屈航英 閆鵬云 張佳 陳強(qiáng)

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心外科,陜西 西安 710061;2.西安市第三醫(yī)院放療科,陜西 西安 710000;3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科,陜西,西安 710061)

在我國,乳腺癌是女性常見的腫瘤之一,其死亡率僅次于肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌,嚴(yán)重威脅著女性的身心健康及生活質(zhì)量。近年來我國乳腺癌的發(fā)生逐年增加而且更趨于年輕化,而且也是年輕女性的主要死因。缺氧區(qū)域的存在為局部進(jìn)展期乳腺癌的常見特征,而在正常乳腺組織中是不存在的[1]。缺氧與乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)[2-3]。前期課題組發(fā)現(xiàn)缺氧模型下低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)與HIP68在乳腺癌組織中表達(dá)明顯正相關(guān)且促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增生及侵襲轉(zhuǎn)移[4-5]。HIP68在乳腺癌組織中高表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,本研究我們將進(jìn)一步探討HIP68通過何種途徑參與乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012—2013年乳腺癌組織標(biāo)本共73例,均經(jīng)術(shù)后病理診斷且臨床資料詳實(shí)。所有標(biāo)本均選取自女性乳腺癌患者,年齡37～69歲,其中23例為乳腺小葉癌標(biāo)本,50例為乳腺導(dǎo)管癌標(biāo)本。所有標(biāo)本在手術(shù)前患者均未經(jīng)過系統(tǒng)治療。標(biāo)本使用獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞與主要試劑 兩種乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和MDA-MB-231)和人正常乳腺上皮細(xì)胞SK-BR-3購自中科院上海細(xì)胞庫。si-HIP68、si-RAP1B及對照shRNA(上海吉凱),Lipofectamine2000(Invitrogen,CA,USA),PVDF膜(Millipore公司),HIP68兔抗人單克隆抗體(Abcam公司),RAP1B兔抗人單克隆抗體(Abcam公司),β-actin兔抗人單克隆抗體(GAPDH),辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Abcam公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用化學(xué)藥物CoCl2·6H2O構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型,用MTT實(shí)驗(yàn)篩選合適的CoCl2·6H2O濃度,確認(rèn)最終的藥物作用梯度為0、50、100、150、200、250 μg/mL,0 μg/mL為對照組。缺氧乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7用含有10%FBS(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,1640)中培養(yǎng),乳腺正常上皮細(xì)胞系SK-BR-3細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基,含10% 胎清培養(yǎng),3種細(xì)胞都在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每隔一天交換一次,細(xì)胞每3天傳代(1∶3)。通過將HIP68、RAP1B編碼序列克隆到pIRES/Red載體中實(shí)現(xiàn)過表達(dá),當(dāng)80%～90%匯合時,基于所提供的方向,通過Lipofectamine 2000用適當(dāng)?shù)臉?gòu)建體轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后6 h用新鮮的完整環(huán)境替換環(huán)境,并在轉(zhuǎn)染后24～48 h收集細(xì)胞用于下一次使用。Control組不做任何處理,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體細(xì)胞為NC組,轉(zhuǎn)染相應(yīng)的shRNA為實(shí)驗(yàn)組。

1.4 免疫組化染色 將蓋玻片先泡酸處理后洗滌干凈、高壓滅菌后放入24孔培養(yǎng)板中,取對數(shù)生長期細(xì)胞,以1×105個/孔接種于24孔,待培養(yǎng)的細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～80%,取出細(xì)胞爬片,1×PBS漂洗,3 min×3次;4%多聚甲醛固定細(xì)胞,于4 ℃放置30 min;1×PBS漂洗,3 min×3次;0.5%TritonX-100(1×PBS配制)孵育,室溫10 min;1×PBS漂洗3 min×3次;3%H2O2室溫孵育10 min;1×PBS漂洗,3 min×3次;封閉血清室溫孵育10 min,傾去不洗;一抗孵育(陰性對照用1×PBS孵育),于濕盒中4 ℃過夜;1×PBS 漂洗5 min×3 次;生物素標(biāo)記二抗工作液室溫孵育30 min ;1×PBS 漂洗5 min×3 次;辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液室溫孵育 30 min;1×PBS 漂洗5 min×3次;DAB 顯色;自來水充分沖洗;蘇木素復(fù)染;鹽酸酒精分化,淡氨水反藍(lán);75%、95%、無水乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片;顯微鏡下觀察,采用 DeltaPixViewer 軟件對圖像進(jìn)行采集。

