周泓妍,鄭怡,王海東,曹珺,張涵,張紅印,李光哲*,嚴(yán)銘銘,3*

1(長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 長春,130117)2(長春中醫(yī)藥大學(xué) 東北亞中醫(yī)藥研究院,吉林 長春,130117)3(吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心,吉林 長春,130117)

氧化應(yīng)激是指由于某種原因體內(nèi)產(chǎn)生了超出機(jī)體清除能力的多余活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞了機(jī)體正常狀態(tài)下的氧化/還原平衡,使體內(nèi)的生物大分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等)受到氧化損傷,甚至導(dǎo)致其功能紊亂,對機(jī)體正常代謝過程產(chǎn)生影響的一種異常應(yīng)激狀態(tài)[1]。體內(nèi)自由基水平過高會將細(xì)胞膜、代謝酶系、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)氧化,還會誘導(dǎo)細(xì)胞異常凋亡,對機(jī)體的細(xì)胞造成損傷。研究表明,自由基過多可能引起衰老、炎癥、癌癥、心血管等疾病,因此,開發(fā)具有清除自由基和還原能力的功能性健康食品和藥物日益受到重視。人工合成抗氧化劑具有較多不良反應(yīng),對人體的肝臟、脾、肺會產(chǎn)生不良影響。天然抗氧化劑與人工合成抗氧化劑相比,具有毒性低、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[2]。植物蛋白來源廣泛、容易獲得、安全穩(wěn)定且易被人體消化吸收。同時,植物蛋白還是一類天然的抗氧化物質(zhì)[3],且中藥中的植物蛋白具有優(yōu)良的生物活性,對人體有特殊的保健作用[4-6]。目前已有諸多學(xué)者對黃芪[7]、山藥[8]、枸杞[9]等中藥植物蛋白展開研究,結(jié)果表明,中藥植物蛋白多具有抗氧化,抗過敏、抗糖尿病、抗癌等多種生物活性。

項(xiàng)目組前期對北五味子蛋白(Schisandrachinensisprotein,SCP)進(jìn)行了深入研究,結(jié)果表明五味子蛋白具有優(yōu)良的體內(nèi)抗氧化和抗疲勞活性[10-11]。作為與北五味子處于相同屬但不同種的南五味子,與北五味子具有相似傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代的生物活性。研究表明,五味子多糖、木脂素、酚酸均具有良好的抗氧化活性[12],但尚未見對不同品種五味子蛋白抗氧化活性相關(guān)的研究,尤其是南五味子蛋白(Schisandrasphenantheraprotein,SSP)的抗氧化活性研究。本研究將SSP和SCP體外清除自由基能力和還原能力對比,之后利用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激模型探究2種五味子蛋白的抗氧化能力,旨在從細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞ROS水平、抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶系活性方面綜合評價2種五味子蛋白,從而為其在抗氧化功能性食品和健康產(chǎn)品中的開發(fā)提供理論依據(jù),并為后續(xù)闡明其抗氧化的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

南、北五味子藥材,長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)姜大成教授鑒定分別為木蘭科植物南五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)和北五味子[Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.]干燥成熟的果實(shí);鄰啡羅啉(鄰二氮菲)、DPPH、ABTS、維生素C(抗壞血酸),分析純,北京索萊寶生物科技有限公司;人肝癌細(xì)胞HepG2、最小必需培養(yǎng)基(minimum essential medium,MEM),武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清、胰酶,美國Gibco有限公司;CCK-8、PBS,北京bioss有限公司;ELISA試劑盒[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、丙二醛 (malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)],上海優(yōu)選生物科技有限公司;活細(xì)胞/死細(xì)胞染色試劑盒,上海貝博生物科技有限公司;細(xì)胞ROS檢測試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司;AB135-S十萬分之一分析天平、S220-K-CN標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計(jì),日本島津儀器有限公司;SCIENTZ-50F真空冷凍干燥機(jī),寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;3131型細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國Thermo Fisher有限公司;5920R低速離心機(jī),德國Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SCP和SSP制備

