劉蘭,李鵬,王通,黃筱萍

(江西省科學(xué)院微生物研究所,江西 南昌,330096)

乳酸又名2-羥基丙酸(2-hydroxy propanoic acid),作為生物基大宗化學(xué)品,在化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。根據(jù)乳酸的旋光性質(zhì)可分為L-乳酸、DL-乳酸和D-乳酸[1-4]。目前全球乳酸行業(yè)主要是以生產(chǎn)DL-乳酸和L-乳酸為主,僅有少數(shù)幾家企業(yè)能生產(chǎn)D-乳酸,且產(chǎn)量很低。隨著可生物降解的綠色環(huán)保塑料聚乳酸(polylactic acid,PLA)的興起,對(duì)高光學(xué)純度L-乳酸、D-乳酸的需求量急劇增加[5-6]。以L-乳酸為原料制成的聚L-乳酸(PLLA)存在多種性能不穩(wěn)定的缺點(diǎn),通過在PLLA中加入一定量的聚D-乳酸(PDLA)進(jìn)行共混,形成的聚乳酸(scPLA)具有更高的溶解溫度和更好的機(jī)械性能[7],可用于高附加值工程塑料領(lǐng)域和改善PLA性能拓展等領(lǐng)域,但對(duì)制備PLA的原料L-乳酸和D-乳酸的光學(xué)純度有很高的要求[8-10]。微生物利用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,大多數(shù)乳酸菌只產(chǎn)生DL-乳酸[11-12],只有極少數(shù)的菌株和一些工程改造菌能生產(chǎn)高光學(xué)純度的L-乳酸或D-乳酸[13-14]。尤其是D-乳酸在發(fā)酵菌種的多樣性及發(fā)酵水平方面存在較大的差距,光學(xué)純度難以達(dá)到生產(chǎn)聚合級(jí)乳酸標(biāo)準(zhǔn),遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足PLA工業(yè)市場(chǎng)的需要。盡管國內(nèi)外眾多學(xué)者多年來已經(jīng)在發(fā)酵法生產(chǎn)L-或D-乳酸取得了很多的研究成果,但仍存在光學(xué)純度低、產(chǎn)酸低或發(fā)酵周期長等問題[15-19]。孫家奪等[20]報(bào)道了利用Sporolactobacillussp.YBS1-5發(fā)酵90 h,D-乳酸產(chǎn)量為111.8 g/L,產(chǎn)酸速率為1.24 g/(L·h),光學(xué)純度為98.0%。胡中華等[21]采用凝結(jié)芽孢桿菌JD-DFT011發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸,在套接菌種量為28%時(shí),L-乳酸最高光學(xué)純度和回收率分別達(dá)99.80%和98.57%。通過基因改造在獲得高光學(xué)純度L-乳酸和D-乳酸菌方面取得了較大的進(jìn)展。但由于工程菌的穩(wěn)定性及生產(chǎn)上的適用性等原因,菌株在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用亦很困難[22]。因此篩選高光學(xué)純度的L-乳酸或D-乳酸生產(chǎn)菌成為乳酸行業(yè)發(fā)展首要解決的問題,而通過從自然界中分離高光學(xué)純度的L-乳酸或D-乳酸產(chǎn)生菌,是獲得高光學(xué)純度乳酸生產(chǎn)菌的有效方法。

基于自然界產(chǎn)乳酸的菌株十分豐富,本研究旨在通過建立高效的篩選方法,分離獲得高光學(xué)純度的L-乳酸或D-乳酸產(chǎn)生菌,作為后續(xù)菌種改良和發(fā)酵調(diào)控的出發(fā)菌株。為工業(yè)化生產(chǎn)提供高產(chǎn)酸量、高光學(xué)純度的優(yōu)良菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本采集

從江西省安義縣鳳凰山桃園、南豐縣羅里石蜜桔種植基地、贛州信豐縣裕和臍橙種植基地、九江市葡萄種植基地、福建莆田和龍巖的龍眼、荔枝種植基地的果園土壤、腐爛果實(shí)和樹皮中采集樣品,以及在市售的酸菜、泡菜中采集樣品,裝入無菌的采樣袋中,置4 ℃冰箱保存。

