡的作用和機制尚不清楚。因此，本文旨在構(gòu)建并分析鐵死亡相關(guān)的OV預(yù)后模型，從而探討鐵死亡在OV 發(fā)病和預(yù)后中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 研究數(shù)據(jù)

從TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov）公共數(shù)據(jù)平臺中篩選2015 年6 月至2017 年6 月收錄并具有完整隨訪信息的OV 患者正常樣本及腫瘤樣本的RNA 測序等數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)。從FerrDb v2 網(wǎng)站（http://www.zhounan.org/FerrDb/）獲取鐵死亡相關(guān)基因。

1.1.1 與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 篩選 以共表達(dá)分析方法篩選鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)的lncRNA，其篩選條件為|log FC|≥1.0，P＜0.05。合并鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)lncRNA 和TCGA 數(shù)據(jù)庫中生存時間、生存狀態(tài)等臨床相關(guān)信息行Cox 單因素回歸分析，以P＜0.05 回歸因素信息進(jìn)行篩選。

1.1.2 差異lncRNA 功能富集及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 基因進(jìn)行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。GO 分析主要包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）三部分。采用GO seq 和KOBAS 對篩選出的差異表達(dá)RNA 進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路分析，篩選條件均為P＜0.05。采用相互作用基因庫檢索工具（STRING）（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)之間的相互作用，設(shè)置篩選閾值為：結(jié)合分值＞0.4。用顏色的深淺表示 Degree 算法預(yù)測的評分高低。

1.1.3 OV 預(yù)后風(fēng)險模型構(gòu)建及驗證 依據(jù)Cox 回歸分析方法篩選與鐵死亡和OV 預(yù)后相關(guān)lncRNA，并構(gòu)建基于OV 預(yù)后風(fēng)險模型，基于模型計算出各個樣本風(fēng)險評分，依據(jù)截斷值將樣本患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。比較高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的生存情況并繪制Kaplan-Meier 生存曲線，采用單多因素Cox 回歸分析方法和受試者工作特征曲線（ROC）對模型性能進(jìn)行分析。

1.2 統(tǒng)計學(xué)方法

差異lncRNA 比較采用t檢驗進(jìn)行，用Kaplan-Meier方法繪制OV 患者生存曲線，并使用對數(shù)秩檢驗對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA

與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 篩選結(jié)果如圖1所示，依據(jù)FDR 和logFC ＞1 篩選得到與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 差異表達(dá)基因共48 個。見圖1。

圖1 與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA

與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 基因GO 分析結(jié)果如圖2 所示，這些基因在生物學(xué)過程（BP）中的主要作用與蛋白質(zhì)ADP 核糖基化、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)激反應(yīng)、鐵離子轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控等過程相關(guān)（見圖2A）。在細(xì)胞組分（CC）方面主要與核膜、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)溶液、大分子復(fù)合物線粒體、核質(zhì)、細(xì)胞外囊泡等組分相關(guān)（見圖2B）；在分子功能方面主要與蛋白ADP 核苷酸糖基化、核苷酸轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)錄共抑制因子、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶激活因子、受體DNA 結(jié)合、鈉離子通道抑制等過程相關(guān)（見圖2C）。

圖2 差異lncRNA 的GO 功能富集圖

與OV預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 基因主要參與的生物通路分析結(jié)果如圖3 所示，主要包括：鐵死亡、堿基切除修復(fù)、煙酸和煙酰胺代謝、AMPK 信號通路、細(xì)胞凋亡、HIF-1 信號通路、代謝途徑等。

圖3 與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 基因的KEEG 富集圖

2.2 PPI 互作網(wǎng)絡(luò)分析

差異lncRNA 基因編碼蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖4 所示，差異lncRNA 基因編碼蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點數(shù)為60，邊數(shù)為138，平均節(jié)點度為4.6，平均局部聚類系數(shù)為0.51，預(yù)期的邊數(shù)為46。

