董雪,李兆豐,2,顧正彪,2,班宵逢,2,洪雁,2,程力,2,李才明,2*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫,214122)

環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是由淀粉通過環(huán)糊精轉(zhuǎn)葡萄糖基酶催化水解產(chǎn)生的一種環(huán)狀寡聚糖[1],一般由6、7、8個D-吡喃葡萄糖單元組成,分別為α-CD、β-CD和γ-CD[2],其結(jié)構(gòu)如圖1所示。CD具有“外親水、內(nèi)疏水”的獨(dú)特分子洞腔,可與疏水性客體分子形成包合物,達(dá)到提高客體溶解度和穩(wěn)定性、掩蓋不良?xì)馕?、降低刺激性與不良反應(yīng)的目的[1],并且已有研究表明多種CD協(xié)同使用會獲得更好的包合效果[3]。

圖1 α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of α-, β- and γ-cyclodextrin structures

三丁酸甘油酯(tributyrin,TB)是一種具有多種生理功效的短鏈脂肪酸酯[4],其結(jié)構(gòu)如圖2所示。TB作為丁酸的前體物質(zhì),不僅減弱丁酸理化性質(zhì)方面的缺陷,還具備多種生理功效[6],如維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)與減少幼齡動物斷奶應(yīng)激[7]、調(diào)節(jié)免疫功能與機(jī)體代謝[8]、改善生長性能[9]等。但TB水溶性差、有苦味和異味、易在消化道前段被降解,這些缺點(diǎn)限制了其在各個行業(yè)尤其是食品行業(yè)中的應(yīng)用[10]。因此,改進(jìn)TB的使用性能,對其應(yīng)用價值的提高和使用范圍的擴(kuò)大具有重要意義。

圖2 三丁酸甘油酯的結(jié)構(gòu)示意圖[5]Fig.2 Schematic diagram of tributyrin

先前研究報(bào)道γ-CD/TB包合物可提高TB的利用率,但通過噴霧干燥制備樣品時,包合物中TB的保留率較低[11],因而猜測γ-CD的空腔尺寸并非與TB具備最佳匹配效應(yīng)。本課題組前期發(fā)明了酶法生產(chǎn)CD過程包合TB的新方法,在酶法生產(chǎn)CD的過程中直接添加TB作為絡(luò)合劑,促進(jìn)3種CD生成,同時制備得到降低TB異味、有效提高其生物利用度的包合物[9, 12-13]。以上研究并未對CD包合TB的機(jī)制進(jìn)行深入研究,因而本文將系統(tǒng)探究3種CD(α-CD、β-CD和γ-CD)包合TB的分子機(jī)制,分析復(fù)配CD包合的協(xié)同效應(yīng),以期為CD的應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),并為其他功能因子的包合提供理論參考和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

α-CD、β-CD、γ-CD,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氘代二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide-d6,DMSO-d6),美國Cambridge Isotope Laboratories股份有限公司;TB(純度98%),廣東溢多利生物科技股份有限公司;無水乙醇,上海麥克林生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Centrifuge 5424型臺式高速離心機(jī),德國Eppendorf公司;RW20 Digital數(shù)顯型頂置式攪拌器,德國IKA公司;TW8型恒溫水浴槽,德國JULABO有限公司;VO-53型真空干燥機(jī),上海泰坦科技股份有限公司;UV1900紫外可見光分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司;Avance III-400 MHz型核磁共振波譜儀,德國Bruker AXS公司;MicroCal VP-ITC等溫滴定量熱儀,馬爾文帕納科公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CD/TB包合物的制備

采用共沉淀法[14]制備,將CD(α-CD、β-CD、γ-CD、復(fù)配CD)完全溶于去離子水中,然后將溶解在無水乙醇中的TB緩慢加入CD溶液,50 ℃保溫?cái)嚢? h,冷藏24 h,過濾得到CD/TB包合物,用無水乙醇洗滌2次以除去包合物表面未被包合的TB,真空干燥烘干水分至恒重,獲得CD/TB包合物樣品。(其中復(fù)配CD物質(zhì)的量比例為:α-CD∶β-CD=3∶7,β-CD∶γ-CD=7∶3,α-CD∶β-CD∶γ-CD=2∶7∶1,所得包合物分別命名為:α-、β-CD/TB,β-、γ-CD/TB,α-、β-、γ-CD/TB)。

1.3.21H核磁共振(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)測定

參照李澤西[10]的方法并適當(dāng)修改,使用核磁共振波譜儀測定樣品化學(xué)位移量。CD單體、TB單體以及包合物溶解于DMSO-d6有機(jī)溶劑,實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置303 K。包合前后CD與TB質(zhì)子化學(xué)位移計(jì)算如公式(1)所示:

Δδ=δ(包合物)-δ(單體)

(1)

1.3.3 相溶解度測定

參照李丹等[15]的方法并適當(dāng)修改。將過量TB(以無水乙醇為溶劑配制2 mol/LTB溶液)分別加入濃度為0、4、8、12、16、20 mmol/LCD溶液中,水浴攪拌24 h,離心取上清液,采用紫外分光光度法測定清液中TB濃度;作TB的含量和CD濃度的關(guān)系圖,即為相溶解度曲線,并對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合;根據(jù)公式(2)計(jì)算CD與TB的包合穩(wěn)定常數(shù)Ks。

(2)

1.3.4 等溫滴定微量熱測定

參照張翔宇等[16]的方法并適當(dāng)修改。將濃度分別為2 mmol/LTB溶液與20 mmol/LCD溶液進(jìn)行脫氣處理。向樣品池中添加TB溶液,進(jìn)樣針吸取CD溶液后,對樣品進(jìn)行熱力學(xué)分析,空白溶劑為對照組。實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃;滴定次數(shù)27滴;滴定間隔時間240 s;攪拌速率351 r/min。用Microcal Anslysis Launcher軟件對滴定過程中的熱變化進(jìn)行記錄和處理。

1.3.5 Autodock分子模擬對接

在Automated Topology Builder and Repository網(wǎng)頁中搜索α-CD、β-CD、γ-CD和TB的結(jié)構(gòu),通過ChemSpider下載分子結(jié)構(gòu),根據(jù)先前報(bào)道方法對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化并用AutoDock 4.2.6組件進(jìn)行分子模擬對接[9],輸出結(jié)果采用Open Babel軟件轉(zhuǎn)換文件格式,最終使用軟件Discovery Studio進(jìn)行觀察。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2019和Origin 2021對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及作圖;采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05),計(jì)算平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,通過單因素方差分析(AVOVA)中的Duncan程序?qū)崿F(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核磁共振構(gòu)象解析

1H NMR是對包合物體系最準(zhǔn)確的表征技術(shù)[17],已經(jīng)被廣泛用于主客體化合物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)與構(gòu)象分析[18]。圖3為TB與CD包合的1H NMR譜圖。

a-三丁酸甘油酯、單一環(huán)糊精和包合物的1H NMR譜圖;b-三丁酸甘油酯、復(fù)配環(huán)糊精和包合物的1H NMR譜圖圖3 三丁酸甘油酯、環(huán)糊精和包合物的1H NMR譜圖Fig.3 1H NMR spectra of tributyrin, cyclodextrins and their inclusion complex

由表1可知,CD空腔內(nèi)的質(zhì)子H3、H5、H6發(fā)生了不同程度的位移變化,這是由于α-、β-和γ-CD與TB發(fā)生相互作用后,TB分子會進(jìn)入CD的疏水空腔,其環(huán)電流效應(yīng)會使空腔內(nèi)部質(zhì)子周圍的電子云密度增大,從而導(dǎo)致質(zhì)子化學(xué)位移發(fā)生偏移,證實(shí)了α-、β-和γ-CD都可包合TB形成包合物[19]。此外,有研究表明質(zhì)子位移的變化幅度可展現(xiàn)客體分子進(jìn)入空腔的取向以及主客體的包合模式[20],圖4顯示了CD單體與TB單體的原子標(biāo)記,由圖4-a可以看出,質(zhì)子H6位于CD外部的窄口端,并且比較表1中H3、H5、H6的位移變化程度可得知,H3的變化值大于H5,表明TB傾向于從CD寬口端進(jìn)入疏水空腔,H6的化學(xué)位移是由于客體分子深插入空腔造成。此外,相同質(zhì)子β-CD位移變化值最大,說明盡管TB能與3種CD都發(fā)生包合,但β-CD包合TB的能力最強(qiáng),可能與β-CD空腔尺寸同TB最適配有關(guān)[19]。

表1 環(huán)糊精單體及與三丁酸甘油酯包合物的1H化學(xué)位移(δ)Table 1 1H-chemical shifts (δ) of cyclodextrins in the absence and presence of tributyrin

a-環(huán)糊精;b-三丁酸甘油酯圖4 環(huán)糊精與三丁酸甘油酯的原子標(biāo)記[9]Fig.4 Proton labeling of cyclodextrin and tributyrin

