陳林木，黃云秀

中山市人民醫(yī)院 1.藥學(xué)部；2.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東 中山 528403

殼寡糖(chitosan oligosaccharides,COS)由殼聚糖降解得到,分子量較小,克服了殼聚糖在人體中溶解度小的缺點(diǎn)[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)COS能減少動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊的形成。例如下調(diào)人肝癌細(xì)胞系HepG2的前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶基因表達(dá)來增強(qiáng)脂滴形成[2],增強(qiáng)肝臟低密度脂蛋白受體、清道夫受體B類成員1(scavenger receptor class B type Ⅰ protein,SRBI)及巨噬細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1表達(dá)[3]等。

糖基轉(zhuǎn)移酶在AS形成的多個(gè)階段發(fā)生變化。既往研究表明AS形成的中后期,轉(zhuǎn)錄因子HNF1α進(jìn)入細(xì)胞核的減少導(dǎo)致巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(fucosyltransferase 8,Fut8)翻譯水平降低[4],Fut8表達(dá)下調(diào)時(shí)抑制黏著斑激酶磷酸化,導(dǎo)致下游的F-肌動(dòng)蛋白的聚合被抑制,使得泡沫細(xì)胞遷移出斑塊能力下降[5]。SRBI含有11個(gè)潛在的N鏈糖基化位點(diǎn),其中兩個(gè)位點(diǎn)(Asn-108和Asn-173)的突變改變了其表達(dá)和功能[6]。這表明N-鏈糖基化可以影響SRBI在細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性。先前的研究已經(jīng)證實(shí)COS通過影響SRBI的表達(dá)而減弱AS的形成,那么SRBI的糖基化修飾水平的改變是否是COS作用的靶點(diǎn)之一呢?

本研究擬利用動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察SRBI糖基化修飾位點(diǎn)在COS影響泡沫細(xì)胞脂質(zhì)外排中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和細(xì)胞:SPF級(jí)ApoE-/-小鼠40只,約6周齡,體質(zhì)量18～25 g(北京華富康生物科技有限公司)。小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 主要試劑:殼寡糖(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供,聚合度2～8,脫乙酰度>88%,平均分子量<1 000 Da);高脂飼料(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司);裂解液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司);ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司);RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);SYBR Premix Ex TaqTMⅠ PCR定量試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);膽固醇酯外流試劑盒(Abcam公司);游離膽固醇酯測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立:小鼠飼養(yǎng)在晝夜交替的照明條件下,進(jìn)食和飲水不受限制。隨機(jī)分為對(duì)照組(n=20, control group)和殼寡糖組(n=20, COS group)。對(duì)照組飼喂高脂飼料12周,COS組飼喂高脂飼料和殼寡糖(每天灌胃,500 mg/kg)12周[7]。記錄實(shí)驗(yàn)期間的兩組小鼠體質(zhì)量、攝食量等基本信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死小鼠,采集小鼠血清和臟器。樣品保存在-80 ℃冰箱中或用4%多聚甲醛溶液固定。本方案經(jīng)中山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):K2020-19)。

1.2.2 器官功能指標(biāo)和血清脂質(zhì)水平的檢測(cè):采用戊巴比妥腹腔注射麻醉ApoE-/-小鼠。經(jīng)眼眶采血后離心分離血清。兩組小鼠的總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C),甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-I,ApoA1)、載脂蛋白B100(apolipoprotein B100,ApoB100)、血糖(glucose,Glu)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)均采用實(shí)驗(yàn)室全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清蛋白表達(dá):ELISA的操作步驟按照試劑供應(yīng)商的說明書進(jìn)行。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá):各組隨機(jī)選取3只小鼠的主動(dòng)脈組織(約30 mg),用裂解液300 mL提取總蛋白質(zhì)。用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度。后續(xù)步驟參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平:采用超純RNA試劑盒提取組織總RNA。PrimeScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA(1 μg)。iCycleriQ用于SYBR Premix Ex TaqTMⅡ?qū)崟r(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)。詳細(xì)的RT-qPCR程序參考論文[8]。使用以下引物擴(kuò)增目的基因:SRBI: 5′-GGCTGCTGTTTG CTGCG-3′(F)和5′-GCTGCTTGATGAGGGAGGG-3′(R); β-actin:5′-AAGACCTCTATGCCAAC AC-3′(F)和5′-CTGCTTGCTGATCCACAT -3′(R)。

