易圣果 曹業(yè)迪 趙雪 盧桂芝 張楊 叢鐵川 張瀾波 張繼新 梁振威 屈晨雪 張俊清 高瑩

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（8217030553）

引用本文：易圣果，曹業(yè)迪，趙雪，等. Zeste同源物2增強(qiáng)子在橋本甲狀腺炎B淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)及其抑制劑的治療機(jī)制及效果研

究［J］. 中國全科醫(yī)學(xué)，2024，27（21）：2639-2645. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0623.［www.chinagp.net］

YI S G，CAO Y D，ZHAO X，et al. EZH2 expression in B cell lymphocyte subsets of Hashimoto's thyroiditis and the therapeutic mechanism and effect of its inhibitors［J］. Chinese General Practice，2024，27（21）：2639-2645.

? Editorial Office of Chinese General Practice. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.

【摘要】 背景 甲狀腺自身抗體是診斷橋本甲狀腺炎（HT）的標(biāo)志，B淋巴細(xì)胞在HT的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Zeste同源物2增強(qiáng)子（EZH2）是一種表觀遺傳學(xué)蛋白，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育與功能調(diào)控中扮演重要角色。目的 本研究探討EZH2在HT甲狀腺組漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步探討EZH2抑制劑在實(shí)驗(yàn)性自身免疫甲狀腺炎（EAT）模型中的治療作用。方法 收集北京大學(xué)第一醫(yī)院2010—2020年6例行甲狀腺手術(shù)的患者，取腫瘤對側(cè)的甲狀腺組織（HT及正常甲狀腺組織各3例），通過RNA-seq篩選B淋巴細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況；收集16例HT患者的甲狀腺組織和8例健康對照（HD）甲狀腺組織，分別利用免疫組化及免疫熒光驗(yàn)證EZH2在HT甲狀腺組織中B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)；收集25例HT甲狀腺細(xì)針穿刺液（FNA）、19例HT外周血以及12例健康人外周血樣本應(yīng)用流式細(xì)胞分析檢測EZH2在漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞中的表達(dá)改變。將15只7周齡NOD.H-2h4小鼠EAT模型分為對照組（n=5）、EAT無注射（n=5）或注射EZH2抑制劑GSK126處理組（10 mg/kg，腹腔注射3次/周，n=5），8周后觀察甲狀腺炎癥程度及甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平的改變。結(jié)果 RNA-seq結(jié)果顯示，相較于正常甲狀腺組織，HT甲狀腺組織中EZH2水平上調(diào)，一些與B淋巴細(xì)胞表型相關(guān)的基因例如CD19、CD27、CD38、CD52相應(yīng)增加。免疫組化結(jié)果顯示，16例HT甲狀腺組織標(biāo)本中EZH2免疫組化染色均可在生發(fā)中心（GC）見到陽性細(xì)胞，呈強(qiáng)陽性，8例正常甲狀腺組織染色中未觀察到陽性細(xì)胞。HT甲狀腺組織中EZH2染色高表達(dá)在GC區(qū)，EZH2特異性地表達(dá)在CD19+B淋巴細(xì)胞中。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示HT FNA樣本中CD19+B淋巴細(xì)胞、漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞比例均高于HD外周血、HT外周血樣本（P<0.01），HT FNA樣本中EZH2在CD19+B淋巴細(xì)胞、漿母細(xì)胞中的陽性比例高于HT外周血（P<0.005）。小鼠實(shí)驗(yàn)中，EAT組甲狀腺的淋巴細(xì)胞浸潤較對照組增加。GSK126處理組炎癥程度評分和TgAb水平高于對照組，低于EAT組（P<0.001）。結(jié)論 EZH2在HT甲狀腺組織CD19+B淋巴細(xì)胞中表達(dá)異常升高，可能促進(jìn)了B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)自身抗體生成破壞甲狀腺，EZH2抑制劑可以減緩EAT模型甲狀腺炎癥程度。漿母細(xì)胞中EZH2表達(dá)增加可能參與了HT的發(fā)病機(jī)制，EZH2可能成為治療HT的新靶點(diǎn)，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