1.1.2 儀器與試劑

BX43相差生物顯微鏡,美國OLYMPUS公司;D30分光光度計(jì),德國Eppendorf股份公司;Arktik多功能PCR儀,賽默飛世爾科技有限公司;2695e高壓液相色譜儀、2414示差檢測(cè)器、2489紫外檢測(cè)器,美國Waters公司;Practum 224-ICN分析天平,德國Sartorius公司;H1650-W高速離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博迅儀器有限公司;SW-CJ-1CU潔凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣設(shè)備有限公司。

厭氧產(chǎn)氣袋(規(guī)格350 mL和2.5 L)、培養(yǎng)袋(規(guī)格15 cm×30 cm和2.5 L)、氧氣指示劑,日本三菱株式會(huì)社;DL-乳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品,美國SIGMA公司;輕質(zhì)碳酸鈣,廣西西隴化工有限公司;葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉等試劑,生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10、酵母粉10、蛋白胨5、KH2PO40.25、K2HPO40.25、MgSO4·7H2O 0.4、MnSO4·5H2O 0.02、FeSO4·7H2O 0.02、NaCl 0.02,pH 6.8。

產(chǎn)酸分離培養(yǎng)基(g/L):在MRS液體培養(yǎng)基中加入CaCO35,瓊脂粉18。

種子培養(yǎng)基(g/L):在MRS液體培養(yǎng)基中加入CaCO35。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖120、酵母粉5、蛋白胨5、KH2PO40.25、K2HPO40.25、MgSO4·7H2O 0.4、MnSO4·5H2O 0.02、NaCl 0.02、CaCO355。

1.2.2 樣品的分離與純化

取0.25 g樣品加入5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中,置于放有厭氧產(chǎn)氣袋和O2指示劑的培養(yǎng)袋中,密封后于37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)48 h,富集厭氧菌。定量量取15 mL產(chǎn)酸分離培養(yǎng)基倒入φ9 cm無菌平皿中,取0.1 mL富集后的菌液進(jìn)行梯度稀釋度,稀釋液涂布于平皿中,稀釋液菌濃度以每平皿中長10～100個(gè)菌落為宜,平皿置于放有厭氧產(chǎn)氣袋的培養(yǎng)袋中,密封后于37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察,挑選透明圈大的單菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng),連續(xù)純化3次后,接種于MRS斜面培養(yǎng)基中,同樣條件下厭氧培養(yǎng)48～72 h,置4 ℃冰箱保存。

1.2.3 高光學(xué)純度產(chǎn)乳酸菌株的搖瓶篩選

保存的斜面菌株分別用2 mL的生理鹽水洗脫,全部菌液接入裝有30 mL種子培養(yǎng)液的三角瓶中,置于裝有350 mL厭氧產(chǎn)氣袋和O2指示劑的培養(yǎng)袋,密封后固定在搖床中,于37 ℃、150 r/min厭氧培養(yǎng)16 h。種子液按6%的接種量接種至100 mL發(fā)酵液中,搖瓶發(fā)酵厭氧培養(yǎng)方式同種子液,于37 ℃、180 r/min厭氧培養(yǎng)48 h,取發(fā)酵液按1.2.6節(jié)分析方法檢測(cè)乳酸濃度及光學(xué)純度。篩選產(chǎn)高光學(xué)純度的L型或D型乳酸菌株進(jìn)行菌種鑒定和進(jìn)一步發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.4 高光學(xué)純度產(chǎn)乳酸菌株的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將不同菌株分別涂布于產(chǎn)酸分離培養(yǎng)基中37 ℃、厭氧培養(yǎng)48 h后,觀察菌落形態(tài),同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色,于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化鑒定

將純化的產(chǎn)酸菌分別接種于不同的生理生化培養(yǎng)基中,參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[23]和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[24]對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.4.3 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增與分析

提取待測(cè)菌株的基因組DNA,以引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGRECA-3′)擴(kuò)增16S rDNA。PCR反應(yīng)條件:95 ℃、5 min預(yù)變性;94 ℃、30 s變性,57 ℃、30 s退火,72 ℃、90 s延伸,30個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min延伸,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序及全基因序列分析。