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 提取處理后腫瘤細(xì)胞蛋白,BCA法測定樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE對蛋白進(jìn)行分離,之后轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,一抗4 ℃孵育過夜,洗膜,二抗孵育1～2 h,洗膜,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑檢測,顯影曝光得到目的蛋白表達(dá)條帶。

1.6 Real-time PCR檢測靶基因mRNA表達(dá) 應(yīng)用Lipid RNeasy Mini Kit RNA(QAIGEN公司)提取不同細(xì)胞中的總RNA,使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,利用SYBR Green I Master Mix(TAKARA)試劑盒在BioRad公司的iQ5實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測mRNA的表達(dá)。

1.7 MTT檢測細(xì)胞的增殖能力 將不同細(xì)胞(2×103個/孔)接種至96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,不同干預(yù)后繼續(xù)孵育48 h。每孔加入20 μL的MTT(5 mg/mL),37 ℃孵育4 h。然后吸去培養(yǎng)基,加入150 μL的DMSO,振蕩10 min至甲瓚結(jié)晶完全溶解。利用分光光度計(jì)測量572 nm處吸光度,計(jì)算細(xì)胞的相對增殖率。

1.8 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 使用預(yù)先鋪好Matrigel孔隙大小為8 μm的24孔Transwell板(BD),待細(xì)胞消化好后,用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,離心去培養(yǎng)液后再使用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105。Transwell板上室加入200 μL細(xì)胞懸液,下室加入0.6 mL含10% FBS的培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。將上室置于多聚甲醛中固定15 min,然后用結(jié)晶紫染色5 min,用棉簽擦去上室室內(nèi)未穿過膜的細(xì)胞,在高倍顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。每個樣本取5個高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)最后取均值。

2 結(jié)果

2.1 HIP68、RAP1B在乳腺癌組織中的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示,HIP68蛋白和RAP1B蛋白表達(dá)均位于細(xì)胞核或細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),見圖1、2。HIP68和RAP1B蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織(P<0.001),見表1。

表1 HIP68和RAP1B在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異

圖1 HIP68在乳腺癌組織中的表達(dá) (40×)

圖2 RAP1B在乳腺癌組織中的表達(dá) (40×)

2.2 HIP68、RAP1B在乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 73例乳腺癌患者組織中HIP68表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),與患者的腫瘤類型、年齡、腫瘤位置等無關(guān)(P>0.05);RAP1B表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR狀態(tài)相關(guān)(P<0.05),與患者的腫瘤類型、年齡、腫瘤位置等無關(guān)(P>0.05),見表2。Spearman’s相關(guān)性分析結(jié)果顯示,HIP68表達(dá)與RAP1B表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.427,P<0.001),見表3。

表2 HIP68和RAP1B與乳腺癌臨床病理數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

表3 HIP68和RAP1B表達(dá)相關(guān)性分析

2.3 細(xì)胞水平檢測HIP68和RAP1B表達(dá)情況 用不同濃度的CoCl2·6H2O作用乳腺癌細(xì)胞系24 h后,采用Western blot及qRT-PCR檢測各組HIP68、RAP1B表達(dá)情況顯示,隨著CoCl2·6H2O藥物濃度的增高,RAP1B的表達(dá)在3種乳腺癌細(xì)胞系中也在逐漸增加,同時HIP68表達(dá)水平隨著缺氧程度的增加而逐漸增高(P<0.05);HIP68在MCF-7、MDA-MB-231的表達(dá)水平高于SK-BR-3細(xì)胞(P<0.05),見圖3。

圖3 缺氧模型中HIP68/RAP1B蛋白和mRNA在3種乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.4 沉默HIP68對RAP1B蛋白的影響及對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用si-HIP68轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進(jìn)行RAP1B測定蛋白表達(dá)情況和腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染si-HIP68為si-HIP68組。結(jié)果顯示沉默HIP68蛋白后可以顯著的抑制RAP1B蛋白的表達(dá)(P<0.05),見圖4。細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,si-HIP68轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力較Control組明顯降低,低表達(dá)HIP68可以顯著抑制MDA-MB-231和MCF-7的增殖及侵襲能力(P<0.001),見圖5。

圖4 沉默HIP68抑制RAP1B蛋白表達(dá)

圖5 沉默HIP68抑制乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移

2.5 過表達(dá)HIP68對RAP1B蛋白的影響及對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用pIRES/Red-HIP68轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進(jìn)行RAP1B測定蛋白表達(dá)情況和腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染pIRES/Red-HIP68為pIRES/Red-HIP68組。結(jié)果顯示過表達(dá)HIP68蛋白后RAP1B蛋白也明顯高表達(dá)(P<0.05),見圖6。細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pIRES/Red-HIP68轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力較Control組明顯增強(qiáng),過表達(dá)HIP68可以顯著增強(qiáng)MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵襲能力(P<0.05),見圖7。

