姚懷兵,王智瑄,趙仲凱,豆智華,劉穎,吳林英,董靜,陳鋼糧,楊潔*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊,830017)2(新疆駱駝產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,新疆 烏魯木齊,830017)3(新疆旺源生物科技集團(tuán)有限公司,新疆 阿勒泰,836500)

雙峰駝是荒漠地區(qū)重要的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,對(duì)荒漠植物利用率高且具備忍耐極端環(huán)境的適應(yīng)力及免疫系統(tǒng),為偏遠(yuǎn)地區(qū)牧民提供奶、肉、皮及毛等畜產(chǎn)品。駱駝乳具有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白及人體必需氨基酸[1],營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且具有低致敏性,適宜各類(lèi)人群食用,被譽(yù)為“沙漠白金”。

雙峰駝產(chǎn)奶量低于單峰駝,但乳中蛋白質(zhì)含量顯著高于單峰駝,富含乳鐵蛋白、免疫球蛋白、過(guò)氧化物酶、溶菌酶等保護(hù)性蛋白。駝乳在乳類(lèi)中營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值極高,但其開(kāi)發(fā)利用仍處于初級(jí)階段。駝乳中的乳清蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,易于消化吸收,對(duì)新生仔駝的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。其中,α-乳白蛋白是色氨酸和半胱氨酸的主要供體,參與免疫調(diào)節(jié),并具有極高的抗氧化活性[2]。α-乳白蛋白更易被腸道酶類(lèi)(糜蛋白酶和胰蛋白酶等)酶解。駝乳中缺少β-乳球蛋白,可作為牛乳的替代品供給過(guò)敏患者食用。乳鐵蛋白是乳中重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白,具有廣泛生物學(xué)功能,尤其在新生仔畜免疫系統(tǒng)的發(fā)育與完善過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。免疫球蛋白(immunoglobulin G, IgG)是母體輸送給仔畜為其提供被動(dòng)免疫保護(hù)[5]。溶菌酶則與乳鐵蛋白間具有協(xié)同作用,發(fā)揮較強(qiáng)的抗菌活性。α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶4種功能蛋白的特殊生物學(xué)特性及熱敏性與駝乳的開(kāi)發(fā)利用及生產(chǎn)加工息息相關(guān)。此外,與牛乳相比,駝乳中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸豐富,如共軛亞油酸,這些脂肪酸對(duì)機(jī)體具有潛在的生理保護(hù)作用,使得駝乳脂肪酸組成及含量成為國(guó)內(nèi)外研究者重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一。此外,駝乳因其脂肪酸組成符合人類(lèi)健康飲食模式,近些年作為功能食品而受到國(guó)內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注[6]。

目前,國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)雙峰駝常乳期的駝乳成分變化報(bào)道較少。國(guó)內(nèi)僅有關(guān)于雙峰駝在不同飼養(yǎng)條件下乳成分的比較[7]、泌乳前期與中期的氨基酸含量變化[8]及脂肪酸種類(lèi)及含量變化[9-10]的研究,尚未開(kāi)展集約化養(yǎng)殖條件下的駝乳功能性蛋白的研究。國(guó)外研究者僅對(duì)單峰駝泌乳期內(nèi)乳成分(蛋白質(zhì)、脂肪、固體非脂肪、灰分、乳糖和水分等理化指標(biāo))變化規(guī)律[11-14]、礦物質(zhì)含量變化規(guī)律[15]、泌乳曲線類(lèi)型[16]及擠奶機(jī)擠奶時(shí)的泌乳特性[17]進(jìn)行過(guò)報(bào)道。

本研究對(duì)雙峰駝泌乳期330 d內(nèi)的駝乳進(jìn)行采集,基于課題組前期對(duì)多種奶畜乳清蛋白的檢測(cè)方法,使用超高效液相色譜法檢測(cè)駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白含量,基于酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)對(duì)駝乳中IgG含量進(jìn)行檢測(cè),基于比濁法,使用溶菌酶試劑盒對(duì)駝乳中溶菌酶的含量進(jìn)行測(cè)定,使用氣相色譜法對(duì)乳中脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定。探究集約化養(yǎng)殖條件下駝乳中4 種功能性蛋白(α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG與溶菌酶)以及脂肪酸含量在泌乳期內(nèi)變化情況,為深入研究新疆雙峰駝泌乳生理學(xué)及駝乳功能性乳制品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳樣的采集及處理