稱取一定量南五味子與北五味子干燥脫脂藥粉,按料液比1∶35(g∶mL)加蒸餾水勻漿,將原液pH值調(diào)至9.5,于35 ℃水浴中提取3 h,離心(3 500 r/min、15 min),棄沉淀,收集上清液,并將pH值調(diào)至3.4,靜置2 h后離心,棄上清液,適量蒸餾水溶解沉淀,將pH值調(diào)至中性后,透析袋中4 ℃透析48 h,間隔2 h替換蒸餾水,將透析袋中液體冷凍干燥,此冷凍干燥物即為SCP、SSP。

1.3.2 自由基清除能力

1.3.2.1 超氧陰離子(·O2-)

取若干支干凈試管,編號,加入0.1 mol/L Tris-HCl 3 mL,再加入0.1 mL質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的SCP、SSP溶液,混合均勻,25 ℃保溫20 min,加入7 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL,反應(yīng)4 min后加入1 mL 10 mol/L鹽酸終止反應(yīng);樣品對照組將鄰苯三酚溶液用等體積的蒸餾水代替;空白對照組以0.1 mL蒸餾水代替樣品溶液。維生素C為陽性對照,用蒸餾水做空白調(diào)零,于420 nm波長處測其吸光度,計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.2.2 羥自由基(·OH)

采用鄰二氮菲法測定SCP、SSP對·OH的清除作用。將0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL和0.2 mol/L PBS 2 mL加入試管中,隨后加入1 mL不同質(zhì)量濃度的SCP、SSP溶液,混勻后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液,立即混勻,最后加入1 mL 0.025% H2O2溶液,混勻,維生素C為陽性對照組,37 ℃水浴反應(yīng)1 h后536 nm波長處測其吸光度?？瞻讓φ战M以1 mL蒸餾水代替樣品溶液,樣品對照組以1 mL蒸餾水代替0.025% H2O2溶液,·OH清除率計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.2.3 DPPH自由基

將2 mL不同質(zhì)量濃度的SCP、SSP溶液加入到具塞試管中,加入2 mL 0.04 mg/mL的DPPH溶液,渦旋混勻。避光反應(yīng)30 min,以2 mL甲醇代替DPPH溶液作為樣品對照組,以2 mL蒸餾水代替SCP、SSP溶液作為空白對照組,維生素C為陽性對照組,于517 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.2.4 ABTS陽離子自由基

去離子水配制7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液,將2.5 mL ABTS儲備液與44 μL過硫酸鉀混勻作為工作液,4 ℃避光靜置12～16 h,臨用前用0.01 mol/L pH 7.4 PBS將工作液稀釋至734 nm處吸光度值為0.7±0.2,作為空白對照組吸光度。將200 μL工作液與10 μL不同濃度的SCP、SSP溶液混勻,室溫下避光反應(yīng)8 min,于734 nm處測定吸光度值。ABTS陽離子自由基清除能力計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

式中:A0,空白對照組吸光度;A1,樣品組吸光度。

1.3.3 還原能力

1.3.3.1 Fe2+螯合能力

取96孔板,向100 μL不同濃度的南、北五味子樣品溶液中加入50 μL 1.3 mmol/L FeCl2·4H2O,室溫反應(yīng)30 min,然后加入50 μL 0.1 mmol/L菲啰嗪溶液。以100 μL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照,測定562 nm處的吸光度值,Fe2+螯合能力計(jì)算如公式(5)所示:

(5)

式中:A0,樣品對照組吸光度;A1,實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.3.3.2 Fe3+還原能力

將1 mL不同質(zhì)量濃度的SCP、SSP溶液加入具塞試管中,分別加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6 PBS和10 g/L鐵氰化鉀溶液,迅速混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min,冷卻,加入2.5 mL 100 g/L三氯乙酸,混勻,3 000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 1 g/L的FeCl3溶液,充分混勻,以蒸餾水做空白調(diào)零,于700 nm處測其吸光度值,以2.5 mL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對照組,以維生素C為陽性對照。通過公式(6)計(jì)算其還原能力:

A=A1-A2

(6)