圖6 過表達(dá)HIP68促進(jìn)RAP1B蛋白表達(dá)

圖7 過表達(dá)HIP68促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移

2.6 沉默RAP1B對HIP68蛋白的影響及對生物學(xué)行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用si-RAP1B轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進(jìn)行HIP68測定蛋白表達(dá)情況和腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染si-RAP1B為si-RAP1B組。結(jié)果顯示沉默RAP1B蛋白后對HIP68蛋白影響不大(P=0.13),見圖8。細(xì)胞增殖、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,si-RAP1B轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力較Control組明顯降低,低表達(dá)RAP1B可以顯著抑制MDA-MB-231和MCF-7增殖及侵襲能力(P<0.05),見圖9。

圖8 沉默RAP1B蛋白表達(dá)情況

圖9 沉默RAP1B抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移

2.7 過表達(dá)RAP1B對HIP68蛋白的影響及對生物學(xué)行為的影響 缺氧環(huán)境下應(yīng)用pIRES/Red-RAP1B轉(zhuǎn)染MDA-MB-231和MCF-7 24 h后進(jìn)行HIP68測定蛋白表達(dá)情況和腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的測定,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Control組,轉(zhuǎn)染不帶目的基因的空載體為NC組,轉(zhuǎn)染pIRES/Red-RAP1B為PIRES/Red-RAP1B組。結(jié)果顯示過表達(dá)RAP1B蛋白后對HIP68蛋白影響不大(P=0.13),見圖10。細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pIRES/Red-RAP1B轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力較Control組明顯增強(qiáng),過表達(dá) RAP1B可以顯著促進(jìn)MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵襲能力(P<0.05),見圖11。

圖10 過表達(dá)RAP1B蛋白表達(dá)情況

圖11 過表達(dá)RAP1B促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移

2.8 HIP68/RAP1B免疫共沉淀結(jié)果 進(jìn)一步免疫共沉淀結(jié)果提示HIP68與RAP1B可特異性結(jié)合,乳腺癌組織中研究發(fā)現(xiàn)HIP68與RAP1B表達(dá)呈正相關(guān),且沉默RAP1B對HIP68無影響,低表達(dá)或高表達(dá)HIP68相應(yīng)地會引起RAP1B低表達(dá)或高表達(dá),見圖12。提示RAP1B可能為HIP68基因的下游。

圖12 HIP68/RAP1B免疫共沉淀結(jié)果

3 討論

乳腺癌作為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,具有增長快、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),其病死率約占全球惡性腫瘤的25%,嚴(yán)重威脅著女性健康[6]。目前乳腺癌的治療逐步形成個體化的綜合治療,積極尋找分子靶向治療提高無病生存期和乳腺癌的總生存期至關(guān)重要。

課題組一直致力于乳腺癌的研究,前期也已證實(shí)HIP68在乳腺癌組織中高表達(dá),HIP68高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長增殖、遷移和侵襲。