駝乳,新疆阿勒泰地區(qū)吉木乃縣萬(wàn)駝園養(yǎng)殖區(qū)(海拔539.6 m,經(jīng)緯度E 87°12′09″, N 47°40′34″)飼養(yǎng)的準(zhǔn)噶爾雙峰駝。選取同一飼養(yǎng)環(huán)境下,年齡(相差≤1歲)、胎次且產(chǎn)駝羔時(shí)間相近(相差天數(shù)≤5 d)的20峰泌乳雙峰駝進(jìn)行追蹤。采用舍飼與放牧相結(jié)合飼養(yǎng)管理方式,自由采食飲水,每日分別于5∶00與16∶00(京時(shí))進(jìn)行擠乳操作,并于每日8∶00與19∶00進(jìn)行補(bǔ)飼,飼料配比為玉米∶豆粕∶苜蓿=2∶1∶2(質(zhì)量比),每日8∶00補(bǔ)飼后進(jìn)行放牧,下午擠奶前趕回至圈舍。采樣時(shí),駝乳樣品置于4 ℃冷藏,迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。初乳期為1～7 d,期間每日1次進(jìn)行采集檢測(cè);常乳期為30～330 d,每30 d采集并檢測(cè)1次。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

Camel IgG ELISA試劑盒,上海江萊實(shí)業(yè)股份有限公司;AO50-1-1溶菌酶試劑盒,南京建成生物工程研究所;甲醇、乙腈、正庚烷、15%三氟化硼甲醇及37種脂肪酸混標(biāo)(色譜純),美國(guó)sigma公司;磷酸、BaCl2、Na2HPO4、NaOH、Na2SO4、NaCl、冰乙酸及三氟乙酸(分析純),天津富宇精細(xì)化工有限公司;焦性沒(méi)食子酸(分析純),中國(guó)食品藥品檢定研究院;體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇(化學(xué)純),上海源葉生物科技有限公司;沸程30～60 ℃石油醚(分析純),天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

H-class超高效液相色譜儀,Waters公司;GC-2014氣象色譜儀,美國(guó)島津公司;7890B/5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)安捷倫科技有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵,上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司;GEAKTA蛋白層析儀,美國(guó)通用公司;MULTISKAN Sky全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技有限公司;Power Pac Basic電泳儀,上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 駝乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將駝乳樣品置于4 ℃恒溫離心機(jī),4 000 r/min離心15 min,去上層脂肪,記錄pH值。使用稀釋后的冰乙酸調(diào)節(jié)pH值到4.6,40 ℃水浴30 min加速酪蛋白沉淀,在4 ℃冰箱靜置2 h后,4 ℃ 4 000 r/min離心20 min,將脫脂乳中的酪蛋白沉淀除去,使用飽和NaHCO3溶液將駝乳清液調(diào)回至原始pH值。

1.4.1.1 駝乳α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制備

將上一步處理后的駝乳清組分按照(NH4)2SO4分級(jí)沉淀表對(duì)乳清進(jìn)行0%～20%、20%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～60%、60%～70%、70%～80%、80%～90%、90%～100%的組分分級(jí)沉淀。α-乳白蛋白存在于90%～100%的組分中,收集90%～100%組分,加入少量超純水使沉淀重新溶解并至于透析袋中,在4 ℃條件下,置于蒸餾水中透析脫鹽,1 次/h更換蒸餾水。使用飽和BaCl2來(lái)檢測(cè)透析液中是否殘留(NH4)2SO4,當(dāng)透析液中無(wú)白色沉淀時(shí),透析結(jié)束。經(jīng)50 kDa超濾管透析好的駝乳組分于4 ℃ 2 500 r/min離心10 min,收集超濾管下層的液體。將超濾后的駝乳組分置于培養(yǎng)皿中,密封并在-80 ℃冷凍24 h以上。將冷凍后的樣品置于冷凍干燥機(jī)中,-58 ℃冷凍干燥48 h,獲得90%～100%組分的凍干蛋白樣品。將凍干蛋白進(jìn)行溶解,使用SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4.1.2 駝乳乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制備

