李 娜，李 濤，楊冬梨，姚 媛

陜西中醫(yī)藥大學 1.基礎醫(yī)學院；2.第二臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是中胚層來源的成體干細胞。研究表明MSCs是構成腫瘤微環(huán)境的重要基質成分,對腫瘤的發(fā)展有復雜的影響[1]。MSCs對腫瘤的促進作用通過多種機制實現(xiàn),包括分化為其他促腫瘤成分如腫瘤相關成纖維細胞、抑制免疫細胞活性、促進血管生成、通過與腫瘤細胞直接接觸或細胞因子及外泌體的分泌調控腫瘤細胞生物學功能,最終促進腫瘤細胞增殖和轉移、抑制凋亡及增加腫瘤耐藥性[2]。

和厚樸酚是從木蘭屬植物的根和莖皮中分離的生物活性成分,有效抗炎、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤等作用[3]。多項研究證實和厚樸酚可直接作用于腫瘤細胞,通過抑制其增殖和轉移、促進凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用[4]。然而,和厚樸酚對腫瘤微環(huán)境的調節(jié)作用研究較少。本研究擬以人脂肪間充質干細胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hADSCs)為研究對象,觀察和厚樸酚對其增殖、凋亡的影響及相關機制,為進一步明確和厚樸酚調控腫瘤微環(huán)境發(fā)揮抗癌效應奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

1.1.1 細胞: hADSCs獲贈于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所趙春華課題組。

1.1.2 主要試劑:DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司); MTS 試劑盒(Promega公司);臺盼藍染色液(翌圣生物科技有限公司);annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(BD Pharmingen公司);反轉錄及PCR擴增相關試劑(TaKaRa公司);引物(上海生物工程有限公司);qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣生物科技有限公司); GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司); BAX抗體、BCL2抗體、CYCLIND1抗體、PCNA 抗體、p-ERK抗體、p-MEK抗體、ERK抗體和MEK抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTS實驗: 按照試劑盒說明書進行,具體方法參見文獻[5]。

1.2.2 臺盼藍染色液檢測細胞活性:離心收集不同濃度和樸厚酚預處理的hADSCs,PBS清洗后制成單細胞懸液,按照1:1比例與臺盼藍染色液充分混勻,染色1～2 min后加入細胞計數(shù)板,細胞計數(shù)儀計數(shù)總細胞、死細胞和活細胞。

1.2.3 annexin V/PI檢測細胞凋亡:按照試劑盒說明書進行,具體方法參見文獻[5]。

1.2.4 RT-qPCR檢測:Trizol裂解液提取不同濃度和樸厚酚預處理的hADSCs總RNA,兩步法反轉錄為cDNA,加入引物、SYBR檢測相關基因的表達,所用引物見表1。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.5 Western blot實驗: 收取不同濃度和樸厚酚預處理hADSCs的蛋白樣品,檢測增殖、凋亡及MEK-ERK信號通路相關蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 和厚樸酚抑制hADSCs增殖

采用不同濃度的和厚樸酚(0、5、10、20和50 μmol/L)處理hADSCs 48 h。MTS實驗結果顯示,與空白對照組相比,10、20和50 μmol/L濃度組細胞的活性均明顯降低(P<0.01) (圖1A),5 μmol/L對hADSCs活性幾乎無影響。臺盼藍染色后計數(shù)結果顯示,隨著和厚樸酚濃度增加,hADSCs總細胞數(shù)、活細胞數(shù)以及活細胞比例逐漸下降(P<0.01) (圖1B～D)。

The effect of honokiol at different concentrations on the proliferation of hADSCs;A.MTS assay; B-D.cell counts were performed by Trypan blue staining; *P<0.01,**P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

隨后采用RT-qPCR和Western blot檢測不同濃度和厚樸酚(0、10、20和50 μmol/L)處理hADSCs 48 h后對增殖相關基因表達水平的影響。隨著和厚樸酚濃度增加,增殖相關基因CCND1、MKI67和PCNA的mRNA表達下調(P<0.05),CYCLIND1和PCNA的蛋白表達也下調(圖2A,B)。

上述結果表明,和厚樸酚可以抑制hADSCs增殖,并且這種抑制效果具有濃度依賴性。

2.2 和厚樸酚促進hADSCs凋亡

采用不同濃度的和厚樸酚(0、10、20和50 μmol/L)處理hADSCs 48 h后,annexin V/PI檢測細胞凋亡。隨著和厚樸酚濃度增加,hADSCs的凋亡率逐漸上升(P<0.01) (圖3A,B)。

