于夢(mèng)淇,黃淑貞,劉雨菲,楊華,曹莉,張立實(shí),陳錦瑤*

1(四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院,四川 成都,610041)2(四川省食品安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都,610041)

疲勞是指由于睡眠不足、長(zhǎng)時(shí)間腦力或體力活動(dòng)、或是長(zhǎng)時(shí)間的壓力或焦慮而導(dǎo)致的一種疲憊困倦的狀態(tài)[1]。研究顯示,30%～50%的受訪群眾有疲勞癥狀[2]。疲勞可分為心理疲勞和體力疲勞,其中體力疲勞又稱運(yùn)動(dòng)疲勞,表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)耐力下降以及無(wú)法維持長(zhǎng)時(shí)間或劇烈活動(dòng)[3]。長(zhǎng)期疲勞會(huì)導(dǎo)致一系列繼發(fā)問題,如身體功能障礙、能量失衡、焦慮、抑郁、認(rèn)知障礙、睡眠質(zhì)量差等,甚至?xí)铀俾阅I病等疾病的發(fā)生,嚴(yán)重影響身體健康[4-6]。因此,研發(fā)具有緩解體力疲勞的功能食品具有積極的健康促進(jìn)意義。

靈芝(Ganodermalucidum)是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用真菌,含有多酚類、多糖類、類固醇類、三萜類化合物等天然生物活性成分,具有抗炎、抗菌、保肝、免疫調(diào)節(jié)等作用[7]。靈芝孢子是靈芝子實(shí)體的生殖細(xì)胞,其藥用價(jià)值明顯高于靈芝子實(shí)體[8]。靈芝孢子油(Ganodermalucidumspore oil,GLSO)是通過超臨界二氧化碳萃取技術(shù)從破壁靈芝孢子中提取得到的脂溶性活性物質(zhì)[9-10]。研究表明,靈芝孢子油具有良好的抗氧化作用[11]及增強(qiáng)免疫功能[12-16]。目前關(guān)于靈芝在緩解體力疲勞上的相關(guān)研究主要集中在靈芝子實(shí)體、靈芝菌絲體和靈芝復(fù)方制劑上,對(duì)于靈芝孢子油的研究較少且其緩解體力疲勞的機(jī)制尚不明確。

因此,本研究參考《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法(2023年版)》中緩解體力疲勞的檢驗(yàn)方法,采用不同劑量的靈芝孢子油對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃,結(jié)合負(fù)重游泳時(shí)間、血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肝糖原、肌糖原、血乳酸(blood lactic acid, BLD)以及腓腸肌糖原及肌細(xì)胞調(diào)亡等指標(biāo)的測(cè)定,探討靈芝孢子油緩解體力疲勞的作用及其體制,以期為靈芝孢子油抗疲勞保健食品的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

靈芝孢子油,廣州某公司,人體推薦攝入量為2.4 g/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性KM小鼠144只,體重18～22 g[北京華阜康生物科技股份有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2019-0008],飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院屏障級(jí)動(dòng)物房,飼料與墊料均由動(dòng)物房提供。飼養(yǎng)條件:溫度20～26 ℃,濕度40%～70%,明暗交替周期為12 h。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西第四醫(yī)院/華西公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào):Gwll2023001)。

小鼠按體重隨機(jī)分為4組,即溶劑對(duì)照組、靈芝孢子油低、中、高劑量組,每組36只動(dòng)物,共分為4批。第I批的8只小鼠用于負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn),第II批的8只小鼠用于測(cè)定肝糖原,第III批的8只小鼠用于BUN測(cè)定、肌糖原測(cè)定以及后續(xù)機(jī)制指標(biāo)的測(cè)定,第IV批的12只小鼠用于BLD測(cè)定。

1.3 劑量選擇及受試物給予方式

靈芝孢子油的人體推薦劑量為2.4 g/d,成人體重以60 kg計(jì),則每日推薦劑量為0.04 g/kg·bw。靈芝孢子油低、中、高劑量組分別為人體推薦劑量的5、10、20倍,即劑量分別為0.2、0.4、0.8 g/kg·bw。各組受試物溶于植物調(diào)和油配制。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,經(jīng)口灌胃給予受試物,每日1次,灌胃體積為1 mL/100 g·bw,溶劑對(duì)照組給予等量植物調(diào)和油,連續(xù)干預(yù)30 d。