取分離得到的駝乳清組分,使用AKTA蛋白純化儀進(jìn)行乳鐵蛋白的純化,選用HiTrapTM Heparin H柱進(jìn)行分離純化。進(jìn)樣量1.0 mL,流速2 mL/min;AKTA流動(dòng)相分別為上樣緩沖液A相:0.2 mol/L Na2HPO4溶液;洗脫緩沖液B相:1 mol/L NaCl+0.05 mol/L Na2HPO4溶液構(gòu)成。收集純化富集后的乳鐵蛋白于透析袋中,置于蒸餾水中透析脫鹽,1次/h更換蒸餾水,透析時(shí)長(zhǎng)為24 h。透析后的乳鐵蛋白溶液分置于培養(yǎng)皿中,-80 ℃冷凍過(guò)夜。隨后將樣品置于冷凍干燥機(jī)中,-58 ℃冷凍干燥48 h,獲得凍干后的駝乳鐵蛋白樣品,將凍干蛋白溶解使用SDS-PAGE檢測(cè)。

1.4.2 駝乳功能蛋白含量的測(cè)定前處理

將冷凍于-80 ℃冰箱駝乳置于40 ℃水中解凍,渦旋5 min,準(zhǔn)確量取10 mL乳樣,加入10 mL超純水,4 ℃ 8 000 r/min離心15 min,去除上層乳脂。使用稀釋后的冰乙酸調(diào)節(jié)乳清pH值至4.6,4 ℃水浴30 min,加速酪蛋白沉淀。隨后經(jīng)4 ℃ 8 000 r/min離心15～20 min,除去乳清中剩余的酪蛋白(一式兩份)。將其中一份乳清,使用超純水定容至50 mL,經(jīng)0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析乳白蛋白含量。同時(shí),將另一份乳清液,使用飽和NaHCO3溶液將乳清調(diào)回至原來(lái)的pH值,以防止蛋白質(zhì)在酸性溶液中變性失活,使用AKTA對(duì)乳清中的乳鐵蛋白進(jìn)行純化,收集純化好的樣液,使用0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析乳鐵蛋白含量。對(duì)于駝乳中IgG與溶菌酶含量測(cè)定前處理,是將冷凍于-80 ℃冰箱駝乳取出置于4 ℃水中緩慢解凍,渦旋混勻后備用,使用前將駝乳水浴至室溫。

1.4.3 色譜條件

1.4.3.1 駝乳α-乳白蛋白色譜條件

使用ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱(300 ?,1.7 μm,21 mm×100 mm,1/pkg)色譜柱;流速0.2 mL/min。流動(dòng)相:A液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸水,B液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm;進(jìn)樣量5 μL;樣品溫度25 ℃;柱溫30 ℃;流動(dòng)相A的梯度變化為:0～2.08 min(75%～68%),2.08～8.34 min(68%～48%),8.34～10.42 min(48%～75%);流動(dòng)相B的梯度變化為0～2.08 min(25%～32%),2.08～8.34 min(32%～52%),8.34～10.42 min(52%～25%)。

1.4.3.2 駝乳乳鐵蛋白色譜條件

使用ACQUITY UPLC Protein BEH C4柱(300 ?,1.7 μm,21 mm×100 mm,1/pkg)色譜柱;流速0.2 mL/min。流動(dòng)相:A液為0.1%三氟乙酸水,B液為乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;進(jìn)樣量4 μL;樣品溫度25 ℃;柱溫30 ℃;流動(dòng)相A的梯度變化為:0～2.08 min(70%～45%),2.08～4.17 min(45%～40%),4.17～5.00 min(40%～70%),5.00～6.67 min(70%);流動(dòng)相B的梯度變化為0～2.08 min(30%～55%),2.08～4.17 min(55%～60%),4.17～5.00 min(60%～30%),5.00～6.67 min(30%)。