式中:A1,樣品組吸光度;A2,樣品對照組吸光度。

1.3.4 HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激修復(fù)作用

1.3.4.1 HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將HepG2細(xì)胞置于含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%后棄掉原培養(yǎng)液,PBS沖洗2次,加入1 mL胰蛋白酶消化2 min,進(jìn)行傳代培養(yǎng),定期更換培養(yǎng)基,至對數(shù)生長期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常對照組:完全培養(yǎng)基;氧化應(yīng)激模型組:加入終濃度為500 μmol/L H2O2培養(yǎng)基溶液刺激2 h后加入與正常對照組相同體積的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)組:SCP與SSP低劑量組(SCP-L與SSP-L)、SCP與SSP中劑量組(SCP-M與SSP-M)、SCP與SSP高劑量組(SCP-H與SSP-H),先加入終濃度為500 μmol/L H2O2溶液刺激2 h后,采用終質(zhì)量濃度分別為100、200、400 μg/mL SCP與SSP干預(yù)24 h。

1.3.4.2 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖率的影響

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞,每孔100 μL,接種密度為1×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),按照1.3.4.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率,按試劑盒說明書檢測各組吸光度,各組細(xì)胞存活率計(jì)算如公式(7)所示:

(7)

1.3.4.3 Calcein-AM/PI雙色熒光凋亡染色

Calcein-AM/PI熒光染色鑒別細(xì)胞內(nèi)活力的參數(shù)酯酶活性和細(xì)胞膜完整性,進(jìn)而來檢測活細(xì)胞與死細(xì)胞。選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于24孔板內(nèi),每孔體積0.5 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,按照1.3.4.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞后,用PBS洗滌細(xì)胞2～3次,每孔加入500 μL稀釋后的Calcein-AM溶液于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,PBS洗滌細(xì)胞3次,再加入200 μL稀釋后的PI溶液于37 ℃避光反應(yīng)5 min,PBS洗滌細(xì)胞2～3次,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4.4 HepG2細(xì)胞ROS水平測定

選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi),每孔體積2 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),按照1.3.4.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞后,每孔加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針,37 ℃避光反應(yīng)20 min后吸去探針,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次,熒光倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞形態(tài),采用酶標(biāo)儀于488 nm 激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長測定細(xì)胞中ROS含量。

1.3.4.5 HepG2細(xì)胞中MDA和GSH水平的測定

選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),每孔體積2 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),按照1.3.4.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞后,應(yīng)用ELISA法,參照試劑盒說明書對MDA和GSH進(jìn)行定量測定。

1.3.4.6 HepG2細(xì)胞中抗氧化物酶系活力的測定

選取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),每孔體積2 mL,接種密度為1.0×105個/mL,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),按照1.3.4.1節(jié)分組方法處理細(xì)胞后,ELISA法按照試劑盒說明書檢測SOD、GSH-Px和CAT活力。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 自由基清除能力

2.1.1 ·O2-清除能力

鄰苯三酚在弱堿性條件下會發(fā)生自氧化反應(yīng),形成一種新型的·O2-及有色中間體,可通過添加抗氧化劑來消除·O2-,從而降低其自身的氧化速度[13]。由圖1可知,在測量的樣品濃度范圍內(nèi),SCP、SSP濃度與其清除率呈明顯的正相關(guān)關(guān)系,但是低于維生素C對·O2-清除率。其中,在0.1～0.5 mg/mL,SCP對·O2-的清除作用強(qiáng)于SSP,然而當(dāng)樣品質(zhì)量濃度>1.0 mg/mL時,SSP清除·O2-能力優(yōu)于SCP,可能由于SCP的作用位點(diǎn)不同,在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時清除率達(dá)到最高,為58.61%。SCP、SSP的IC50值分別為3.15、1.70 mg/mL,IC50值越小,則說明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。與SCP消除·O2-能力相比,SSP的清除能力較高。

圖1 SCP和SSP的·O2-清除能力Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.1.2 ·OH清除能力

·OH清除能力是衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)[14],·OH是ROS中最活潑的氧自由基,也是毒性最大的自由基,是造成生物體損傷的主要因素。樣品中的H與·OH結(jié)合,通過減少·OH的積累量,進(jìn)一步使其在536 nm處的吸光度下降,從而反映SCP與SSP清除·OH的能力。圖2結(jié)果表明,隨著樣品濃度的升高,SCP與SSP對·OH的清除率逐漸增大。在0.1～1.0 mg/mL,SCP對·OH的清除能力高于SSP,但在1.5 mg/mL后,SCP對·OH的清除能力低于SSP,且SCP和SSP在2.0 mg/mL時對·OH的清除能力趨向于平緩。由此表明,SCP、SSP具有一定·OH清除活性,IC50值分別為2.11、1.66 mg/mL,因此SSP清除·OH能力優(yōu)于SCP。