圖4 PPI 互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 Cox 回歸結(jié)果分析

將與OV 預(yù)后和鐵死亡相關(guān)lncRNA 與臨床指標(biāo)中的生存時間及生存狀態(tài)進(jìn)行合并，將其作為影響因素進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，以P＜0.05 篩選符合條件的lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有35 個lncRNA 與OV 患者生存預(yù)后顯著相關(guān)。進(jìn)一步經(jīng)過多因素Cox 回歸分析，最終獲得了10 個lncRNA（見表1）。

表1 OV 預(yù)后影響lncRNA 多因素Cox 回歸

2.4 OV 預(yù)后模型構(gòu)建結(jié)果分析

依據(jù)多因素Cox 回歸分析后獲得的10 個lncRNA構(gòu)建OV 預(yù)后模型。采用OV 預(yù)后風(fēng)險評分（Risk score）對模型進(jìn)行表示，則本研究構(gòu)建的預(yù)后模型可表示為下式：

2.5 預(yù)后模型生存狀況分析

根據(jù)OV 預(yù)后模型計算各樣本的風(fēng)險值，并將計算得到的中位數(shù)作為截斷值，將納入OV 樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，每組35 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果顯示，高風(fēng)險組的平均生存時間為（2.38±1.06）年，低風(fēng)險組的平均生存時間為（4.78±1.62）年，高風(fēng)險組的平均生存時間顯著低于低風(fēng)險組（P＜0.001）（見圖5）。

圖5 OV 不同風(fēng)險生存狀態(tài)分析

2.6 OV 預(yù)后模型ROC 曲線分析

ROC 分析結(jié)果顯示，模型預(yù)測OV 患者3 年生存率ROC 曲線下面積為0.781（見圖6）。

圖6 OV 預(yù)后模型預(yù)測ROC 曲線

3 討論

OV的高死亡率主要歸因于其隱匿性和缺乏特異性的早期癥狀，導(dǎo)致大多數(shù)患者在就診時病情已處于晚期[10]。OV 的早期癥狀不明顯，往往被忽視或誤診，導(dǎo)致大部分患者在確診時已經(jīng)進(jìn)入晚期。此時，OV 已經(jīng)擴散到其他器官，難以進(jìn)行手術(shù)切除，從而嚴(yán)重影響患者的生存率和生活質(zhì)量。在正常條件下，細(xì)胞會通過抗氧化系統(tǒng)來維持鐵離子平衡，以防止氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷[11-12]。然而，在某些情況下，細(xì)胞無法有效清除過多的鐵離子，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的有害自由基，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞膜的氧化破壞、線粒體功能障礙等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)鐵離子過載時，鐵死亡機制可以被激活，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。lncRNA 可以與染色質(zhì)相互作用，參與染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的調(diào)整和染色質(zhì)修飾的介導(dǎo)。這些作用可以影響染色質(zhì)的開放狀態(tài)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)[14]。在腫瘤中，異常的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和修飾往往伴隨著癌基因的激活和抑癌基因的失活，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。一些lncRNA 被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞凋亡信號通路的調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的生存和死亡決策。此外，lncRNA 也可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和免疫因子的表達(dá)，影響腫瘤對免疫系統(tǒng)的識別和攻擊[15]。本文中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組生存時間顯著低于低風(fēng)險組（P＜0.001），ROC 曲線下面積大于0.7，提示該模型特異性和敏感性較好。

4 結(jié)論

文中基于TCGA 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了OV 預(yù)后模型，最終篩選了10 個相關(guān)的lncRNA，并基于這些lncRNA 構(gòu)建了敏感度和特異度較高的預(yù)測模型。在今后的工作中，我們將進(jìn)一步對研究中涉及的lncRNA 進(jìn)行分子實驗驗證，以明確其在OV 發(fā)生中的具體作用機制。總之本研究結(jié)果為OV 治療及預(yù)后干預(yù)方案制定提供了一定的參考依據(jù)。