1.4.4 駝乳脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣的配制

配制質(zhì)量濃度為20 g/L NaOH-甲醇溶液,振蕩混勻。取20 mg脂肪酸甲酯混標(biāo)至10 mL容量瓶中,用正庚烷(色譜純)定容,配制2 mg/mL的混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于-80 ℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩Ｎ?0 mL解凍后的駝乳,加入100 mg焦性沒(méi)食子酸,依次加入3顆沸石、2 mL的體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇,4 mL超純水及5 mL氨水,置于75 ℃水浴20 min,振蕩頻率4 min/次。待混勻水解,冷卻至室溫后加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇,混勻后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,使用25 mL石油醚沖洗燒杯,并將沖洗液并入分液漏斗中,充分混勻,靜置15 min,收集醚層置于燒瓶中,重復(fù)上述步驟3次。設(shè)置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀水溫為40 ℃,將石油醚旋蒸至干,燒瓶壁上的半不透明殘留物為脂肪的提取物。加入8 mL質(zhì)量濃度為20 g/L NaOH-甲醇溶液,連接回流冷凝器,設(shè)置水浴鍋溫度為80 ℃,使之充分反應(yīng)直至油滴消失。加入7 mL的15%三氟化硼甲醇溶液,反應(yīng)3 min,再加入1 mL超純水沖洗冷凝管,取出燒瓶,迅速冷卻至室溫[18]。加入15 mL正庚烷,振蕩5 min后轉(zhuǎn)移至25 mL試管中,加入2 mL飽和NaCl溶液,靜置15 min。吸取上層澄清透明的正庚烷提取液10 mL,加入8 g Na2SO4,振蕩2 min,靜置15 min,吸取上層溶液,經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中。

1.4.5 氣相色譜條件

選擇HP-FFAP (50.0 m,0.32 mm ID×0.50 μm)色譜柱,檢測(cè)器:氫火焰離子檢測(cè)器(FID);進(jìn)樣器溫度270 ℃;檢測(cè)器溫度280 ℃;進(jìn)樣量10 μL;載氣N2;分流比1∶0;流速0.2 mL/min;總程序時(shí)間95.33 min;升溫程序如下:100～180 ℃,速率12 ℃/min,保留時(shí)間6.00 min;180～200 ℃,速率3 ℃/min,保留時(shí)間20 min;200～230 ℃,速率5 ℃/min,保留時(shí)間50 min;230 ℃,速率5 ℃/min,保留時(shí)間95.33 min。

1.4.6 氣相色譜-質(zhì)譜條件

使用GC-MS對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)與驗(yàn)證,條件為:電子轟擊(EI)電離源;色譜柱:DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。色譜條件:進(jìn)樣口溫度280 ℃;進(jìn)樣量1.0 μL,不分流進(jìn)樣;程序升溫:60 ℃(5 min)以2 ℃/min升至280 ℃(10 min),20 ℃/min升溫至300 ℃(53 min);載氣He,流速1.0 mL/min。質(zhì)譜條件:電離方式,電子轟擊源,電離能量70 eV。離子源溫度230 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,接口溫度280 ℃。掃描方式全掃描,掃描范圍20～500 amu,掃描時(shí)間0.45 s,溶劑延遲3 min[19]。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

對(duì)駝乳樣品重復(fù)檢測(cè)3次。所測(cè)數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。采用SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并使用R語(yǔ)言作圖分析,以P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 駝乳α-乳白蛋白和乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品電泳

駝源性α-乳白蛋白分子質(zhì)量約為14 kDa,乳鐵蛋白分子質(zhì)量約為80 kDa。如SDS-PAGE結(jié)果所示(圖1),制備的α-乳白蛋白與乳鐵蛋白14 kDa和80 kDa預(yù)期位置處具有明顯的條帶,且純度較高,可作為后續(xù)研究的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 駱駝乳α-乳白蛋白與乳鐵蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of α-lactalbumin and lactoferrin from camel milk注:M-Marker;1-α-乳白蛋白;2-乳鐵蛋白。

2.2 駝乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白和IgG功能蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