表2列出了TB質(zhì)子的化學(xué)位移變化情況。TB外緣鏈狀結(jié)構(gòu)上的氫原子(H2, 7和H1, 8)發(fā)生較為明顯的偏移,表明TB由乙基部分進(jìn)入CD空腔的構(gòu)象占優(yōu)勢。相同質(zhì)子β-CD的化學(xué)位移改變值最大,同表1結(jié)果一致。

表2 三丁酸甘油酯單體及與環(huán)糊精包合物的1H化學(xué)位移(δ)Table 2 1H-chemical shifts (δ) of tributyrin in the absence and presence of cyclodextrins

由表3可知,當(dāng)2種或3種CD同時包合TB時,CD空腔內(nèi)部質(zhì)子及外側(cè)部分質(zhì)子都發(fā)生較明顯的化學(xué)位移,這可能是由于TB分子全部或部分插入CD空腔內(nèi)引起內(nèi)部質(zhì)子位移,TB分子與CD外側(cè)質(zhì)子相互作用引起外側(cè)質(zhì)子位移;進(jìn)而推測復(fù)配CD能以多種方式與TB分子結(jié)合。觀察表2、表4中所示數(shù)據(jù),以復(fù)配CD為壁材時,包合物中TB分子的化學(xué)位移最大為0.013 ppm,以單一CD為壁材時,TB的化學(xué)位移最大為0.008 ppm,復(fù)配CD-TB包合物中TB分子的化學(xué)位移變化明顯大于單一CD,所以猜測復(fù)配CD存在更適于包合TB的結(jié)構(gòu),包合TB的能力更強(qiáng)。

表3 環(huán)糊精單體及與三丁酸甘油酯包合物的1H化學(xué)位移(Δδ)Table 3 1H-chemical shifts (Δδ) of cyclodextrins in the absence and presence of tributyrin

表4 三丁酸甘油酯單體及與環(huán)糊精包合物的1H化學(xué)位移(δ)Table 4 1H-chemical shifts (δ) of tributyrin in the absence and presence of cyclodextrins

2.2 相溶解度分析

目前,相溶解度法廣泛用于研究CD對難溶性客體溶解度的影響[21]。本文通過相溶解度研究了CD對TB的增溶效應(yīng),結(jié)果如圖5所示。TB的溶解性隨著CD濃度的增加而成比例增加,這是由于CD可與TB形成包合物[22];分析相溶解度曲線可知,所有線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.95(表5),說明CD與TB的相溶解度曲線為AL型[23],表明CD與TB以1∶1物質(zhì)的量比進(jìn)行包合[24]。

表5 在不同溫度條件下3種環(huán)糊精與三丁酸甘油酯的包合穩(wěn)定常數(shù)Table 5 Inclusion stability constants of the tributyrin and three typical cyclodextrins under different temperature

圖5 環(huán)糊精與三丁酸甘油酯的相溶解度曲線Fig.5 Phase solubility of cyclodextrin and tributyrin

此外,相溶解度法是計(jì)算CD和客體物質(zhì)包合穩(wěn)定常數(shù)Ks的一種常用技術(shù)[25],Ks值越大,包合物穩(wěn)定性越好[26]。為評估不同CD與TB包合物的穩(wěn)定性,計(jì)算了包合穩(wěn)定常數(shù),結(jié)果如表5所示。不同主體包合穩(wěn)定常數(shù)的順序?yàn)?α-、β-、γ-CD>α-、β-CD>β-、γ-CD>β-CD>γ-CD>α-CD,表明以單一CD作為壁材時,β-CD與TB的Ks值最大,猜測原因可能是TB可能與β-CD空腔的匹配度較高,形成的包合物更穩(wěn)定;而γ-CD的空腔尺寸相對較大,TB分子能夠更自由的進(jìn)出其空腔,導(dǎo)致γ-CD/TB包合物不穩(wěn)定;相比之下,α-CD的空腔尺寸較小,降低了其有效包合TB的概率,因此α-CD/TB包合物的穩(wěn)定性最低;復(fù)配CD(α-CD∶β-CD∶γ-CD=2∶7∶1)與TB的Ks值相對于β-CD提高了79.21%,表明多種CD同時存在對TB的協(xié)同包合效果明顯優(yōu)于單一CD,復(fù)配CD包合TB的能力更強(qiáng),此結(jié)果證實(shí)了上文猜測;此外,α-、β-CD及β-、γ-CD與TB的Ks值相對于β-CD分別提高了60.70%、35.60%,可以進(jìn)一步說明β-CD與α-CD的協(xié)同效果較好。