【關(guān)鍵詞】 橋本甲狀腺炎；B淋巴細(xì)胞亞群；Zeste同源蛋白2增強(qiáng)子；甲狀腺功能減退癥；靶向治療

【中圖分類號】 R 581.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0623

EZH2 Expression in B Cell Lymphocyte Subsets of Hashimoto's Thyroiditis and the Therapeutic Mechanism and Effect of Its Inhibitors

YI Shengguo1，CAO Yedi1，ZHAO Xue1，LU Guizhi1，ZHANG Yang1，CONG Tiechuan2，ZHANG Lanbo3，ZHANG Jixin4，LIANG Zhenwei5，QU Chenxue6，ZHANG Junqing1，GAO Ying1*

1 Department of Endocrinology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

2 Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

3 Department of Thyroid and Breast Surgery，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

4 Department of Pathology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

5 Department of Ultrasound Medicine，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

6 Department of Clinical Laboratory，Peking University First Hospital，Beijing 100034，China

*Corresponding author：GAO Ying，Professor/Chief physician/Doctoral supervisor；E-mail：gaoyingpkufh@bjmu.edu.cn

【Abstract】 Background Thyroid autoantibody is a marker for the diagnosis of Hashimoto's thyroiditis（HT），and B cells are essential in the pathogenesis of HT. Enhancer of Zeste homolog 2（EZH2），which is an important epigenetic regulator，plays an important role in the regulation of lymphocytes development and function. Objective To investigate EZH2 expression in plasmoblasts and plasma cells in HT，and further explore the therapeutic effect of EZH2 inhibitors in experimental autoimmune thyroiditis（EAT） model. Methods The thyroid tissues from 6 patients who underwent thyroidectomy（3 HT patients with PTC，3 patients with PTC alone） in Peking University First Hospital between 2010 and 2020 were obtained from the contralateral lobe with thyroid cancer，and screened for the expression of B-lymphocyte-related genes by RNA-seq; thyroid tissues from 16 HT patients and 8 normal thyroid tissues were collected and verified for the the expression of EZH2 in B cells in HT thyroid tissues by immunohistochemistry or immunofluorescence，respectively. Fine-needle aspiration（FNA） samples from patients with HT（n=25），and peripheral blood from patients with HT（n=19） or healthy donors（n=12） were analyzed by flow cytometry to define altered EZH2 expression in plasmablasts and plasma cells. Fifteen seven-week-old NOD.H-2h4 mice were randomly divided into the control（n=5），EAT without injection group（n=5），and EZH2 inhibitor+ GSK126 injection group（10 mg/kg，intraperitoneal injection 3 times /week，n=5）. The degree of thyroid inflammation and changes in TgAb levels were observed after 8 weeks. Results RNA sequencing analysis showed that EZH2 and genes associated with the B-cell phenotype such as CD19，CD27，CD38，CD52 were higher expressed in HT hyroid tissues compared with normal thyroid tissues. Immunohistochemical results showed that immunohistochemical staining for EZH2 in 16 HT thyroid tissue specimens was strongly positive with positive cells observed in the GC region，and no positive cells were observed in the staining of 8 normal thyroid tissues. EZH2 staining in HT thyroid tissue was highly expressed in the GC region，and EZH2 was specifically expressed in CD19+ B cells. The results of flow cytometry assay showed that the proportion of CD19+ B cells，plasmablasts and plasma cells in HT FNA samples was higher than that of HD peripheral blood and HT peripheral blood samples（P<0.01），and the proportion of EZH2 positivity in CD19+ B cells and plasma cells was higher in HT FNA samples than that of HT peripheral blood（P<0.005）. In the mouse experiments，lymphocytic infiltration of the thyroid tissues was increased in the EAT group compared to the control group. In the GSK126 treatment groups，the thyroid inflammatory score and serum TgAb titer were significantly higher than the control group and lower than the EAT group. Conclusion EZH2 over-expression in CD19+ B cells of HT hyroid tissues may promote the differentiation of B cells into plasma cells and auto-antibody production，which leads to the destruction of thyroid tissues. EZH2 inhibitors can slow down the degree of thyroid inflammation in the EAT model. Increased EZH2 expression in plasmablasts may be involved in the pathogenesis of HT. EZH2 may serve as a therapeutic target for HT，although further studies are needed.