1999年,我們課題組開始用cDNA microarrays技術(shù)研究缺氧對基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)缺氧能強(qiáng)烈誘導(dǎo)EST表達(dá)序列EST 188825(GenBank Accession Number：AA799328,基因名稱為FAM111A)。這項(xiàng)研究結(jié)果與2002年Bernaudin等[7]的研究結(jié)果一致,同樣顯示在缺氧再氧合時通過基因芯片篩查技術(shù)發(fā)現(xiàn)EST 188825基因在新生鼠的各個組織(腦組織、心臟組織、腎臟組織、肺組織、肝組織等)中均呈現(xiàn)不同程度(數(shù)倍到幾十倍不等)的高表達(dá)狀態(tài)。隨后課題組根據(jù)EST 188825 的核苷酸序列設(shè)計(jì)了引物,用RACE技術(shù)克隆了EST 188825的全長cDNA 序列,用體外蛋白翻譯技術(shù)證實(shí)該基因表達(dá)分子量為68 kDa的蛋白。該cDNA是在缺氧環(huán)境中高表達(dá)被發(fā)現(xiàn)的,且編碼的蛋白分子量為68 kDa,因此把其命名為HIP68。到目前為止,HIP68(FAM111A)基因的功能是未知的,國內(nèi)外對該基因的研究也很少,大多是近幾年研究報道的。HIP68位于常染色體11q12附近16kb處,編碼含有611個氨基酸的核表達(dá)蛋白[8-10]。2012年有報道稱SV40病毒的LT抗原可以與HIP68特異性的相互作用,LT抗原通過損耗HIP68來穩(wěn)固和重建病毒在宿主中的表型,提示HIP68可能具有抗病毒的特性;該研究還發(fā)現(xiàn)HIP68的表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性[11]。2012年Nature Genetics報道稱HIP68基因的突變可能與日本男性前列腺癌易感性有關(guān)[8];隨后在2014年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)這可能是由于HIP68基因可以調(diào)控雄激素受體有關(guān)[12]。2013年有研究發(fā)現(xiàn)HIP68的高表達(dá)與糖尿病的發(fā)病有關(guān),可能是由于HIP68的高表達(dá)影響了胰島B細(xì)胞的存活[13]。Kenny-Caffey氏綜合癥是一種相當(dāng)罕見的遺傳性骨骼疾病,一般表現(xiàn)為出生后生長遲滯,身材短小,大頭,臉部有輕微的畸形,前額微凸,高的發(fā)際線,眉毛與睫毛較不明顯;且骨質(zhì)較硬,長骨的骨干較為狹窄,皮層較厚而髓質(zhì)腔狹窄,常伴有低鈣血癥[10,14]。2013年之后有報道稱Kenny-Caffey氏綜合癥可能是因?yàn)镠IP68基因的突變引起的[9-10,15],HIP68基因的突變可導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常[16]。從這些文獻(xiàn)報道來看,HIP68可能與基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[11],對調(diào)控骨骼的生長增殖、甲狀旁腺激素分泌、體內(nèi)鈣水平穩(wěn)定、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育等起重要作用[10,14]。

RAP1B是RAP1的異構(gòu)體,是一種小的Ras樣GTP酶,在調(diào)控多種信號通路如增殖、分化、形態(tài)形成以及凋亡中起分子開關(guān)的作用[17]。RAP1B在內(nèi)皮遷移與血管生成的作用相對明確。在RAP1B基因敲除的裸鼠動物模型研究證實(shí),RAP1B缺失可以導(dǎo)致血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖的功能受損以及MAPK信號通路的受阻,無論是血管發(fā)生、內(nèi)皮遷移以及MAPK通路都在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。雖然RAP1B在很多腫瘤中的突變不多,但其癌基因的功能已在多種腫瘤中被證實(shí),也是腫瘤治療的潛在位點(diǎn)[19-21]。Infante等[22]研究發(fā)現(xiàn)RAP1B可以作為預(yù)防急性淋巴細(xì)胞白血病組織侵襲的有效手段,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以往報道在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤、黑色素瘤、甲狀腺乳頭狀癌、膠質(zhì)瘤等的研究中也發(fā)現(xiàn)RAP1B參與了腫瘤的增殖與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[23-26]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),RAP1B與食管癌增殖和侵襲相關(guān),且為miR-518b的下游[27];在胃癌中RAP1B高表達(dá),且與胃癌患者預(yù)后相關(guān),缺氧可誘導(dǎo)RAP1B在胃癌細(xì)胞中高表達(dá),且與胃癌侵襲明顯相關(guān)[28]。

本研究中乳腺癌缺氧組織IHC結(jié)果顯示,HIP68、RAP1B蛋白高表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞,而前期已經(jīng)證實(shí)HIP68高表達(dá)于乳腺癌,RAP1B參與腫瘤的發(fā)生,且有報道高表達(dá)RAP1B促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移,但具體機(jī)制尚未報道。本研究我們設(shè)想HIP68與RAP1B可能共同參與乳腺癌的惡行生物學(xué)行為,且證實(shí)RAP1B為HIP68的下游作用靶點(diǎn),促進(jìn)乳腺癌的生物學(xué)行為,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明HIP68與RAP1B結(jié)合并作為下游靶點(diǎn)促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞增殖,這與Bischoff等[29]報道的結(jié)果一致,高表達(dá)RAP1B可以促進(jìn)乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及定植, RAP1B通過上游分子激活形成活性形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞群體性的聚集及延伸促進(jìn)癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,RAP1B通過促進(jìn)細(xì)胞外張力作用參與腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。本研究未在動物水平驗(yàn)證HIP68/RAP1B促進(jìn)乳腺癌惡行生物學(xué)行為的機(jī)制,接下來我們將進(jìn)一步在體內(nèi)及動物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證HIP68/RAP1B在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制,為乳腺癌的防治提供新的依據(jù)。

4 結(jié)論

HIP68/RAP1B信號通路在缺氧乳腺癌組織中高表達(dá)并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。