圖2 SCP和SSP的·OH清除能力Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.1.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定性較強(qiáng)的有機(jī)氮基團(tuán),在甲醇溶劑中表現(xiàn)出暗紫色,能吸附抗氧化物的電子,從而使樣品的顏色發(fā)生變化,這種變化與所接收的電子數(shù)量成正比,當(dāng)抗氧化性物質(zhì)與DPPH自由基結(jié)合或發(fā)生替代,降低DPPH自由基數(shù)目,導(dǎo)致溶液顏色變淺,表現(xiàn)出在517 nm處的吸光度降低[15-16]。如圖3所示,SSP DPPH自由基清除能力高于SCP,在0.1～1.5 mg/mL,隨著樣品濃度的增大,兩者的清除能力呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL 時,SCP和SSP的清除能力幾乎達(dá)到最大值,分別為72.84%和78.49%。SCP、SSP都具有較好的DPPH自由基清除活性,IC50值分別為0.58、0.40 mg/mL,SSP清除DPPH自由基能力優(yōu)于SCP。

圖3 SCP和SSP的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.1.4 ABTS陽離子自由基清除能力

在氧化劑作用下,ABTS被氧化成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS陽離子自由基[17-18]。當(dāng)具有抗氧化活性的物質(zhì)與ABTS陽離子自由基反應(yīng)后,在734 nm處的吸光度降低,則說明該化合物具有ABTS陽離子自由基清除活性,吸光值越低則其清除率越高。由圖4可知,在0.1～1.5 mg/mL,ABTS陽離子自由基被SSP清除能力隨著樣品濃度的增大而增強(qiáng),且明顯高于SCP,在1.5 mg/mL時趨向于平緩,此時清除能力接近陽性對照組維生素C的清除能力,當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時達(dá)到最大值為 89.56%。SCP、SSP的IC50值分別為1.59、0.54 mg/mL,與SCP相比,SSP具有相對優(yōu)良的自由基清除能力,可作為一種潛在的抗氧化劑。

圖4 SCP和SSP的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.4 ABTS cation free radical scavenging ability of SCP and SSP

2.2 還原能力

2.2.1 Fe2+螯合能力

Fe2+作為一種過渡態(tài)金屬離子中最為強(qiáng)大的助氧化劑,通過Fenton反應(yīng)或Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生·OH。因此,具有Fe2+螯合能力的物質(zhì)就能間接抑制·OH的產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮抗氧化活性[19]。如圖5所示,在0.1～2.0 mg/mL,SCP與SSP的Fe2+螯合能力隨著樣品濃度的增大而增強(qiáng),且SSP的Fe2+螯合能力始終高于SCP,當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時,SSP的Fe2+螯合率達(dá)到最高為37.48%,SCP的Fe2+螯合率為31.61%。由此表明,SCP和SSP具有一定的Fe2+螯合能力,且SSP的Fe2+螯合能力優(yōu)于SCP。蛋白質(zhì)的金屬離子螯合能力可以通過與帶電荷的氨基酸殘基之間發(fā)生靜電作用來實(shí)現(xiàn),也可能在空間結(jié)構(gòu)上通過俘獲過渡態(tài)金屬離子的作用來完成,SSP這種作用優(yōu)于SCP。因此SSP更適合作為一種相對優(yōu)良的還原劑,通過螯合金屬離子,間接阻止自由基的形成,從而達(dá)到抗氧化的目的。

圖5 SCP和SSP的Fe2+螯合能力Fig.5 Fe2+ chelating ability of SCP and SSP

2.2.2 Fe3+還原能力

抗氧化物質(zhì)通過自身的還原作用給出電子從而達(dá)到清除自由基的目的。因此測定還原能力可以評估抗氧化劑提供電子或氫原子的潛力。還原能力測定是以普魯士藍(lán)生成量為指標(biāo),樣品將鐵氰化鉀的三價鐵還原成亞鐵氰化鉀的二價鐵,Fe3+與亞鐵氰化鉀可以發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生普魯士藍(lán)[20]。因此樣品的還原能力可以通過測定 700 nm 處的吸光值間接來體現(xiàn)。吸光值越大,表明樣品還原能力越強(qiáng)。由圖6可知,SSP的Fe3+還原能力優(yōu)于SCP,可能由于原料不同導(dǎo)致其堿液提取暴露出來的抗氧化肽含量存在差異。在0.1～1.5 mg/mL,SCP與SSP的Fe3+還原能力隨著樣品濃度的增大而增強(qiáng),在2.0 mg/mL時還原能力幾乎達(dá)到最高,分別為0.44和0.79,因此SSP表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原能力。