【Key words】 Hashimoto thyroiditides；B-lymphocyte subsets；Enhancer of Zeste homolog 2 protein； Hypothyroidism；Targeted therapy

橋本甲狀腺炎（HT）是一種器官特異性的自身免疫性甲狀腺疾?。?-2］，是甲狀腺功能減退（簡稱甲減）的主要病因，而甲減可造成患者生活質(zhì)量低下甚至威脅生命［3］。目前HT臨床治療主要集中在對癥及針對甲減的替代治療。因此需要進(jìn)一步深入探討HT發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新的治療手段，減少甲減的出現(xiàn)。

HT的發(fā)病機(jī)制與浸潤在甲狀腺組織中的大量的淋巴細(xì)胞例如組織病理切片可見的生發(fā)中心（GC）中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等以及產(chǎn)生的自身抗體直接有關(guān)［2，4］。近年來越來越多的研究表明，除了遺傳和環(huán)境因素外，表觀遺傳因子的調(diào)節(jié)協(xié)同作用也可以促進(jìn)HT的發(fā)生［1，5-6］。Zeste同源物2增強(qiáng)子（EZH2）是一種重要的表觀遺傳學(xué)蛋白，在免疫系統(tǒng)如淋巴細(xì)胞的發(fā)育與功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用［7］。有研究發(fā)現(xiàn)EZH2能通過表觀遺傳學(xué)作用參與如系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致的狼瘡腎炎、炎癥性腸病等自身免疫疾病的發(fā)病過程，EZH2異常升高能夠促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞的黏附、遷移，激活B淋巴細(xì)胞及調(diào)控漿細(xì)胞分化，促進(jìn)抗體產(chǎn)生［8-9］，而EZH2抑制劑則能夠抑制自身抗體形成［10-11］，因而可能是未來治療自身免疫性疾病的新靶點(diǎn)。本研究擬探討EZH2在HT甲狀腺組織中B淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況，在體內(nèi)試驗(yàn)中使用EZH2抑制劑探索緩解實(shí)驗(yàn)性自身免疫甲狀腺炎（EAT）小鼠模型甲狀腺炎的效果，為未來EZH2小分子抑制劑用于HT的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本研究過程：首先通過RNA-seq檢測HT和正常甲狀腺中基因表達(dá)差異，再通過對HT甲狀腺病理切片進(jìn)行免疫組化和免疫熒光探索EZH2在CD19+B淋巴細(xì)胞共定位表達(dá)模式；在此基礎(chǔ)上，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測HT的甲狀腺細(xì)針穿刺液和外周血的B淋巴細(xì)胞亞群分布差異以及EZH2的異常表達(dá)；最后在使用EZH2抑制劑的EAT小鼠模型上檢測甲狀腺組織淋巴細(xì)胞浸潤程度、外周血TgAb水平變化。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 研究對象和標(biāo)本采集：標(biāo)本來源為北京大學(xué)第一醫(yī)院，主要分3部分。第1部分，取甲狀腺癌術(shù)后腫瘤對側(cè)病理明確為HT（年齡35～51歲）、健康對照（HD）甲狀腺組織（年齡22～59歲）各3例（2017年1月—2018年1月），提取RNA以備RNA-seq檢測；第2部分，取16例HT患者甲狀腺癌術(shù)后組織病理切片和8例HD甲狀腺組織（以遠(yuǎn)離甲狀腺乳頭狀癌的甲狀腺組織作為病理對照）切片（2010年1月—2020年1月）用于免疫組化及免疫熒光檢測EZH2在HT中的表達(dá)模式；第3部分，收集12例HD者（年齡22～62歲）及19例HT患者（年齡25～67歲）的外周血及25例HT患者（年齡27～74歲）甲狀腺細(xì)針穿刺液（FNA），采用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測B淋巴細(xì)胞亞群及EZH2的表達(dá)（2019年1月—2020年1月）。本研究獲得北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2020科研062）。