系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析:將測(cè)序獲得16S rDNA序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索比對(duì),結(jié)果采用MEGA8.0中的鄰接法(neihbor-joining tree)進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建,并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1 000次可信度分析。

1.2.5 高光學(xué)純度產(chǎn)乳酸菌株發(fā)酵性能研究

1.2.5.1 生長曲線的測(cè)定

將待測(cè)菌株按5%接種量接種于MRS培養(yǎng)液中,于37 ℃、150 r/min厭氧培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣,用分光光度計(jì)測(cè)定波長600 nm處的OD值,獲得生長曲線。

1.2.5.2 種子液培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)

菌株分別接種于種子培養(yǎng)液中,依據(jù)不同菌株的最佳種齡于37 ℃、150 r/min厭氧培養(yǎng)12～18 h,按6%的接種量接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)液中,于37 ℃、180 r/min厭氧培養(yǎng)72 h,每12 h取樣測(cè)定乳酸含量和殘?zhí)?發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定光學(xué)純度。

1.2.6 檢測(cè)方法

1.2.6.1 乳酸和葡萄糖含量測(cè)定

發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min,取上清液,稀釋,用0.22 μm聚醚水性濾膜過濾,采用Waters e2695 Alliance高效液相色譜分離單元和Waters 2414示差檢測(cè)器進(jìn)行分析。色譜條件:色譜柱TOSOH Tskgel OApak-P+OApak-A(300 mm×7.8 mm,5 μm);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相0.75 mmol/L H2SO4;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線計(jì)算發(fā)酵液中乳酸和糖含量。

1.2.6.2 乳酸光學(xué)純度測(cè)定

將發(fā)酵液中乳酸含量稀釋至1 g/L左右,采用Waters e2695 Alliance高效液相色譜分離單元和Waters 2489UV/Vis紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析。色譜條件:色譜柱 SUMICHIRAL OA-5000(4.6 mm×150 mm);柱溫40 ℃;進(jìn)樣量5 μL;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相1 mmol/L CuSO4。根據(jù)面積歸一法計(jì)算乳酸L體或D體含量,如公式(1)、公式(2)所示。

L體光學(xué)純度/%(ee)=(SL-SD)/(SL+SD)×100

(1)

D體光學(xué)純度/%(ee)=(SD-SL)/(SL+SD)×100

(2)

式中:SL,L體峰面積;SD,D體峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)乳酸菌株的初篩、產(chǎn)酸水平及光學(xué)純度初步分析

將采集的100多份樣品通過產(chǎn)酸平皿的篩選純化,獲得77株產(chǎn)酸菌株,通過搖瓶對(duì)產(chǎn)乳酸能力和光學(xué)純度的初步分析,其中2株為產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸菌株,2株產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸菌株,其光學(xué)純度均達(dá)99.80%(ee)以上;另外有58株產(chǎn)DL-乳酸菌株,有些菌株產(chǎn)乳酸較高。表1為具有工業(yè)應(yīng)用潛力的4株產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸菌株和部分高產(chǎn)DL-乳酸菌株的初篩結(jié)果,圖1為4株產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸菌株的光學(xué)純度色譜圖。

圖1 四株高光學(xué)純度乳酸菌株的光學(xué)純度色譜圖Fig.1 Optical purity chromatograms of four high optical purity lactic acid bacteria strains

表1 有潛在應(yīng)用價(jià)值的乳酸菌初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of potential lactic acid bacteria

菌株HA7-5和HJ57為高光學(xué)純度L-乳酸生產(chǎn)菌,L-乳酸光學(xué)純度分別達(dá)到100%和99.88%,菌株HB49-2和HL64-1為高光學(xué)純度D-乳酸生產(chǎn)菌,D-乳酸光學(xué)純度分別達(dá)到100%和99.90%,這4株菌株光學(xué)純度均很高,但乳酸產(chǎn)量偏低,不及大部分DL-乳酸產(chǎn)生菌,可通過進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組成以及誘變技術(shù)和基因定向改造以提高產(chǎn)量。其他6株菌株均為DL-乳酸生產(chǎn)菌,它們?cè)诨A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中乳酸產(chǎn)量很高,其中有4株菌株在發(fā)酵48 h產(chǎn)量均達(dá)到了90 g/L以上,具有潛在的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