圖6 SCP和SSP的Fe3+還原能力Fig.6 Fe3+ reduction ability of SCP and SSP

2.3 HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激修復(fù)作用

2.3.1 SCP與SSP對 HepG2細(xì)胞存活率的影響

如圖7所示,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在400 μg/mL時,SSP處理細(xì)胞活力最高,對于SCP,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度>300 μg/mL時,細(xì)胞活力開始下降,說明HepG2細(xì)胞在超過該濃度下受損,但存活率幾乎都在90%以上,為該條件下細(xì)胞的正常存活率?？紤]到SCP和SSP對細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的調(diào)節(jié)作用可能與劑量有關(guān),同時為了研究不同濃度的SCP和SSP對細(xì)胞抗氧化能力的影響,選擇3種質(zhì)量濃度(100、200、400 μg/mL)的SCP和SSP進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖7 SCP和SSP對HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Effect of SCP and SSP on the survival rate of HepG2 cells

2.3.2 H2O2對HepG2細(xì)胞損傷、細(xì)胞活力測定

H2O2是引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的主要因素,是細(xì)胞內(nèi)最常用的氧自由基生成劑,它可以通過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi)部,產(chǎn)生其他自由基,主要是·O2-和·OH。由此產(chǎn)生的過量ROS將攻擊生物分子,導(dǎo)致細(xì)胞或組織損傷,因此常作為體外氧化應(yīng)激損傷的造模劑[21]。如圖8所示,在低濃度時H2O2對HepG2細(xì)胞損傷較輕,而濃度過大又會對細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷,所以一般應(yīng)選擇細(xì)胞存活率為50%～70%時的H2O2濃度,此時細(xì)胞既氧化損傷,又具有一定的恢復(fù)能力,因此選用500 μmol/L的H2O2干預(yù)2 h作為其造模條件用于后續(xù)研究。

圖8 不同濃度 H2O2對 HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.8 Effect of different concentration of H2O2on the survival rate of HepG2 cells

2.3.3 SCP與SSP對 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷修復(fù)作用

細(xì)胞存活率是體現(xiàn)外界因素對細(xì)胞損傷程度的最直觀指標(biāo)。細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激后會使胞內(nèi)ROS水平升高,對HepG2細(xì)胞造成氧化損傷進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至壞死。細(xì)胞存活率越高,說明HepG2細(xì)胞受到的氧化損傷越輕[22]。如圖9所示,與空白組相比,模型組細(xì)胞存活率顯著降低,只有56.71%,這表明H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建的氧化應(yīng)激模型成功。與模型組相比,經(jīng)過100、200、400 μg/mL SCP與SSP處理HepG2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的存活率隨著濃度增加顯著升高(P<0.05)。其中,在測定的濃度范圍內(nèi),SSP處理后的細(xì)胞存活率始終高于SCP,400 μg/mL時接近陽性對照組修復(fù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SCP與SSP在一定程度上可以對H2O2所造成的細(xì)胞損傷產(chǎn)生修復(fù)作用,且SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷修復(fù)作用效果優(yōu)于SCP。

圖9 不同濃度SCP與SSP對 H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷修復(fù)作用Fig.9 Effects of different concentrations of SCP and SSP on H2O2-induced oxidative stress injury and repair in HepG2 cells注:#和*表示與模型組相比,差異性顯著,L、M、H分別為100、200、400 μg/mL(下同)。