1.4 主要儀器與試劑

AUY120分析天平,日本島津shimadzu公司;D3024臺(tái)式高速微量離心機(jī)、D3024R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、MX-S渦旋混合器,美國(guó)賽洛捷克SCILOGEX公司;THZ-82A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器,常州朗越儀器制造有限公司;KZ-III-F高速低溫組織研磨儀,武漢賽維爾生物科技有限公司;TL-420D恒溫水箱,江蘇天力醫(yī)療器械有限公司;BK-200全自動(dòng)生化分析儀,山東BIOBASE博科控股集團(tuán);SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所。

濃硫酸,成都市科隆化學(xué)品有限公司;4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)多聚甲醛溶液、蘇木素染液套裝、DAB顯色試劑盒(20×)、 PBS、TritonX-100,中國(guó)Biosharp公司;糖原試劑盒,南京建成生物工程研究所;高碘酸-希夫氏反應(yīng)(periodic acid Schiff reagent, PAS)染液套裝、DAB (SA-HRP) 原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)試劑盒,武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 體重和一般情況

干預(yù)期內(nèi)每隔1周稱量1次小鼠體重并記錄。每天觀察小鼠的一般情況,包括活動(dòng)狀態(tài)、食欲、毛發(fā)光澤等。

1.5.2 臟器系數(shù)

取第III批小鼠的肝臟和腎臟,稱重并計(jì)算臟器系數(shù)由公式(1)所示:

(1)

1.5.3 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

使用第I批的8只小鼠按照《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法(2023年版)》中緩解體力疲勞檢驗(yàn)方法進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。末次給予受試物30 min后,將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳,水深約30 cm,水溫為(25±1.0) ℃,游泳過程中注意使小鼠四肢保持運(yùn)動(dòng)。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間,即負(fù)重游泳時(shí)間。

1.5.4 糖原、血尿素氮及血乳酸測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第30天,末次給受試物30 min后,將第III批小鼠置于溫度為30 ℃的水中不負(fù)重游泳90 min,休息60 min后立即拔眼球采血。血樣在4 ℃冰箱靜置過夜后離心(3 500 r/min, 15 min),收集血清,用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定BUN。取第III批小鼠左側(cè)腓腸肌,按照試劑盒說明書測(cè)定肌糖原的含量。取第II批小鼠的肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后凍存?zhèn)溆?按照試劑盒說明書采用蒽酮比色法測(cè)定肝糖原含量。第IV批小鼠在末次給予受試物30 min后采眼內(nèi)眥血,采血后不負(fù)重游泳10 min立即擦干采眼內(nèi)眥血,休息20 min后再次采眼內(nèi)眥血,用乳酸儀測(cè)定BLD值。血乳酸曲線下面積計(jì)算由公式(2)所示:

(2)

1.5.5 組織病理學(xué)檢查

取第III批小鼠右側(cè)腓腸肌,于4%多聚甲醛溶液中固定24 h,脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟至水,蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察腓腸肌病理學(xué)變化。PAS染色觀察腓腸肌糖原含量變化,顯微鏡鏡檢并采集圖像,每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)視野拍照,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件將切片中紫紅色作為判斷所有照片肌糖原沉積(陽(yáng)性)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出陽(yáng)性面積占比,陽(yáng)性面積占比計(jì)算由公式(3)所示:

(3)

1.5.6 TUNEL染色觀察腓腸肌細(xì)胞凋亡

取第III批小鼠右側(cè)腓腸肌,脫水、包埋、切片、脫蠟至水等同1.5.5節(jié),按照TUNEL試劑盒說明書操作,DAB顯色,復(fù)染細(xì)胞核,最后脫水封片,于顯微鏡下觀察并采集圖像,每張切片隨機(jī)挑選3個(gè)視野,陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為棕黃色,分析得出TUNEL陽(yáng)性率,TUNEL陽(yáng)性率計(jì)算由公式(4)所示。

(4)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布和方差齊的數(shù)據(jù),采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnet’t檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)可進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)化,若轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)仍方差不齊,則采用Tamhane’s T2法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝孢子油對(duì)小鼠體重及一般情況的影響