1.1.2 HT患者診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)甲狀腺自身抗體結(jié)合甲狀腺B超、術(shù)后病理或者細(xì)針穿刺病理確診為HT。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理檢查顯示合并其他甲狀腺疾?。唬?）患其他腫瘤等疾病，特別與EZH2相關(guān)的腫瘤，例如黑色素瘤、肺癌、膀胱癌等；（3）妊娠及影響甲狀腺激素結(jié)合球蛋白水平的疾??；（4）白血病、淋巴瘤等B淋巴細(xì)胞異常的疾??；（5）系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病等其他甲狀腺以外的自身免疫疾病。

健康對照者納入標(biāo)準(zhǔn)：健康人群，甲狀腺功能正常，甲狀腺自身抗體陰性，甲狀腺超聲正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有甲狀腺疾病病史和家族史；（2）患自身免疫性疾病、腫瘤等其他疾病。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物：NOD.H-2h4雌鼠均購置于賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院動物管理委員會批準(zhǔn)（編號：J2023021）。實(shí)驗(yàn)過程均符合中國衛(wèi)生部動物管理規(guī)范。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器：EZH2抗體（Cell Signaling Technology，美國），CD19（Biolegend，美國），免疫組化試劑盒（PV9000，中杉金橋），F(xiàn)ITC-CD19、BV510-CD27、PerCp-Cy5.5-CD38、APC-CD138、PE-Cy7-IgD、BV421-EZH2（Biolegend，美國），羊抗鼠/兔熒光二抗（Invitrogen，Alxaflour 488/595，美國），GSK126（Selleck，美國），裂解溶液（BD，美國），牛甲狀腺球蛋白（bTg，Sigma-Aldrich，美國），激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國），流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA-seq檢測：使用商品化試劑盒提取新鮮甲狀腺組織（第1部分）的RNA，由上海伯豪生物技術(shù)有限公司對生物樣本進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)分析采用Fold-change（表達(dá)差異倍數(shù)）以及t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對差異基因進(jìn)行篩選，篩選條件：Fold Change（linear）<0.5或者Fold Change（linear）>1.5。

1.2.2 免疫組化：將甲狀腺標(biāo)本（第2部分）的石蠟組織切片，進(jìn)行烤片脫蠟，脫水、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶滅活和封閉后，EZH2（1∶100）或CD19（1∶100）的抗體孵育，用于免疫組織化學(xué)染色。二抗（PV9000，中杉金橋）在室溫下孵育30 min進(jìn)行顯色，再經(jīng)沖洗、復(fù)染、脫水、透明等步驟后封固。

1.2.3 免疫熒光與激光共聚焦：將制備的石蠟組織切片烤片脫蠟后進(jìn)行脫水、檸檬酸鹽緩沖液95 ℃修復(fù)

25 min，3%過氧化氫在室溫下孵育15 min。EZH2（1∶400）和CD19（1∶500）一起孵育，用于免疫熒光。羊抗鼠/兔熒光二抗（Alxaflour 488/595）在室溫下孵育2 h，用含有DAPI的熒光染料封片。使用Leica激光共聚焦顯微鏡，選取405/488/543激光觀察相應(yīng)指標(biāo)在目的細(xì)胞著色情況。

1.2.4 流式細(xì)胞染色：依據(jù)文獻(xiàn)［12-13］，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測（第3部分）B淋巴細(xì)胞比例以及EZH2表達(dá)。按照流式樣品要求使用裂解溶液（BD，San Diego，CA，USA）裂解紅細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液。用FITC-CD19、BV510-CD27、PerCp-Cy5.5-CD38、APC-CD138、BV421-EZH2（均1∶100）、PE-Cy7-IgD（1∶200）在室溫下染色30 min。同種型匹配的抗體用作陰性對照，再經(jīng)過洗滌、重懸，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀上機(jī)并用FACS Diva軟件（BD，San Diego，CA，USA）進(jìn)行分析。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動物分組：使用SPF級的7周齡NOD.H-2h4雌鼠15只，體質(zhì)量20～25 g。采取隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為A、B、C 3組，每組5只，A組野生型對照組：無處理小鼠；B組EAT組：從飼喂碘水開始同時腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，注射3次/周；C組EZH2抑制劑組：從飼喂碘水開始腹腔注射EZH2抑制劑GSK126，10 mg/kg，注射3次/周。B組和C組均飼喂0.05%碘化鈉（NaI）高碘水8周，建立EAT小鼠模型［14］。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8周后殺檢，評估每組小鼠甲狀腺炎癥程度和甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）水平。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)動物甲狀腺炎癥程度評估：留取小鼠甲狀腺組織行免疫組化染色，組織4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作石蠟切片（5 μm）。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，甲狀腺淋巴細(xì)胞浸潤程度以百分比表示，甲狀腺炎癥程度評分標(biāo)準(zhǔn)［14］，0分為甲狀腺無單個核細(xì)胞浸潤；1分為2～3個濾泡間隙有單個核細(xì)胞浸潤；2分為1個濾泡內(nèi)有2～3個浸潤灶；3分為10%～40%區(qū)域被浸潤；4分為41%～80%區(qū)域被浸潤；5分為>80%區(qū)域被浸潤。對每組進(jìn)行炎癥程度評分。