1.2.6 熒光法測(cè)定膽固醇含量:使用膽固醇外排試劑盒評(píng)估膽固醇外排情況,參考制造商的方案和先前研究[9]。膽固醇流出率(%)=[上清液熒光強(qiáng)度/(上清液熒光強(qiáng)度+細(xì)胞沉淀熒光強(qiáng)度]×100%。

1.2.7 酶法檢測(cè)血清總膽固醇和游離膽固醇:膽固醇酯測(cè)定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)程序按照已發(fā)表文章[10]。膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)=總膽固醇(total cholesterol,TC)-游離膽固醇(free cholesterol, FC)。

1.2.8 凝集素芯片檢測(cè)凝集素水平:小鼠主動(dòng)脈樣品送到上海華盈生物有限公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Raybiotech的標(biāo)準(zhǔn)操作程序,使用Raybiotech試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)兩組血清糖蛋白變化:小鼠血清樣品送到北京百派泰克生物科技有限公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下:BCA蛋白提取和蛋白濃縮;瓊脂糖結(jié)合小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin,LCA)下拉試驗(yàn);胰蛋白酶消化蛋白質(zhì);納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 COS對(duì)小鼠基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的影響

COS可以顯著降低小鼠體質(zhì)量和食物攝入量(P<0.05)。給藥后,COS組小鼠肝臟質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)(表1)。COS對(duì)臟器功能指標(biāo)(AST、ALT、ALP、BUN、Cr、Glu、CK、LDH)無明顯影響。

表1 COS對(duì)小鼠基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的影響Table 1 Effects of COS on basic data in n=20)

2.2 COS減弱AS斑塊的形成

COS治療后, TC(圖1A)、LDL-C(圖1C)水平明顯降低(P<0.05),TG(圖1B)、HDL-C(圖1D)、ApoA1(圖1E)、ApoB100(圖1F)水平變化不明顯。COS組內(nèi)膜厚度比對(duì)照組明顯變薄(P<0.05)(圖1G),油紅O染色結(jié)果顯示,COS組主動(dòng)脈瓣脂質(zhì)沉積明顯減少(P<0.05)(圖1H)。

A-F.comparison of serum TC, TG, LDL-C, HDL-C, ApoA1 and ApoB100 levels between two groups of mice; G.comparison of aortic intima thickness between the two groups(×40); H.comparison of aortic fat deposition between two groups of mice(×40); TC.total cholesterol; TG.triglyceride; LDL-C.low density lipoprotein-cholesterol; HDL-C.high density lipoprotein-cholesterol; ApoA1.apolipoprotein A-I; ApoB100.apolipoprotein B100;*P<0.05 compared with control group.

2.3 COS促進(jìn)核心巖藻糖基化的表達(dá)

采用凝集素芯片法檢測(cè)COS處理后主動(dòng)脈組織中凝集素的變化(圖2A)。多種凝集素發(fā)生顯著變化,如橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(aleuria aurantia lectin,AAL)、大蒜凝集素(allium sativum lectin,ASA)(圖2B)。ELISA結(jié)果顯示,AAL(示總巖藻糖基化)和LCA (示核心巖藻糖基化)的表達(dá)明顯上調(diào)(圖2C和D)(P<0.05),而翅莢百脈根凝集素(lotus tetragonolobus lectin,LTL)(示α1,3/4-巖藻糖基化)的表達(dá)無明顯變化(圖2E)。懷槐凝集素Ⅰ(maa-ckia amurensis lectin Ⅰ,MAL Ⅰ)(示α 2,3 -唾液?；?的表達(dá)明顯下調(diào)(圖2F)(P<0.05),而黑松凝集素(sambucus nigra lectin,SNA)(示α 2,6 -唾液?；?的表達(dá)沒有明顯變化(圖2G)。ELISA結(jié)果也顯示Fut8蛋白含量明顯上調(diào)(P<0.05)(圖2H)。