灌胃30 d期間,各組小鼠的一般情況較好,食欲正常,毛發(fā)有光澤。與溶劑對(duì)照組相比,靈芝孢子油組小鼠更加活潑,喜攀爬嬉鬧。各組小鼠體重變化曲線及增重情況如圖1所示,干預(yù)期內(nèi),各組小鼠體重穩(wěn)步增加,但各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 靈芝孢子油對(duì)小鼠體重的影響(n=36)Fig.1 Effect of GLSO on body weight (n=36)

2.2 靈芝孢子油對(duì)臟器系數(shù)的影響

各組小鼠臟器系數(shù)結(jié)果如圖2所示,靈芝孢子油各劑量組小鼠的肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

a-肝臟臟器系數(shù);b-腎臟臟器系數(shù)圖2 靈芝孢子油對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響(n=8)Fig.2 Effect of GLSO on liver and kidney coefficient (n=8)

2.3 靈芝孢子油對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)生的直接表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)耐力下降,而負(fù)重游泳時(shí)間可直接反映機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力情況,即負(fù)重游泳時(shí)間越長(zhǎng),機(jī)體產(chǎn)生疲勞越慢,受試物的抗疲勞效果越好[17-19]。各組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間結(jié)果如圖3所示,靈芝孢子油各組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間均高于溶劑對(duì)照組,分別增加了1.72%、101.93%和42.30%,其中靈芝孢子油中劑量組與溶劑對(duì)照組相比負(fù)重游泳時(shí)間極顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。表明靈芝孢子油可提高小鼠的抗疲勞能力。

圖3 靈芝孢子油對(duì)負(fù)重游泳時(shí)間的影響(n=8)Fig.3 Effect of GLSO on weight-bearing swimming time (n=8)注:與溶劑對(duì)照組相比,**表示差異極顯著(P<0.01),*表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.4 靈芝孢子油對(duì)小鼠血清BUN的影響

BUN是評(píng)價(jià)人體承受體力負(fù)荷能力的敏感指標(biāo),反映體內(nèi)蛋白質(zhì)氨基酸等含氮物質(zhì)的分解代謝情況,體內(nèi)BUN含量與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷呈正相關(guān)[20-22]。各組小鼠BUN結(jié)果如圖4所示。靈芝孢子油低、中、高劑量組小鼠的BUN水平均極顯著低于溶劑對(duì)照組(P<0.01),這表明靈芝孢子油能有效降低機(jī)體蛋白質(zhì)的供能比例,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)耐力運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性。

圖4 靈芝孢子油對(duì)血清BUN的影響(n=8)Fig.4 Effect of GLSO on BUN (n=8)注:靈芝孢子油中劑量組由于負(fù)重游泳時(shí)有1只意外死亡,導(dǎo)致最終樣本為7例。

2.5 靈芝孢子油對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

糖原是機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)的首要供能物質(zhì),肝糖原和肌糖原分別是機(jī)體能量的儲(chǔ)存和利用形式。運(yùn)動(dòng)時(shí),機(jī)體消耗肌糖原供能,同時(shí)消耗肝糖原以維持體內(nèi)血糖水平,因此運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度越大,機(jī)體內(nèi)糖原含量越低[23-25]。各組小鼠肝糖原和肌糖原結(jié)果如圖5所示。靈芝孢子油各劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原含量與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05),說明靈芝孢子油對(duì)機(jī)體的糖原含量無(wú)較大影響。由于肌糖原含量是采用第III批小鼠的腓腸肌進(jìn)行測(cè)定,該批小鼠不負(fù)重游泳后消耗了較多糖原,因此肌糖原含量整體較低。

a-肝糖原含量;b-肌糖原含量圖5 靈芝孢子油對(duì)肝糖原和肌糖原含量的影響(n=8)Fig.5 Effect of GLSO on hepatic and muscular glycogen level (n=8)注:靈芝孢子油中劑量組由于負(fù)重游泳時(shí)有1只意外死亡,導(dǎo)致肌糖原含量最終樣本為7例。