駝源α-乳白蛋白對(duì)照品色譜圖如圖2-a所示,出峰時(shí)間為6.373 min;駝源乳鐵蛋白對(duì)照品色譜圖如圖2-b所示,出峰時(shí)間為3.763 min。色譜峰峰型均呈對(duì)稱(chēng)性且無(wú)明顯拖尾。分別配制質(zhì)量濃度200、400、600、800、1 000 mg/L的α-乳白蛋白,上機(jī)檢測(cè),繪制α-乳白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2-c所示,計(jì)算出對(duì)應(yīng)的回歸方程:y=15 868x+888 315(R2=0.998 9,線性范圍200～1 000 mg/L)。分別配制質(zhì)量濃度25、50、100、200、1 000 mg/L的乳鐵蛋白溶液,上機(jī)檢測(cè),繪制乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2-d所示,得到對(duì)應(yīng)回歸方程:y=190.86x-2 122.2(R2=0.998 3,線性范圍25～1 000 mg/L)。在450 nm波長(zhǎng)下,檢測(cè)質(zhì)量濃度15、25、75、125、250、500 μg/L的IgG的OD值,繪制IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖2-e所示,回歸方程為y=0.002 5x+0.083 4(R2=0.999 9,線性范圍25～500 mg/L)。

a-α-乳白蛋白對(duì)照品色譜圖;b-乳鐵蛋白對(duì)照品色譜圖;c-α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線;d-乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線;e-IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2 功能蛋白色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Functional protein chromatogram and standard curve

2.3 駝乳脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖

使用氣相色譜分離出脂肪酸甲酯混和標(biāo)準(zhǔn)品中的34 種脂肪酸甲酯,如色譜圖(圖3)所示,以運(yùn)行時(shí)間為橫坐標(biāo),以信號(hào)值為縱坐標(biāo),運(yùn)行總時(shí)間為95.33 min。結(jié)果表明,各脂肪酸甲酯出峰較好、峰純度高、無(wú)雜峰,可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of a standard solution of mixed fatty acid methyl ester

2.4 雙峰駝泌乳期內(nèi)乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶變化分析

泌乳期內(nèi)動(dòng)態(tài)追蹤20峰泌乳駝,駝初乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG、溶菌酶4 種功能蛋白含量分別為(6.76±1.80) g/L、(0.91±0.62) g/L、(3.05±0.88) mg/mL及(0.49±0.37) μg/mL均極顯著高于常乳期(2.79±0.72) g/L、(0.6±0.54) g/L、(1.24±0.36) mg/mL及(0.24±0.23) μg/mL(P<0.01),并且常乳期中前期功能蛋白變化趨勢(shì)小,中后期功能蛋白含量變化幅度明顯,總體呈現(xiàn)波動(dòng)遞減(圖4-b),推測(cè)其變化與仔駝生長(zhǎng)過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的身體機(jī)能免疫需求密切相關(guān)。其中,α-乳白蛋白的含量處于1.14～10.97 g/L區(qū)間;泌乳第1天,駝乳中α-乳白蛋白含量最高為(10.97±0.24) g/L,隨著泌乳天數(shù)的增加,α-乳白蛋白整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),與MERIN等[20]對(duì)單峰駝的報(bào)道結(jié)果相符。在泌乳的第330天含量最低為(1.14±0.14) g/L;其中處于90～240 d時(shí),駝乳中α-乳白蛋白相對(duì)穩(wěn)定,含量在3.36 g/L,隨后逐漸降低。α-乳白蛋白約為乳鐵蛋白的6.7倍,駝乳中乳鐵蛋白的含量在0.20～2.26 g/L,當(dāng)母駝泌乳第2天,駝乳中乳鐵蛋白含量最高為(2.26±0.04) g/L,隨著泌乳天數(shù)的增加,乳鐵蛋白呈先下降后上升的趨勢(shì),總體而言,初乳期的駝乳中的乳鐵蛋白的含量顯著高于常乳期。整個(gè)泌乳期內(nèi)免疫球蛋白IgG的含量為0.53～4.66 mg/mL。初乳期IgG的含量很高,泌乳第1天時(shí)最高為(4.46±0.20) mg/mL,隨后逐漸降低,是由于泌乳過(guò)程中催乳素含量的增加使得乳腺上皮細(xì)胞上IgG1特異性受體失活,下調(diào)了免疫球蛋白IgG的轉(zhuǎn)移所致[21];在30～90 d波動(dòng)較大,可能是由于分娩后母駝的正常消化和代謝功能逐漸恢復(fù);在270～330 d大幅波動(dòng),可能是由于泌乳末期雙峰駝泌乳功能逐漸衰退。溶菌酶的含量處于0.08～1.16 μg/mL,泌乳第1天溶菌酶含量最高為(1.16±0.01) μg/mL,隨著泌乳天數(shù)的增加溶菌酶整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì),150 d后趨于穩(wěn)定。初乳期以及泌乳前期的溶菌酶含量顯著高于泌乳中后期。綜上結(jié)果表明,初乳期α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶含量均高于常乳期,并伴隨常乳期泌乳天數(shù)的增加,4種功能性蛋白質(zhì)的含量逐漸下降并趨于穩(wěn)定,這與大多數(shù)哺乳動(dòng)物變化趨勢(shì)一致[21-22],由于新生幼犢免疫及消化系統(tǒng)發(fā)育不全,免疫功能不足以抵抗外界侵?jǐn)_,初乳中免疫功能蛋白含量高,能增強(qiáng)仔駝免疫力并促進(jìn)生長(zhǎng)。