1.2.7 TgAb測定：小鼠眼球采血留取血清，使用ELISA方法檢測TgAb水平，用0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液稀釋商品化bTg終濃度為4 μg/mL進(jìn)行包被，使用PBST洗滌、3%BSA封閉后，小鼠血清按1∶50比例PBST稀釋加入96孔酶標(biāo)板，經(jīng)洗滌、二抗HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG孵育以及顯色后，用酶標(biāo)儀在490 nm吸光度下測定各孔OD值，比較（檢測組OD值-空白對照組OD值）絕對值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 7（GraphPad Software，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析及作圖，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（x-±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單向方差分析（ANOVA）；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA-seq檢測結(jié)果

對HT、正常甲狀腺組織進(jìn)行RNA-seq檢查結(jié)果顯示，相較于正常甲狀腺組織，HT甲狀腺組織中EZH2水平上調(diào)，一些與B淋巴細(xì)胞表型相關(guān)的基因例如CD19、CD27、CD38、CD52相應(yīng)增加，見圖1。

2.2 免疫組化結(jié)果

16例HT甲狀腺組織標(biāo)本中EZH2免疫組化染色均可在GC見到陽性細(xì)胞（圖2），呈強(qiáng)陽性，8例正常甲狀腺組織染色中未觀察到陽性細(xì)胞。HT甲狀腺組織中EZH2染色高表達(dá)在GC，而其他區(qū)域則未見陽性染色，連續(xù)切片進(jìn)行CD19染色后，發(fā)現(xiàn)EZH2特異性地表達(dá)在CD19+B淋巴細(xì)胞中（圖2）。進(jìn)一步行免疫熒光EZH2和CD19的雙重染色，顯示EZH2在CD19+B淋巴細(xì)胞特異性高表達(dá)，見圖3。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

HT FNA樣本和外周血樣本中B淋巴細(xì)胞亞群分布流式細(xì)胞圈門見圖4。HT外周血樣本中的CD19+B淋巴細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞的比例，以及漿母細(xì)胞（CD27+CD38+細(xì)胞）、漿細(xì)胞（CD27+CD138+細(xì)胞）在CD19+B淋巴細(xì)胞的比例，與健康對照（HD）外周血樣本比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HT FNA樣本中CD19+B淋巴細(xì)胞在總淋巴細(xì)胞的比例，漿母細(xì)胞、漿細(xì)胞在CD19+B淋巴細(xì)胞的比例均高于HD外周血、HT外周血樣本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

HT FNA樣本中EZH2在CD19+B淋巴細(xì)胞、漿母細(xì)胞中的陽性比例高于HT外周血，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）；EZH2在HT外周血和HT FNA樣本漿細(xì)胞中的陽性比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.4 EAT小鼠模型結(jié)果

EAT組甲狀腺的淋巴細(xì)胞浸潤較對照組增加（圖5）。GSK126處理組炎癥程度評分和TgAb水平高于對照組，低于EAT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見表3。