2.6 靈芝孢子油對(duì)小鼠BLD水平的影響

在長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中,肌肉的有氧供能轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)氧酵解,糖原被迅速消耗,產(chǎn)生大量乳酸,乳酸在血液中堆積導(dǎo)致體內(nèi)pH值下降,導(dǎo)致疲勞產(chǎn)生[26-29]。各組小鼠BLD水平及血乳酸曲線下面積如圖6所示。游泳前,各組小鼠的BLD水平之間無(wú)顯著差異(P>0.05);游泳后0 min,靈芝孢子油中和高劑量組小鼠的BLD含量均極顯著低于溶劑對(duì)照組(P<0.01);休息20 min后,靈芝孢子油各劑量組小鼠的BLD含量均極顯著低于溶劑對(duì)照組(P<0.01)。與溶劑對(duì)照組相比,靈芝孢子油各劑量組小鼠的血乳酸曲線下面積均極顯著降低(P<0.01),且BLD水平及曲線下面積隨劑量升高而降低,呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系,表明靈芝孢子油能有效抑制乳酸生成或加速乳酸分解,起到緩解體力疲勞的作用。

a-游泳前BLD值;b-游泳后0 min的BLD值;c-休息20 min后的BLD值;d-血乳酸曲線下面積圖6 靈芝孢子油對(duì)BLD水平及血乳酸曲線下面積的影響(n=12)Fig.6 Effect of GLSO on BLD and area under curve of the blood lactic acid (n=12)

2.7 靈芝孢子油對(duì)小鼠組織病理學(xué)的影響

HE染色用于觀察腓腸肌病理學(xué)變化,PAS染色用于觀察腓腸肌肌糖原含量[30]。HE染色和PAS染色結(jié)果見圖7。HE染色顯示各組小鼠肌纖維排列緊密整齊,未見明顯纖維組織或細(xì)胞增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。PAS染色顯示靈芝孢子油高劑量組腓腸肌著色最深。定量分析糖原陽(yáng)性面積結(jié)果見圖8。與溶劑對(duì)照組相比,靈芝孢子油高劑量組的肌糖原陽(yáng)性面積顯著增加(P<0.05),表明靈芝孢子油高劑量組可減少運(yùn)動(dòng)后小鼠的肌糖原消耗,但在此前的肌糖原生化檢測(cè)中未見此結(jié)果,說明靈芝孢子油是否通過調(diào)控糖原代謝發(fā)揮抗疲勞作用還需進(jìn)一步研究。

圖7 各組小鼠腓腸肌HE染色和PAS染色情況(×40)Fig.7 The HE staining and PAS staining of gastrocnemius in each group (×40)注:藍(lán)色箭頭為PAS染色陽(yáng)性。

圖8 靈芝孢子油對(duì)小鼠腓腸肌糖原的影響(n=5)Fig.8 Effect of GLSO on muscular glycogen level of gastrocnemius (n=5)

2.8 靈芝孢子油對(duì)小鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色用于觀察腓腸肌細(xì)胞凋亡情況。TUNEL染色典型示意圖和TUNEL陽(yáng)性率結(jié)果分別見圖9和圖10。TUNEL染色顯示各組均只有少量細(xì)胞核中存在棕色顆粒,僅少量細(xì)胞凋亡。溶劑對(duì)照組存在更多的棕色細(xì)胞核,靈芝孢子油低和高劑量組的棕色細(xì)胞核較少。TUNEL陽(yáng)性率結(jié)果顯示,與溶劑對(duì)照組相比,靈芝孢子油低劑量組凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05),靈芝孢子油高劑量組陽(yáng)性率降低但無(wú)顯著差異(P>0.05)。TUNEL結(jié)果表明靈芝孢子油可能通過降低細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗疲勞作用。

a-溶劑對(duì)照組;b-靈芝孢子油低劑量組;c-靈芝孢子油中劑量組;d-靈芝孢子油高劑量組圖9 各組小鼠腓腸肌TUNEL染色情況(×40)Fig.9 The TUNEL staining of gastrocnemius in each group (×40)注:藍(lán)色箭頭為TUNEL染色陽(yáng)性。

圖10 靈芝孢子油對(duì)小鼠腓腸肌細(xì)胞凋亡的影響(n=5)Fig.10 Effect of GLSO on apoptotic rate of injured gastrocnemius muscle tissue of mice (n=5)

3 結(jié)論

靈芝孢子油可延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間,減少BUN產(chǎn)生以及加速BLD的清除,依據(jù)《保健食品功能檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法(2023年版)》中緩解體力疲勞方法的結(jié)果判定,可認(rèn)為該靈芝孢子油受試物具有緩解體力疲勞的作用,其機(jī)制可能與減少糖原消耗及減弱腓腸肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。