a-初乳期;b-常乳期圖4 泌乳期內(nèi)駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶變化Fig.4 α-Lactalbumin, lactoferrin, IgG, and lysozyme content composition of Bactrian camel milk at different lactation periods

2.5 雙峰駝泌乳期內(nèi)乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶相關(guān)性分析

對(duì)泌乳期內(nèi)駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶4種功能蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析(圖5)。結(jié)果表明,這些功能蛋白之間具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。其中α-乳白蛋白與IgG具有強(qiáng)正相關(guān)(P<0.05,相關(guān)系數(shù)0.85);溶菌酶與α-乳白蛋白(P<0.05,相關(guān)系數(shù)0.59)、溶菌酶與和IgG(P<0.05,相關(guān)系數(shù)0.54)均呈中等強(qiáng)度正相關(guān);乳鐵蛋白分別與溶菌酶(P<0.05,相關(guān)系數(shù)0.33)、α-乳白蛋白(P<0.05,相關(guān)系數(shù)0.30)和IgG(P<0.05,相關(guān)系數(shù)0.17)間具有弱正相關(guān)。結(jié)果表明這4種功能蛋白間具有一定的協(xié)同作用,為幼駝生長(zhǎng)發(fā)育提供一種非特異性的防御機(jī)制。

圖5 泌乳期內(nèi)駝乳中α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG和溶菌酶相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis between α-lactalbumin, lactoferrin, IgG and lysozyme content composition of Bactrian camel milk at lactation periods