2.3 包合過程熱力學(xué)分析

等溫滴定微量熱是近年發(fā)展的一項(xiàng)熱分析技術(shù),該技術(shù)靈敏度高、測量準(zhǔn)確,且可做到實(shí)時、定量、在線和動態(tài)描述反應(yīng)過程[27]。為進(jìn)一步研究CD與TB的熱力學(xué)相互作用,測定了二者的等溫滴定量熱曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。觀察擬合結(jié)果可知,除α-CD外,其他CD與TB的擬合結(jié)果較好,可判斷數(shù)據(jù)有效可靠;推測因α-CD空腔過小有效包合TB的概率較低,加之空白溶劑的影響過大,所以α-CD包合TB過程中的等溫滴定量熱曲線無法用One Sites擬合方式擬合。

a-β-CD;b-γ-CD;c-β-、γ-CD;d-α-、β-CD;e-α-、β-、γ-CD圖6 環(huán)糊精滴定三丁酸甘油酯的等溫滴定量熱曲線Fig.6 Cyclodextrin titration tributyrin isothermal drops of quantitative thermal curve

在包合物形成過程中,主客體之間沒有化學(xué)鍵變化,熱力學(xué)上主要由焓或熵驅(qū)動,是一種物理過程。觀察圖6中列出的熱力學(xué)參數(shù)值可以看出,-TΔS、ΔH、ΔG均小于0,表示CD包合TB是一個可自發(fā)進(jìn)行的微放熱過程;且∣-TΔS∣>∣ΔH∣,說明焓熵協(xié)同驅(qū)動促進(jìn)CD包合TB,熵驅(qū)動在包合過程中占主導(dǎo)地位[28];進(jìn)而,ΔH<0,ΔS>0,表明促進(jìn)包合過程發(fā)生的主要因素有疏水作用力、氫鍵、離子鍵和范德華力[29],其中疏水作用力起主要作用,CD/TB包合物形成過程中的熱力學(xué)參數(shù)是上述作用力相互競爭平衡的結(jié)果。通常情況下,ΔS>0可能是由于兩部分疏水作用力促成的,第一部分是TB分子周圍的疏水作用力,包括被包合在CD空腔內(nèi)部的TB分子及包合體系內(nèi)少量游離的TB分子;第二部分疏水作用力來自CD/TB包合物形成過程中高能量水分子的釋放,包括CD疏水空腔內(nèi)部的水分子、CD外側(cè)親水表面的水分子及TB分子疏水結(jié)構(gòu)周圍的水分子,此部分疏水作用力較強(qiáng),能夠提高包合過程中的熵驅(qū)動[30]。

此外,由圖6可知,以單一CD滴定TB時,β-CD與TB的包合穩(wěn)定常數(shù)大于γ-CD,表明β-CD的疏水空腔更適于包合TB,二者之間的疏水相互作用較強(qiáng),β-CD/TB包合物更穩(wěn)定。比較復(fù)配CD與TB的包合穩(wěn)定常數(shù)可知,3種CD同時存在時與TB的包合穩(wěn)定常數(shù)最大,說明3種CD協(xié)同作用可達(dá)到更好的包合效果,并且β-CD與α-CD的協(xié)同作用比β-CD與γ-CD的協(xié)同作用更好,此結(jié)果與相溶解度結(jié)果一致。β-CD包合TB過程中的熵變?yōu)?7.8 cal/mol K,與之相比,α-、β-CD及α-、β-、γ-CD包合TB過程中的熵值分別提高了25.84%、36.52%,表明α-CD和γ-CD以一定比例與β-CD同時存在時可增大熵驅(qū)動,推測原因?yàn)槎喾N環(huán)糊精同時存在可以提供更多與TB分子尺寸相匹配的疏水空腔,使較多量的TB進(jìn)入空腔形成包合物,增加了TB被有效包合的可能性;包合過程中會有較多高能量水分子從CD空腔內(nèi)部及外側(cè)親水表面釋放,增強(qiáng)了CD與TB之間的疏水相互作用,從而達(dá)到更穩(wěn)定的包合效果。

2.4 分子模擬對接研究

為進(jìn)一步闡明CD與TB的包合機(jī)制,本研究使用分子對接軟件AutoDock 4.2.6對CD和TB的包合物進(jìn)行了分子對接研究,證實(shí)了包合物結(jié)構(gòu)的合理性。由ChemSpider獲得的3種CD和TB的三維構(gòu)象如圖7所示,α-CD、β-CD和γ-CD為空腔依次增大的環(huán)狀結(jié)構(gòu),而TB為3個分支的鏈狀結(jié)構(gòu)。

a-三丁酸甘油酯;b-α-環(huán)糊精;c-β-環(huán)糊精;d-γ-環(huán)糊精圖7 三丁酸甘油酯、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精的三維結(jié)構(gòu)圖Fig.7 3D structures of tributyrin,α-CD, β-CD, and γ-CD