3 討論

B淋巴細(xì)胞和甲狀腺自身抗體在HT發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。已有研究報(bào)道作為HT標(biāo)志性抗體的TgAb和甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）可通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用（ADCC）和/或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用損傷甲狀腺濾泡細(xì)胞。以B淋巴細(xì)胞為突破口，探索甲狀腺自身抗體產(chǎn)生的機(jī)制，避免其對甲狀腺組織的破壞可能是預(yù)防出現(xiàn)不可逆甲減的方向之一。有研究發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性硬化患者使用選擇性消耗B淋巴細(xì)胞的免疫治療后能夠有效減少疾病復(fù)發(fā)以及新發(fā)炎癥［15-16］，因此B淋巴細(xì)胞可能是自身免疫疾病治療的新靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)HT患者甲狀腺中B淋巴細(xì)胞亞群例如漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞分布異常，證實(shí)B淋巴細(xì)胞在HT發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步結(jié)果提示HT患者甲狀腺組織的GCs中，EZH2在CD19+B淋巴細(xì)胞上特異性過表達(dá)，且EZH2在漿母細(xì)胞中水平升高。EZH2屬于多梳蛋白家族的一種，是多梳抑制蛋白復(fù)合物2（PRC2）催化活性的亞單位之一［17］，也是表觀遺傳學(xué)中重要的調(diào)控蛋白。EZH2能通過組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)調(diào)控染色體折疊從而抑制基因的表達(dá)［18］，也能通過甲基化非組蛋白靶點(diǎn)或直接與其他蛋白相互作用這兩種非依賴PRC2的方式，激活下游基因［19］。有文獻(xiàn)報(bào)道，EZH2在免疫系統(tǒng)能夠抑制B淋巴細(xì)胞分化基因表達(dá)，調(diào)控B淋巴細(xì)胞分化，其次能維持抗體基因隨機(jī)突變，促進(jìn)抗體多樣化和親和力成熟［7］。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征一些自身免疫疾病中EZH2發(fā)揮著重要作用，能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、分泌抗體［8-9］。因此推測HT甲狀腺組織中，EZH2在CD19+B淋巴細(xì)胞，尤其是漿母細(xì)胞中的異常表達(dá)升高，可能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺自身免疫抗體的生成，不斷加速破壞甲狀腺濾泡細(xì)胞，導(dǎo)致不可逆的甲減出現(xiàn)。因此EZH2在HT甲狀腺組織中的B淋巴細(xì)胞分化過程中可能發(fā)揮重要作用，其可能是治療HT的新靶點(diǎn)。

EZH2在不同的自身免疫疾病中致病機(jī)制不同，大部分研究證明EZH2通過表觀遺傳學(xué)作用抑制/激活下游基因或信號通路促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化、功能以及抗體產(chǎn)生，但也有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸炎和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中，通過介導(dǎo)Toll樣受體（TLR）誘導(dǎo)的促炎基因表達(dá)，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活從而促進(jìn)自身免疫炎癥反應(yīng)；炎癥性腸病中EZH2抑制髓源抑制細(xì)胞功能促進(jìn)炎癥發(fā)展［11，20］。因此EZH2在自身免疫疾病中扮演著不同的角色，需要更加深入挖掘其機(jī)制。本研究在EAT模型中應(yīng)用8周EZH2抑制劑GSK126，甲狀腺HE染色評估淋巴細(xì)胞浸潤程度以及檢測血清TgAb水平顯示，EAT模型的甲狀腺炎癥程度明顯緩解。既往有研究發(fā)現(xiàn)EZH2升高促進(jìn)了多發(fā)性硬化癥、狼瘡患者自身抗體的生成［9，21］，抑制EZH2能緩解自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和炎癥性腸病的進(jìn)程［11，22］。本研究觀察到了EZH2抑制劑在EAT模型中相似的免疫抑制作用。目前越來越多的特異性針對EZH2表觀遺傳作用的藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，GSK126是其中一個強(qiáng)有效的EZH2酶促抑制劑，在臨床前和臨床試驗(yàn)中被證實(shí)能夠廣泛地降低EZH2甲基化轉(zhuǎn)移酶活性水平，能有效地抑制EZH2在疾病中致病作用［23］，本研究提示EZH2抑制劑在HT的治療中可能具有很大的發(fā)展前景及轉(zhuǎn)化意義。