2.2 四株產(chǎn)高光學(xué)乳酸菌株的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

4株產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸菌株在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,觀察各菌株菌落形態(tài),以及菌體革蘭氏染色后于100×顯微鏡觀察下菌體形態(tài),見表2及圖2、圖3。

圖2 四株高光學(xué)純度乳酸菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of four high optical purity lactic acid bacteria strains

圖3 四株高光學(xué)純度乳酸菌株的菌體細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cell morphology of four high optical purity lactic acid bacteria strains

表2 菌落及菌體細(xì)胞的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of colonies and cells

2.2.2 菌株生理生化鑒定

將4株產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸的菌株分別接種于相應(yīng)的生理生化培養(yǎng)基,與未接菌的空白組作對(duì)比,通過檢測(cè)各菌株的生理生化特性,根據(jù)革蘭氏染色及生理生化反應(yīng)結(jié)果(表3),參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》,菌株HA7-5、HJ57、HB49-2和HL64-1的主要生理生化特征分別與屎腸球菌、格氏乳球菌、德氏乳桿菌和假腸膜明串株菌的生理生化特征相符。

表3 四株高光學(xué)純度乳酸菌株的主要生理生化特征Table 3 Main physiological and biochemical characteristics of four high optical purity lactic acid bacteria strains

2.2.3 菌株16S rDNA序列分析

為了進(jìn)一步鑒定菌株HA7-5、HJ57、HB49-2及HL64-1,對(duì)其16S rDNA序列分別進(jìn)行了測(cè)定。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示菌株HA7-5、HJ57、HB49-2及HL64-1分別屬于屎腸球菌、格氏乳球菌、德氏乳桿菌及假腸膜明串珠菌,其中菌株HA7-5與E.faeciumVVEswe-R同源性為100%,菌株HJ57與L.garvieaeNBRC100934同源性為100%,菌株HB49-2與L.delbrueckiiATTC9649同源性為99.8%,菌株HL64-1與L.pseudomesenteroidesG29同源性為100%。此外,利用MEGA 8.0中的鄰接法(NJ)構(gòu)建了這些菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定結(jié)果,推測(cè)菌株HA7-5、HJ57、HB49-2及HL64-1分別屬于屎腸球菌亞種、格氏乳球菌亞種、德氏乳桿菌亞種及假腸膜明串珠菌亞種,分別命名為屎腸球菌HA7-5、格氏乳球菌HJ57、德氏乳桿菌HB49-2及假腸膜明串珠菌HL64-1。

a-屎腸球菌HA7-5;b-格氏乳球菌HJ57;c-假腸膜明串株菌HL64-1;d-德氏乳桿菌HB49-2圖4 基于16S rDNA序列BLAST結(jié)果4株高光學(xué)純度乳酸菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees of four high optical purity lactic acid bacteria strains based on 16S rDNA sequence BLAST results