A.schematic diagram of lectin chip; B.heat map results of lectin chip; C-H.the expression of AAL, LCA, LTL,MAL Ⅰ, SNA and Fut8 were detected by ELISA in the two groups; AAL.aleuria aurantia lectin; LCA.lens culinaris agglutinin; LTL.lotus tetragonolobus lectin; MAL Ⅰ.maackia amurensis lectin I; SNA.sambucus nigra lectin; *P<0.05 compared with control group.

2.4 SRBI作為L(zhǎng)CA結(jié)合蛋白在COS組的表達(dá)顯著降低

在高爾基網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,糖基轉(zhuǎn)移酶將糖鏈添加到下游靶蛋白上從而影響其功能。從COS組和對(duì)照組中各隨機(jī)抽取4個(gè)樣本行LCA pull-down和Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,分子量位于80～90 ku之間的蛋白在兩組間有明顯差異。對(duì)該部分條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析,共鑒定出389個(gè)蛋白和4 556個(gè)多肽。在相互作用蛋白的篩選過程中,以P<0.05和fold changes ≥ 5為篩選標(biāo)準(zhǔn)。篩選到beta-2-glycoprotein 1(圖3A)、serum amyloid A-2 protein(圖3B)、sathepsin G (圖3C)、scavenger receptor class B member 1(SRB1)(圖3D)共4個(gè)相互作用蛋白。已有研究證實(shí),清道夫受體B類成員1(SRBI)是一種重要的脂質(zhì)外排受體,與泡沫細(xì)胞的形成密切相關(guān)。COS組主動(dòng)脈SRBI蛋白(圖3E)和mRNA表達(dá)量(圖3F)顯著上調(diào)(P<0.05)。

A-D.relative expression levels of serum beta-2-glycoprotein, serum amyloid A-2 protein,serum cathepsin G, scavenger receptor class B member 1 in two groups; E.protein expression of scavenger receptor class B member 1 in aorta in two groups; F.mRNA expression in aorta of scavenger receptor class B member 1 in two groups; *P<0.05 compared with control group.

2.5 SRBI糖基化修飾減弱了COS促進(jìn)膽固醇外排的作用

SRBI是一種重要的膽固醇外排受體,因此,從脂質(zhì)外排角度探討COS的作用。300 μg/mL COS處理RAW264.7細(xì)胞24 h,細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)(圖4A)。200 μg/mL COS處理RAW264.7細(xì)胞48 h,細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)(圖4B)。因此,200 μg/mL COS處理細(xì)胞 24 h為后續(xù)處理?xiàng)l件。膽固醇酯流出實(shí)驗(yàn)表明,50 μg/mL ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24 h導(dǎo)致膽固醇酯外流明顯減少(P<0.05)。同步添加COS后升高了膽固醇流出比例,且隨濃度的增加而增加(圖4C)。細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇酯測(cè)定結(jié)果顯示,50 μg/mL ox-LDL處理RAW264.7細(xì)胞24 h 后,細(xì)胞內(nèi)CE/TC明顯升高。200 μg/mL COS可使CE/TC降低至50%以下(圖4D)。為驗(yàn)證SRBI作用, 通過siRNA敲低SRBI的表達(dá)(圖4E)。SRBI表達(dá)降低會(huì)抑制COS的促膽固醇外排作用(圖4F),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇酯(cholesterol ester,CE)的比例顯著增加(P<0.05)(圖4G)。進(jìn)一步探討SRBI糖基化對(duì)其功能的影響,構(gòu)建了SRBI N108糖基化突變載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過IP實(shí)驗(yàn)沉淀SRBI后,Western blot實(shí)驗(yàn)顯示LCA和AAL的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(圖4H)。當(dāng)突變的SRBI和COS共同處理細(xì)胞時(shí),膽固醇流出減弱(圖4I),細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇酯的比例顯著增加(P<0.05)(圖4J)。