此外，本研究結(jié)果顯示，與HD者相比，HT患者的外周血樣本中B淋巴細(xì)胞亞群的分布沒有改變，但HT患者FNA樣本中CD19+細(xì)胞百分比明顯增加，尤其是漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞，支持HT是器官特異性自身免疫紊亂。本研究結(jié)果提示，F(xiàn)NA樣本比外周血樣本在表現(xiàn)HT自身免疫特點(diǎn)時，更具代表性。既往文獻(xiàn)研究中也認(rèn)為HT的特征是甲狀腺的淋巴細(xì)胞包括B、T淋巴細(xì)胞浸潤，而B淋巴細(xì)胞功能異常、自身抗體形成是自身免疫性甲狀腺疾病中主要的免疫反應(yīng)［6］。

本研究存在局限性：首先，僅研究了HT患者中EZH2的表達(dá)，并沒有探討HT患者中EZH2陽性細(xì)胞B淋巴細(xì)胞亞群的功能和可能的致病機(jī)制。未來，需要進(jìn)一步的功能研究來證實(shí)EZH2在調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞分化和刺激漿母細(xì)胞分化成漿細(xì)胞中的作用，在細(xì)胞水平及動物水平上進(jìn)行驗(yàn)證。其次，EZH2異常升高的上游調(diào)控機(jī)制尚未明確，需要進(jìn)一步探索。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)EZH2在HT中異常表達(dá)升高有可能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，從而促進(jìn)甲狀腺自身抗體生成，使用EZH2抑制劑則可以緩解小鼠模型甲狀腺炎癥程度。漿母細(xì)胞EZH2表達(dá)增加可能參與了HT的發(fā)病機(jī)制。EZH2可能作為未來HT的治療靶點(diǎn)，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

作者貢獻(xiàn)：易圣果提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，研究命題提出，部分實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施，論文起草；曹業(yè)迪、趙雪負(fù)責(zé)樣本采集，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究過程的實(shí)施；盧桂芝、張楊負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、采集、清洗等；叢鐵川、張瀾波負(fù)責(zé)患者篩選、甲狀腺樣本收集；張繼新負(fù)責(zé)甲狀腺病理診斷；梁振威負(fù)責(zé)甲狀腺B超及影像學(xué)選取、數(shù)據(jù)留存；屈晨雪負(fù)責(zé)臨床檢驗(yàn)指標(biāo)化驗(yàn)與檢測；張俊清負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制與審查，監(jiān)督管理；高瑩負(fù)責(zé)研究命題的設(shè)計(jì)、方案修正，最終版本修訂，文章的審查，對文章整體負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。

參考文獻(xiàn)

RALLI M，ANGELETTI D，F(xiàn)IORE M，et al. Hashimoto's thyroiditis：an update on pathogenic mechanisms，diagnostic protocols，therapeutic strategies，and potential malignant transformation［J］. Autoimmun Rev，2020，19（10）：102649. DOI：10.1016/j.autrev.2020.102649.

MCLACHLAN S M，RAPOPORT B. Breaking tolerance to thyroid antigens：changing concepts in thyroid autoimmunity［J］. Endocr Rev，2014，35（1）：59-105. DOI：10.1210/er.2013-1055.

DE LEO S，LEE S Y，BRAVERMAN L E. Hyperthyroidism［J］. Lancet，2016，388（10047）：906-918. DOI：10.1016/S0140-6736（16）00278-6.

BRIX T H，HEGED?S L. Twin studies as a model for exploring the aetiology of autoimmune thyroid disease［J］. Clin Endocrinol，2012，76（4）：457-464. DOI：10.1111/j.1365-2265.2011.04318.x.

CA?AS C A，CA?AS F，BONILLA-ABAD?A F，et al. Epigenetics changes associated to environmental triggers in autoimmunity［J］. Autoimmunity，2016，49（1）：1-11. DOI：10.3109/08916934.2015.1086996.

WANG B，SHAO X Q，SONG R H，et al. The emerging role of epigenetics in autoimmune thyroid diseases［J］. Front Immunol，2017，8：396. DOI：10.3389/fimmu.2017.00396.