自然界中能產(chǎn)乳酸的微生物很多,但大多數(shù)乳酸菌只產(chǎn)生DL-乳酸,產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸和D-乳酸的乳酸菌極少。相較于L-乳酸,無論在研發(fā)還是實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中,高光學(xué)純度D-乳酸的發(fā)酵菌種屬種多樣性和發(fā)酵水平亦遠(yuǎn)低于L-乳酸。產(chǎn)L-乳酸的乳酸菌相對(duì)分布較廣,產(chǎn)D-乳酸的菌株主要分布在4個(gè)菌屬中:乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、芽孢乳桿菌屬(Sporolactobacillus)和明串株菌屬(Leuconostoc)[25]。通常野生菌株L-乳酸和D-乳酸產(chǎn)量和光學(xué)純度均較低,通過菌株誘變可以大幅度提高產(chǎn)量,但光學(xué)純度很難得到提高。如DEMRIC等[26]用甲基磺酸乙酯(ethyl methylsulfone,EMS)誘變D-乳酸產(chǎn)生菌L.delbrueckiiATCC 9649,D-乳酸產(chǎn)量從67 g/L增長到117 g/L,但光學(xué)純度未有變化,均在97.5%左右。于培星[27]利用鈷60γ-射線輻照凝結(jié)芽孢桿菌JD-063D,使得D-乳酸產(chǎn)量由出發(fā)菌株的61 g/L提高至145 g/L,光學(xué)純度略有增加,達(dá)98.7%。本研究的目的是從自然界中獲得光學(xué)純度高于99.5%(ee)的D型和L型的野生菌株。共篩選獲得了4株高光學(xué)菌株并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA鑒定,其中2株D-乳酸菌L.PseudomesenteroidesHL64-1和L.DelbrueckiiHB49-2的光學(xué)純度(ee值)分別達(dá)到99.90%和100%,發(fā)酵48 h產(chǎn)量分別達(dá)60.39 g/L和52.85 g/L;2株L-乳酸菌E.faeciumHA7-5和L.garvieaeHJ57的光學(xué)純度(ee值)分別達(dá)到100%和99.88%,發(fā)酵48 h產(chǎn)量分別達(dá)48.69 g/L和34.13 g/L。除德氏乳桿菌外,目前還未見到產(chǎn)高光學(xué)純度和高產(chǎn)乳酸的假腸膜明串珠菌、屎腸球菌和格氏乳桿菌的報(bào)道,雖然所分離的高光學(xué)純度乳酸菌乳酸的發(fā)酵水平較低,但光學(xué)純度均非常高,通過基因突變育種、改良培養(yǎng)基組成和優(yōu)化發(fā)酵條件等,有望在產(chǎn)量、發(fā)酵速率及原料多樣性等方面得到較大的提升空間,不僅拓展了高光學(xué)純度生產(chǎn)菌株的多樣性,亦具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

2.3 產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸菌株發(fā)酵性能的初步研究

對(duì)4株產(chǎn)高光學(xué)純度乳酸的菌株進(jìn)行了生長曲線測(cè)定和發(fā)酵試驗(yàn)。圖5-a為4株菌株的生長曲線,從中可看出,菌株HA7-5、HJ57和HL64-1在6 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,10～12 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期,而菌株HB49-2在12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,16 h進(jìn)入穩(wěn)定期,確定了菌株HA7-5、HJ57、HL64-1和HB49-2種子液種齡分別為12、10、12、16 h。

a-生長曲線;b-葡萄糖含量;c-乳酸含量圖5 4株高光學(xué)純度乳酸菌株發(fā)酵性能Fig.5 Fermentation properties of 4 high optical purity lactic acid bacteria strains

圖5-b和圖5-c為4株菌株在搖瓶發(fā)酵過程中的葡萄糖和乳酸分析結(jié)果。代謝曲線表明菌株HJ57和HL64-1前期產(chǎn)酸速率非?？?發(fā)酵24 h產(chǎn)酸分別達(dá)到30.56 g/L和62.03 g/L,隨后產(chǎn)酸無明顯增長,葡萄糖消耗亦非常緩慢,菌株HL64-1在24 h即可結(jié)束發(fā)酵,其平均產(chǎn)酸速率高達(dá)2.58 g/(L·h)。菌株HA7-5和HB49-2在發(fā)酵前48 h產(chǎn)酸速率和葡萄糖消耗均較快,隨后產(chǎn)酸速率變緩,發(fā)酵72 h乳酸產(chǎn)量分別達(dá)到71.83 g/L和73.14 g/L。4株菌株的光學(xué)純度分析和發(fā)酵結(jié)果見表4,光學(xué)純度均在99.8%(ee)以上。

表4 四株高光學(xué)純度菌株發(fā)酵結(jié)果Table 4 Fermentation results of 4 high optical purity lactic acid bacteria strains