2.6 雙峰駝泌乳期內(nèi)乳脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化分析

使用氣相色譜對(duì)雙峰駝初乳期和常乳期的駝乳中脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)出32種常規(guī)脂肪酸。對(duì)不同泌乳階段脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化進(jìn)行展示分析(圖6),駝乳中脂肪酸含量變化主要集中在初乳期4～7 d與常乳期90～150 d期間,母駝妊娠后開(kāi)始泌乳哺育幼駝,初乳期4～7 d機(jī)體逐漸恢復(fù),初乳期過(guò)后脂肪酸含量變化不大,乳腺泌乳逐漸恢復(fù)及身體脂肪和激素動(dòng)員的變化,以滿足維持和哺乳需求;而在常乳期90～150 d期間,伴隨著季節(jié)及飼草轉(zhuǎn)換,母駝產(chǎn)奶量達(dá)到高峰期,機(jī)體隨之改變,因而造成脂肪酸含量一定程度變化,整體看泌乳期間脂肪酸含量變化不大。與伊麗等[23]報(bào)道的駝乳脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)伴隨季節(jié)而變化結(jié)果不同,原因在于其采集樣本駝處于自然放牧狀態(tài),不同季節(jié)采食植物種類(lèi)不同造成營(yíng)養(yǎng)差異對(duì)奶中脂肪酸組成與含量具有重要影響[24]。分別以飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)、多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)、短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)、中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid,MCFA)及長(zhǎng)鏈脂肪酸(longchain fatty acid,LCFA)為類(lèi)別進(jìn)行分析(圖7)。SFA占總脂肪酸含量的56.06%～83.84%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高;在UFA中,MUFA含量相對(duì)較高。本次試驗(yàn)未檢測(cè)出SCFA,MCFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,占總脂肪酸含量的95.3%～99.3%。這是由于妊娠后母駝處于能量負(fù)平衡狀態(tài),機(jī)體將儲(chǔ)備的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于乳汁合成,增加體脂分解,釋放以長(zhǎng)鏈脂肪酸為主的脂肪酸用于乳腺或肝臟代謝[25]。UFA占總脂肪酸含量的25.1%～44.1%;LCFA、PUFA與MCFA在初乳期和常乳期均含量均較為穩(wěn)定;SFA與UFA在初乳期3～7 d內(nèi)較為變化明顯,在泌乳高峰期90～150 d波動(dòng)較為明顯,但變化不顯著(P>0.05),其余時(shí)期變化不大。初乳期UFA含量較高,對(duì)人體健康更為有益。此外,選取的樣本駝為半集約化人工養(yǎng)殖,養(yǎng)殖條件及飼草纖維素的質(zhì)量水平基本一致,因此使乳脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在一定水平,變化幅度小。先前研究表明,駱駝乳脂肪酸的組成受環(huán)境、飼養(yǎng)條件和飼料成分等多種因素的影響[23, 26],以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了準(zhǔn)噶爾雙峰駱駝乳脂肪酸的組成受飼養(yǎng)條件及飼草組成的影響。

圖6 泌乳期內(nèi)脂肪酸含量的變化Fig.6 Heat maps of fatty acid content during lactation

a-初乳期;b-常乳期圖7 泌乳期內(nèi)不同類(lèi)別脂肪酸變化Fig.7 Dynamic changes of different fatty acids during lactation

此外,駝乳中最主要的飽和脂肪酸是C14∶0、C16∶0 和C18∶0,其中C18∶0對(duì)人體健康有中性的影響,而C14∶0和C16∶0則對(duì)人體有害,與人體低密度脂蛋白濃度相關(guān),而低密度脂蛋白是造成動(dòng)脈粥樣硬化的因素之一。駝乳中的中鏈脂肪酸水平也更高,MCFA比LCFA更容易消化和代謝。作為特殊的反芻動(dòng)物,雙峰駝通過(guò)發(fā)酵纖維素產(chǎn)生SCFA,而駝乳中的濃度低于其他物種,是由于SCFA在進(jìn)入乳中之前進(jìn)行快速代謝,與母駝激素水平變化相關(guān)。初乳期LCFA含量較高,隨著泌乳天數(shù)的增加含量降低,可能與母駝在分娩前胰島素敏感較低,分娩后對(duì)胰島素敏感性逐漸恢復(fù)[27]有關(guān)。初乳期高含量MUFA對(duì)幼崽髓鞘的形成與大腦發(fā)育起關(guān)鍵作用[28-29]。母駝分娩后產(chǎn)生代償性高胰島素血癥,高水平胰島素促進(jìn)了肝臟脂肪合成,與MUFA的合成相關(guān),因此初乳期MUFA含量也較高[30-31]。雙峰駝的MUFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍高于其他哺乳動(dòng)物可能是由于雙峰駝后腸發(fā)酵較為緩慢或脂肪酸去飽和酶活性較強(qiáng)所致[32]。此外,也有研究指出乳中的MUFA和UFA的變化也與母體能量狀態(tài)有關(guān)[33]。PUFA隨著母駝哺乳期的延長(zhǎng)含量略有降低,與牧草中含量及動(dòng)物吸收能力相關(guān)。