NUTT S L，KEENAN C，CHOPIN M，et al. EZH2 function in immune cell development［J］. Biol Chem，2020，401（8）：933-943. DOI：10.1515/hsz-2019-0436.

HE C M，YANG Y L，CHEN Z L，et al. EZH2 promotes T follicular helper cell differentiation through enhancing STAT3 phosphorylation in patients with primary sj?gren's syndrome［J］. Front Immunol，2022，13：922871. DOI：10.3389/fimmu.2022.922871.

ZHANG M Z，IWATA S，HAJIME M，et al. Methionine commits cells to differentiate into plasmablasts through epigenetic regulation of BTB and CNC homolog 2 by the methyltransferase EZH2［J］. Arthritis Rheumatol，2020，72（7）：1143-1153. DOI：10.1002/art.41208.

ZHEN Y X，SMITH R D，F(xiàn)INKELMAN F D，et al. Ezh2-mediated epigenetic modification is required for allogeneic T cell-induced lupus disease［J］. Arthritis Res Ther，2020，22（1）：133. DOI：10.1186/s13075-020-02225-9.

ZHOU J，HUANG S，WANG Z Y，et al. Targeting EZH2 histone methyltransferase activity alleviates experimental intestinal inflammation［J］. Nat Commun，2019，10（1）：2427. DOI：10.1038/s41467-019-10176-2.

DISANO K D，GILLI F，PACHNER A R. Memory B cells in multiple sclerosis：emerging players in disease pathogenesis［J］. Front Immunol，2021，12：676686. DOI：10.3389/fimmu.2021.676686.

SANZ I，WEI C，JENKS S A，et al. Challenges and opportunities for consistent classification of human B cell and plasma cell populations［J］. Front Immunol，2019，10：2458. DOI：10.3389/fimmu.2019.02458.

ZHAO N，WANG Z Z，CUI X J，et al. In vivo inhibition of microRNA-326 in a NOD.H-2h4 mouse model of autoimmune thyroiditis［J］. Front Immunol，2021，12：620916. DOI：10.3389/fimmu.2021.620916.

HAUSER S L，BAR-OR A，COHEN J A，et al. Ofatumumab versus teriflunomide in multiple sclerosis［J］. N Engl J Med，2020，383（6）：546-557. DOI：10.1056/NEJMoa1917246.

HAUSER S L，BAR-OR A，COMI G，et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis［J］. N Engl J Med，2017，376（3）：221-234. DOI：10.1056/NEJMoa1601277.

RINGROSE L，PARO R. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins［J］. Annu Rev Genet，2004，38：413-443. DOI：10.1146/annurev.genet.38.072902.091907.

HERVIOU L，CAVALLI G，CARTRON G，et al. EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies［J］. Oncotarget，2016，7（3）：2284-2296. DOI：10.18632/oncotarget.6198.

KIM J，LEE Y，LU X D，et al. Polycomb- and methylation-independent roles of EZH2 as a transcription activator［J］. Cell Rep，2018，25（10）：2808-2820.e4. DOI：10.1016/j.celrep.2018.11.035.

ZHANG X L，WANG Y，YUAN J，et al. Macrophage/microglial Ezh2 facilitates autoimmune inflammation through inhibition of Socs3［J］. J Exp Med，2018，215（5）：1365-1382. DOI：10.1084/jem.20171417.

TSOU P S，COIT P，KILIAN N C，et al. EZH2 modulates the DNA methylome and controls T cell adhesion through junctional adhesion molecule A in lupus patients［J］. Arthritis Rheumatol，2018，70（1）：98-108. DOI：10.1002/art.40338.

WU L L，JIANG X Y，QI C J，et al. EZH2 inhibition interferes with the activation of type I interferon signaling pathway and ameliorates lupus nephritis in NZB/NZW F1 mice［J］. Front Immunol，2021，12：653989. DOI：10.3389/fimmu.2021.653989.

DUAN R，DU W F，GUO W J. EZH2：a novel target for cancer treatment［J］. J Hematol Oncol，2020，13（1）：104. DOI：10.1186/s13045-020-00937-8.

（收稿日期：2023-08-20；修回日期：2023-12-10）

（本文編輯：趙躍翠）