2.3.4 Calcein-AM/PI雙色熒光凋亡染色

Calcein-AM僅對活細(xì)胞染色,使細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色熒光,作為核染色染料的PI不會染色質(zhì)膜完整的活細(xì)胞,僅對死細(xì)胞的細(xì)胞核染色[23-24]。如圖10所示,與正常組相比,模型組細(xì)胞皺縮且細(xì)胞密度較低,綠色熒光較弱,紅色細(xì)胞核相對明顯,說明H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激后,促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而,與模型損傷組相比,加入不同濃度的SCP與SSP后,綠熒光強(qiáng)度均有所提高,死細(xì)胞的細(xì)胞核紅色熒光強(qiáng)度降低,且加入的SCP與SSP濃度越高,顯示的綠色熒光強(qiáng)度越高,紅色熒光強(qiáng)度越低,并顯示出濃度依賴性效應(yīng)。因此,SCP和SSP可以修復(fù)HepG2細(xì)胞受H2O2引起的形態(tài)學(xué)變化,并且SSP修復(fù)效果優(yōu)于SCP。

圖10 Calcein-AM/PI雙色熒光染色結(jié)果Fig.10 Calcein-AM/PI double color fluorescence staining results

2.3.5 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

正常細(xì)胞內(nèi)ROS生成和清除處于動態(tài)平衡。在外界刺激時胞內(nèi)ROS升高,過量ROS會對細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、生物膜造成氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的改變,發(fā)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡[25]。DCFH-DA熒光探針穿過質(zhì)膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)時,被胞內(nèi)酯酶水解成成無熒光的DCFH,DCFH被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化成DCF,可以產(chǎn)生綠色熒光。因此,細(xì)胞中的ROS水平可以通過熒光強(qiáng)度來顯示。如圖11、圖12所示,與正常組相比,模型組的DCF熒光強(qiáng)度和ROS含量顯著提高(P<0.05),ROS生成量是正常組的5.99倍,說明細(xì)胞遭受嚴(yán)重的氧化應(yīng)激。加入了不同濃度的SCP與SSP后的DCF熒光強(qiáng)度和ROS含量與模型組相比均顯著降低(P<0.05),且加入的SCP與SSP濃度越高,顯示的熒光強(qiáng)度和ROS含量越低。其中在測定濃度范圍內(nèi),SCP的DCF熒光強(qiáng)度和ROS含量始終高于SSP。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SCP與SSP能夠以降低H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS含量,從而發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的功能,對細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷起到一定的修復(fù)作用,且SSP對氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞內(nèi)過量ROS的清除作用優(yōu)于SCP。

圖11 不同濃度SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平熒光染色Fig.11 Fluorescence staining of ROS levels in HepG2 cells induced by H2O2 with different concentrations of SCP and SSP

圖12 不同濃度 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.12 Effects of different concentrations of SCP and SSP on intracellular ROS level of HepG2 cells induced by H2O2

2.3.6 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞GSH、MDA水平的影響

GSH是生物體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞中巰基的主要來源,其中在肝細(xì)胞中可達(dá)95%以上,是一種內(nèi)源性抗氧化劑,可有效清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物,是機(jī)體抗自由基的主要成分,在維持機(jī)體氧化還原平衡和免疫功能中發(fā)揮重要的作用[26-28];ROS水平過高可引起脂質(zhì)過氧化,直接增加MDA水平。MDA是由過氧化物多不飽和脂肪酸(主要是花生四烯酸)裂解形成的三碳化合物,被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一。此外,過量的MDA對腫瘤形成、細(xì)胞代謝紊亂和細(xì)胞膜功能障礙有負(fù)面影響。因此,MDA的多少直接反映了體內(nèi)過氧化的程度,間接反映了細(xì)胞損傷的程度。MDA含量越高,氧化應(yīng)激損傷越嚴(yán)重[29]。

如圖13所示,與空白組相比,H2O2誘導(dǎo)2 h后,HepG2細(xì)胞GSH顯著降低,MDA的含量顯著升高(P<0.05),模型組MDA水平顯著升高表明細(xì)胞受到過量的ROS刺激后,細(xì)胞膜發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷。與模型組相比,經(jīng)過不同質(zhì)量濃度(100、200、400 μg/mL)SCP與SSP處理氧化損傷的HepG2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著升高,MDA含量顯著降低(P<0.05),并且在400 μg/mL時,MDA含量接近陽性對照組維生素C,分別為4.83、5.2 nmol/mL,結(jié)果與清除ROS的能力一致,而SSP處理后的GSH含量高于維生素C組,這說明經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后,SSP對HepG2的細(xì)胞膜損傷產(chǎn)生更好的修復(fù)作用。SCP和SSP能顯著對細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化損傷起到改善作用,自由基對機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷得到較好的修復(fù)作用。

a-GSH;b-MDA圖13 不同濃度 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞GSH、MDA水平的影響Fig.13 Effects of different concentrations of SCP and SSP on GSH and MDA in HepG2 cells induced by H2O2