對(duì)4株產(chǎn)高光純度乳酸菌株進(jìn)行的初步搖瓶試驗(yàn)表明,假腸膜明串珠菌HL64-1具有產(chǎn)酸速度快[2.58 g/(L· h)]、D-乳酸光學(xué)純度高99.88%(ee)的優(yōu)點(diǎn),在初始葡萄糖為100 g/L的條件下,發(fā)酵周期僅為24 h,延長發(fā)酵時(shí)間和補(bǔ)加葡萄糖,乳酸產(chǎn)量提高不顯著。德氏乳桿菌HB49-2產(chǎn)D-乳酸光學(xué)純度更高,達(dá)到99.97%(ee),雖然在產(chǎn)酸速率上無明顯優(yōu)勢(shì),但其持續(xù)產(chǎn)酸能力較強(qiáng),通過延長發(fā)酵周期,可獲得較高的產(chǎn)量。屎腸球菌作為一種飼料中常用的益生菌,在畜牧生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用,目前有關(guān)屎腸球菌生產(chǎn)L-乳酸的報(bào)道很少,且產(chǎn)量和光學(xué)純度均較低。屎腸球菌HA7-5的發(fā)酵特征與德氏乳桿菌HB49-2很相似,且具有光學(xué)純度高99.93%(ee)、產(chǎn)量高和生長速率較快的特點(diǎn),可作為替代的益生菌株應(yīng)用于飼料中,亦可為乳酸生產(chǎn)提供具有潛在工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良菌株。格氏乳桿菌產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的研究亦鮮有報(bào)道。針對(duì)不同菌株的代謝特性,進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵工藝條件,或通過誘變技術(shù)提高野生株的產(chǎn)量,為工業(yè)化生產(chǎn)提供高產(chǎn)量及高光學(xué)純度的菌株。

3 結(jié)論

自然界中含有豐富的產(chǎn)乳酸菌株資源,鑒于國內(nèi)外可用于生產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸和D-乳酸細(xì)菌較少,尤其是用于生產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸菌種資源的稀缺,從自然界獲得目標(biāo)菌株是一種有效途徑。本研究依據(jù)乳酸菌的生長特性,探索了一條從不同地區(qū)土壤、不同腐爛果實(shí)和腌漬酸菜中快速篩選、分離具有產(chǎn)高光學(xué)純度L體或D體乳酸菌株的方法,成功分離獲得了4株產(chǎn)高光學(xué)純度的乳酸菌株并進(jìn)行了菌株鑒定。其中2株產(chǎn)L-乳酸菌株分別屬于屎腸球菌(Enterococcusfaecium)HA7-5和格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)HJ57,所產(chǎn)L-乳酸光學(xué)純度均達(dá)99.8%(ee)以上。另2株為產(chǎn)D-乳酸菌株,分別屬于假腸膜明串株菌(Leuconostocpseudomesenteroides)HL64-1和德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)HB49-2,D-乳酸光學(xué)純度亦達(dá)到99.8%(ee)以上。此外,假腸膜明串株菌HL64-1還具有產(chǎn)酸速率非常快的特點(diǎn),其發(fā)酵周期僅24 h;德氏乳桿菌HB49-2菌株產(chǎn)酸較高,發(fā)酵72 h產(chǎn)酸達(dá)73.14 g/L。野生菌株通過培養(yǎng)基、發(fā)酵條件優(yōu)化以及菌種改造或基因定向改造有望進(jìn)一步提高產(chǎn)量,極具潛在的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。隨著高光學(xué)純度的L-乳酸、D-乳酸在PLA材料領(lǐng)域中的開發(fā)和應(yīng)用,全球乳酸的需求量急劇增加。要滿足工業(yè)上制備PLA所需高光學(xué)純度的要求,篩選產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸、D-乳酸及提高產(chǎn)量至關(guān)重要。其中利用基因工程手段構(gòu)建的基因工程菌是一種有效手段,基因工程菌大多具有光學(xué)純度高的特點(diǎn),但其培養(yǎng)營養(yǎng)條件較為苛刻,且底物利用范圍比較窄,相對(duì)于野生菌株粗獷的發(fā)酵條件,目前還難以形成產(chǎn)業(yè)化的競(jìng)爭優(yōu)勢(shì)。因此從自然界中篩選光學(xué)純度高、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短及底物利用范圍廣的乳酸菌株,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供更多的優(yōu)良菌株來源。