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,α-、β-和γ-CD的疏水空腔的平均直徑分別為5.7 ?、7.8 ?和9.5 ?[31],TB與3種CD在理論上均能發(fā)生包合。圖8顯示了TB和3種CD的最大可能包合構(gòu)象,TB被包合進(jìn)CD空腔的基團(tuán)及其形態(tài)不同:α-CD的疏水空腔較小,TB的鏈狀結(jié)構(gòu)只能被部分包合,大部分結(jié)構(gòu)暴露于CD空腔外側(cè),包合構(gòu)象極不穩(wěn)定;TB在β-CD的空腔中可適當(dāng)卷曲,被較完全包合,增加了β-CD包合TB的緊密程度與穩(wěn)定性;而γ-CD由于其疏水空腔過大,疏水作用力不足導(dǎo)致TB分子與腔體內(nèi)側(cè)還存在較大間隙,TB分子能夠較自由的進(jìn)出其空腔,導(dǎo)致包合構(gòu)象極不穩(wěn)定,從而增加了形成包合物的難度。

a-α-環(huán)糊精;b-β-環(huán)糊精;c-γ-環(huán)糊精圖8 三丁酸甘油酯與α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精的分子對接最優(yōu)構(gòu)象Fig.8 Optimal molecular docking conformation of tributyrin with α-CD, β-CD, and γ-CD

由表6可知,TB與3種不同類型CD的refRMS值的順序?yàn)?β-CD<α-CD<γ-CD,其中β-CD與TB包合結(jié)果的refRMS值最小,表明其對接構(gòu)象的有效性最大;從結(jié)合能方面看,β-CD與TB的結(jié)合能最高,遠(yuǎn)大于α-CD和γ-CD,說明β-CD與TB的包合結(jié)構(gòu)最為緊密。

表6 分子對接結(jié)果相關(guān)參數(shù)Table 6 Related parameters of molecular docking results

通過進(jìn)一步分析分子模擬對接結(jié)果,得到3種CD包合TB的多種包合構(gòu)象,如圖9所示。

圖9 三丁酸甘油酯與α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精的分子對接可能構(gòu)象Fig.9 Possible molecular docking conformation of tributyrin with α-CD, β-CD, and γ-CD

β-CD的空腔最適于包合TB,沒有出現(xiàn)TB分子脫離β-CD空腔的情況,但也會出現(xiàn)僅包合側(cè)鏈的對接結(jié)果;而α-CD和γ-CD包合TB時,會出現(xiàn)僅包合側(cè)鏈或TB分子未被包合進(jìn)空腔內(nèi)的結(jié)果,此時CD與TB的包合構(gòu)象便不穩(wěn)定。

聯(lián)系相溶解度和等溫滴定微量熱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,2種或3種CD復(fù)配與TB時的包合穩(wěn)定常數(shù)明顯大于單一CD,說明多種CD協(xié)同作用包合TB可能會形成更穩(wěn)定的包合構(gòu)象。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,最終推測出如圖10所示復(fù)配CD包合TB的包合構(gòu)象,多種CD協(xié)同包合TB能夠形成穩(wěn)定的包合物。

圖10 三丁酸甘油酯與環(huán)糊精包合模型圖Fig.10 Simulated inclusion complex conformation of tributyrin with cyclodextrins

3 結(jié)論

本研究首先通過核磁共振光譜鑒定出α-CD、β-CD、γ-CD均可能與TB形成包合物,其中β-CD最適于包合TB;根據(jù)相溶解度實(shí)驗(yàn)確定CD與TB的包合比為1∶1,復(fù)配CD與TB的包合效果優(yōu)于單一CD;進(jìn)而通過等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)可知CD包合TB是可自發(fā)進(jìn)行的微放熱過程,焓熵協(xié)同驅(qū)動促進(jìn)包合過程發(fā)生,熵驅(qū)動在包合過程中占主導(dǎo)地位,疏水作用力為主要作用,并且α-CD和γ-CD以一定比例與β-CD同時存在時可以提供更多與TB分子尺寸相匹配的疏水空腔,增強(qiáng)了CD與TB之間的疏水相互作用,從而達(dá)到更穩(wěn)定的包合效果;最后,通過深入解析單一CD包合TB的分子構(gòu)象,推測出復(fù)配CD協(xié)同包合TB的分子模型。本文研究分析了3種常見CD包合TB的分子機(jī)制及不同CD包合TB的協(xié)同效應(yīng),為改善TB的應(yīng)用效果打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ),也有助于完善CD的包合理論與技術(shù),最終促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。