結(jié)果表明,SSP對HepG2細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激后降低MDA和提升GSH含量能力優(yōu)于SCP,在高濃度下,SSP和標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑維生素C的抗氧化活性接近?；谏鲜鼋Y(jié)果,從南、北五味子中提取的蛋白質(zhì)通過減少ROS的產(chǎn)生來阻止H2O2誘導(dǎo)的MDA積累,并且有效提升GSH含量。其中,SSP表現(xiàn)出更強(qiáng)的修復(fù)作用,可能是SSP側(cè)鏈上存在著更多的電子/質(zhì)子供體基團(tuán),具有更強(qiáng)的自由基清除能力,從而對HepG2細(xì)胞氧化損傷起到更好的修復(fù)作用,與馬萍等[30]研究的紫花蕓豆肽對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷修復(fù)作用的結(jié)果一致。

2.3.7 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化物酶系活力的影響

SOD、CAT和GSH-Px均為細(xì)胞抗氧化物酶系中的重要組成部分,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,這些抗氧化酶會作為內(nèi)源性抗氧化劑在細(xì)胞內(nèi)清除自由基來抑制過氧化反應(yīng)。SOD催化·O2-分解為H2O2和O2,進(jìn)而清除自由基[31];CAT通過清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基,催化H2O2分解為H2O,維持機(jī)體氧化還原平衡[32-33];GSH-Px能催化GSH變?yōu)檠趸凸入赘孰?將過氧化物還原成羥基化合物,與CAT促進(jìn)H2O2分解,以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能[34]。體內(nèi)抗氧化物酶系活力是生物氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞動態(tài)平衡的重要指標(biāo)。

如圖14所示與正常組相比,H2O2作用HepG2細(xì)胞2 h后,SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著降低(P<0.05),抑制率分別為44.80%、54.25%和48.23%,說明H2O2干擾了機(jī)體內(nèi)的抗氧化劑調(diào)節(jié)機(jī)制,降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系的活力,不足以應(yīng)付外界刺激,細(xì)胞受到嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷;與模型組相比,經(jīng)維生素C和SCP與SSP低、中和高劑量處理組的SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著升高(P<0.05),特別是高劑量的SSP作用24 h后,SOD、CAT和GSH-Px活力分別提升了53.33、125.34、182.35 U/mL,表明SSP表現(xiàn)出更好的抗氧化能力。SCP和SSP可以通過酶促抗氧化系統(tǒng)對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生修復(fù)作用,SSP比SCP表現(xiàn)出更加優(yōu)良的提升抗氧化酶系的能力,這可能由于SSP側(cè)鏈存在更多的氨基酸殘基,發(fā)揮出更好的提供氫或質(zhì)子的作用,這與郭增旺等[35]的研究結(jié)果相似。

a-SOD含量;b-CAT含量;c-GSH-Px含量圖14 不同濃度 SCP與SSP對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化物酶系活力的影響Fig.14 Effects of different concentrations of SCP and SSP on antioxidant enzyme activity of HepG2 cells induced by H2O2

3 結(jié)論

本研究以SSP、SCP為研究對象,基于前期對SCP的研究基礎(chǔ),首次應(yīng)用經(jīng)典化學(xué)法結(jié)合細(xì)胞驗(yàn)證,比較了同屬不同種的五味子蛋白體外清除自由基能力和還原能力,以H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型,研究了SSP、SCP對細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)、ROS水平、GSH含量、MDA水平和抗氧化酶系活力的影響。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明SSP具有更強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力。對于H2O2所引起的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激,SCP和SSP顯著提升細(xì)胞存活率,在一定程度上可以改善細(xì)胞氧化應(yīng)激后的形態(tài),減少細(xì)胞凋亡。SCP和SSP可以有效抑制細(xì)胞中ROS和MDA水平,維持細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性,增加GSH含量和恢復(fù)抗氧化酶系活力,尤其SSP作用效果更好。綜上所述,本研究可為SCP和SSP在抗氧化功能性保健食品和健康產(chǎn)品中的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù),并為后續(xù)闡明其修復(fù)氧化應(yīng)激損傷的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。