2.7 雙峰駝泌乳期內(nèi)乳脂肪酸含量相關(guān)性分析

乳制品可為人體提供所需15%～25%的脂肪酸及25%～35%的飽和脂肪酸。不飽和脂防酸具有降低膽固醇的作用,所以其質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高越好。因此,脂防酸的比例是評(píng)估乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一。哺乳期駝乳的脂肪酸組成和含量主要受飼草營(yíng)養(yǎng)水平、乳腺的從頭合成及瘤胃微生物組活性等諸多因素決定。與牛乳相比,駝乳脂肪酸的分布和含量更為合理[34]。對(duì)泌乳期駝乳中的32種脂肪酸進(jìn)行相關(guān)性分析(圖8)。多數(shù)脂肪酸間具有顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),其中SFA與MUFA的負(fù)相關(guān)性極強(qiáng),少數(shù)脂肪酸間具有顯著正相關(guān),尤其MCFA和LCF之間具有顯著正相關(guān),這與泌乳期前90 d的阿拉善雙峰駝23種脂肪酸相關(guān)性結(jié)果相符[9]。在顯著相關(guān)的脂肪酸分析結(jié)果中,已酸甲酯C6∶0與二十碳二烯酸乙酯C20∶2,二十二碳二烯酸C22∶2n6與二十碳二烯酸乙酯C20∶2和已酸甲酯C6∶0,十二碳酸乙酯C12∶0與乙酸癸酯C10∶0,肉豆蔻酸C14∶0與乙酸癸酯C10∶0和十二碳酸乙酯C12∶0,肉豆寇油酸C14∶1n5與肉豆蔻酸C14∶0和十二碳酸乙酯C12∶0,正辛酸甲酯C8∶0與肉豆蔻酸C14∶0和肉豆寇油酸C14∶1n5,花生四烯酸甲酯C20∶4n6與順芥子酸甲酯C22∶1n9間具有較強(qiáng)正相關(guān)性(P<0.05,相關(guān)系數(shù)≥0.8)。乙酸癸酯C10∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c,十二碳酸乙酯C12∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c和棕櫚油酸C16∶1n7,肉豆蔻酸C14∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c和棕櫚油酸C16∶1n7,正辛酸甲酯C8∶0與順-9-十八碳一烯酸甲酯C18∶1n9c間具有較強(qiáng)負(fù)相關(guān)(P<0.05,相關(guān)系數(shù)≤-0.8)。駝乳中不同的脂肪酸組成及含量維持在一定比例,能夠保持機(jī)體健康狀態(tài)[32]。

圖8 泌乳期內(nèi)脂肪酸含量間相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between fatty acid content of Bactrian camel milk at lactation periods

3 結(jié)論與討論

本研究建立了駝乳中4 種功能蛋白及脂肪酸超高效液相色譜檢測(cè)方法,對(duì)準(zhǔn)噶爾雙峰駝在泌乳期330 d的駝乳α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶及脂肪酸含量進(jìn)行檢測(cè)以探究其變化規(guī)律。在駝乳中檢測(cè)出32 種脂肪酸,種類(lèi)多于先前的研究報(bào)道,但主要組成基本一致[9, 35-36]。與其他乳用家畜一致,泌乳駝初乳期的α-乳白蛋白、乳鐵蛋白、IgG及溶菌酶的含量顯著高于常乳期,歸因于新生仔畜免疫系統(tǒng)與消化系統(tǒng)發(fā)育尚不完善,合成免疫物質(zhì)的能力不足難以抵抗外界侵?jǐn)_,初乳中的免疫蛋白在新生幼犢免疫系統(tǒng)的保護(hù)和成熟過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[22, 37]。伴隨常乳期泌乳天數(shù)的增加,4 種功能性蛋白質(zhì)的含量逐漸下降?？傮w而言,初乳期及常乳期駝乳中功能蛋白與脂肪酸的組成及含量具有一定差異。對(duì)4 種功能蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)它們間具有一定的協(xié)同作用,是幼駝生長(zhǎng)發(fā)育的重要防御機(jī)制。此外,準(zhǔn)噶爾雙峰駝乳動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)低于牛乳,乳中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比例合理,營(yíng)養(yǎng)成分與人乳相似且具有低致敏性,營(yíng)養(yǎng)均衡更有利于人類(lèi)健康[23]。因此,加強(qiáng)對(duì)駱駝乳及其乳制品營(yíng)養(yǎng)資源的開(kāi)發(fā)利用,尤其是在醫(yī)療保健價(jià)值方面。本研究為新疆雙峰駝的泌乳生理學(xué)及功能性駝乳制品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)參考。