A.effects of different concentrations of COS on cell viability; B.effects of different COS treat-time on cell viability; C.effect of COS on cholesterol efflux of RAW264.7 cells; D.effects of COS on CE/TC of RAW264.7 cells; E.expression of SRBI after siRNA interference was verified by Western blot; F.effect of SRBI interference on cholesterol efflux of RAW264.7 cells; G.effects of SRBI interference on CE/TC of RAW264.7 cells; H.glycosylation level of mutant SRBI was detected by Western blot;I.effect of mutated SRBI on cholesterol efflux in RAW264.7 cells; J.effect of mutated SRBI on CE/TC in RAW264.7 cells;*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with ox-LDL group.

3 討論

殼寡糖是殼聚糖的部分水解產(chǎn)物,它保留了殼聚糖的可生物降解性、相容性和無毒性等特點(diǎn)。由于分子量小,其水溶性和抗氧化性能優(yōu)于殼聚糖[1]。許多研究表明,COS可以顯著緩解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示COS能顯著降低TC和LDL-C,說明COS主要通過降低膽固醇抑制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成。然而沒有觀察到兩組小鼠間HDL-C的變化,這與以往報(bào)道殼寡糖能夠升高大鼠血漿中HDL-C的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同[11]。這種差異可能與脂蛋白組成和代謝的復(fù)雜性以及物種不同有關(guān)。

糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方法之一[12]。在AS早期,當(dāng)血液中的單核細(xì)胞粘附在內(nèi)皮細(xì)胞上并進(jìn)一步穿透TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷時(shí),COS可通過O-氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶與n-乙?；B接,調(diào)節(jié)EA hy926細(xì)胞中白介素-6和白介素-8的表達(dá)[13]。在AS形成的中后期,形成的泡沫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱,停留在斑塊內(nèi),引起炎性反應(yīng)擴(kuò)大[14]。本文實(shí)驗(yàn)表明COS處理后血清中幾種凝集素發(fā)生了變化,包括AAL、LCA和MAL I等?；谇捌趯?shí)驗(yàn)基礎(chǔ),本研究重點(diǎn)關(guān)注Fut8和對(duì)應(yīng)凝集素LCA的在COS影響斑塊形成中的重要作用。結(jié)合以往文獻(xiàn),后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討其他凝集素和相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶在該過程中的作用。

SRBI是一種重要的脂質(zhì)外排受體,與三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 A1、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G1共同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡。實(shí)驗(yàn)表明,SRBI在COS處理后顯著上調(diào),是一種LCA凝集素結(jié)合蛋白。雖然COS處理后SRBI的表達(dá)大幅增加,但膽固醇流出水平和細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水平仍未恢復(fù)到空白對(duì)照組水平,這可能與白細(xì)胞分化抗原36表達(dá)部分增加有關(guān)。另外,siRNA降低SRBI表達(dá)后,COS的作用明顯減弱,說明SRBI是COS發(fā)揮抗AS作用的必要因素之一。通過構(gòu)建SRBI糖基化位點(diǎn)突變載體,本研究發(fā)現(xiàn)SRBI糖基化修飾單位點(diǎn)突變對(duì)膽固醇流出的影響低于SRBI表達(dá)的變化。由于存在多個(gè)可能的糖基化修飾位點(diǎn),雖然選擇了對(duì)其功能影響最大的位點(diǎn),但其他位點(diǎn)仍然發(fā)揮了作用。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)將進(jìn)行多位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),觀察糖基化修飾對(duì)SRBI功能的完整機(jī)制。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,用中等濃度的COS治療ApoE-/-小鼠,可以顯著減弱AS斑塊的形成。SRBI表達(dá)和糖基化水平的升高可能是脂質(zhì)外排的重要機(jī)制之一。