The effect of honokiol of different concentrations on apoptosis of hADSCs; A.cell apoptosis was detected by flow cytometry; B.statistical analysis of apoptosis rate; **P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

進一步的RT-qPCR和Western blot檢測結果顯示,隨著和厚樸酚濃度增加,促凋亡基因BAX和TP53的mRNA表達上調(P<0.01),抗凋亡基因BCL2的mRNA表達下調(P<0.05)。促凋亡基因BAX蛋白表達上調,抗凋亡基因BCL2蛋白表達下調(圖4A,B)。

The effect of honokiol at different concentrations on gene expression related to apoptosis of hADSCs; A.RT-qPCR detected the mRNA expression of BAX, BCL2 and TP53; B.Western blot detected the protein expression of BAX and BCL2; *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with 0 μmol/L group.

上述結果表明,和厚樸酚可以促進hADSCs凋亡,并且這種促進作用具有濃度依賴性。

2.3 和厚樸酚抑制MEK-ERK1/2信號通路活化

文獻報道,和厚樸酚可調節(jié)MAPK/ERK信號通路抑制乳腺癌SK-BR-3細胞增殖、遷移和侵襲[6]。本研究進一步采用Western blot方法檢測不同濃度的和厚樸酚處理后對hADSCs的MAPK/ERK信號通路活性的影響。與空白對照組相比,10、20和50 μmol/L和厚樸酚濃度組hADSCs中p-MEK和p-ERK1/2蛋白的表達明顯下調,而總的MEK和ERK1/2蛋白的表達并未發(fā)生明顯變化(圖5)。

圖5 和厚樸酚抑制MEK-ERK1/2信號通路活化Fig 5 Honokiol inhibited the activation of MEK-ERK1/2 signaling pathway

3 討論

腫瘤微環(huán)境是一個高度復雜的系統(tǒng),主要由腫瘤細胞、浸潤性免疫細胞、癌相關基質細胞(如MSCs)和脂肪細胞,以及細胞外基質和多種信號分子組成[2]。MSCs被腫瘤細胞在癌變過程中分泌的可溶性因子募集到腫瘤組織中,通過直接與腫瘤細胞接觸、旁分泌甚至與腫瘤細胞融合的方式促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。因此,抑制腫瘤微環(huán)境中的MSCs生長也是抗癌治療的靶點。

和厚樸酚在體內外環(huán)境中都表現(xiàn)出對不同癌癥的化學預防和治療潛力。研究表明和厚樸酚作用于腫瘤細胞的多種生物學功能(增殖、凋亡、轉移和耐藥)發(fā)揮抗癌效應[8-9]。本研究著重討論和厚樸酚對腫瘤微環(huán)境中hADSCs的調節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)使用0、10、20和50 μmol/L和厚樸酚作用于hADSCs,細胞增殖和細胞凋亡相關實驗檢測結果表明和厚樸酚通過抑制hADSCs增殖,同時誘導凋亡,從而有效抑制hADSCs的生長。和厚樸酚作用48 h抑制多數(shù)腫瘤細胞增殖的IC50在15～50 μmol/L之間[6, 9-10],表明上述濃度的和厚樸酚用于抗腫瘤治療時,可同時抑制腫瘤微環(huán)境中的MSCs生長,進一步發(fā)揮其抗癌效應。然而,MSCs廣泛分布于結締組織和器官間質中。提示和厚樸酚應用于抗腫瘤治療時,藥物隨血液到達全身可能對正常組織產(chǎn)生影響,表現(xiàn)出組織損傷不易修復等副作用。

ERK信號通路能響應各種細胞外刺激,包括生長因子、細胞因子以及直接的細胞外應激。已有文獻報道,和厚樸酚能下調p-ERK1/2表達水平抑制乳腺癌SK-BR-3 細胞增殖,促進凋亡[6]。因此,本研究中檢測了不同濃度和厚樸酚處理hADSCs后p-MEK和p-ERK1/2表達水平,結果證實和厚樸酚呈濃度依賴性抑制MEK/ERK1/2 信號通路。

總之,和厚樸酚可能通過干擾MEK/ERK1/2 信號通路激活抑制hADSCs增殖,誘導凋亡,從而有效抑制hADSCs生長,減弱其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的支持作用。這一發(fā)現(xiàn)提示和厚樸酚應用于抗癌治療的過程中,腫瘤微環(huán)境的改善也是其治療靶點。