王倩影 楊晨 鐘卓泰 張濤 姚夢茜 王琳 張格知 班彥然 蘇曉蘭 魏瑋

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)以非特異性腸道炎癥為病變特點[1],主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便和腹痛,病變范圍主要局限于結(jié)腸及直腸黏膜,是一種難治性、易復發(fā)的消化系統(tǒng)疾病。

UC是腸道腫瘤發(fā)生的重要危險因素之一[2],有報道稱,UC患者的結(jié)直腸癌風險比普通人高3～5倍[3],而且病程越長,癌變機率越高[4]。盡管治療UC的藥物日新月異,包括用于誘導和維持UC緩解的5-氨基水楊酸(5-amino salicylic acid,5-ASA)藥物、皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等,但無法維持這種疾病的緩解和避免復發(fā),在臨床上仍是一個難以解決的問題。保護腸道免受有害物質(zhì)入侵的第一道屏障——腸黏膜屏障,當腸道上皮細胞受到破壞,黏液層的組成出現(xiàn)缺陷時,就會導致腸道屏障的破壞,從而促使腸道炎癥產(chǎn)生[5]。因此,維護腸道黏膜屏障功能完整,提高黏膜修復能力是預防和維持UC患者病情穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)。

中醫(yī)藥治療UC強調(diào)的是系統(tǒng)化的認識和個體化的治療,且中藥具有多成分,多環(huán)節(jié),多靶點優(yōu)勢,能夠起到誘導緩解、預防病情復發(fā)、延長復發(fā)時間、穩(wěn)定患者病情的作用。清熱化濕調(diào)樞方為魏瑋教授傳承國醫(yī)大師路志正先生學術思想的基礎上,根據(jù)三十余年臨床經(jīng)驗及對UC病因病機的認識,化裁烏梅丸、葛根芩連湯等經(jīng)典名方而來,方中以烏梅、敗醬草、白芍、白術、太子參、茯苓、木香、黃連、秦皮等藥為主,功專清熱化濕,健脾調(diào)樞,臨床研究顯示清熱化濕調(diào)樞方治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床療效突出[6]。前期課題組的動物實驗表明,清熱化濕調(diào)樞方對DSS結(jié)腸炎小鼠的腸道黏膜屏障損傷有修復作用,但尚不清楚清熱化濕調(diào)樞方在預防和延緩UC發(fā)作方面,能否保持腸道屏障功能穩(wěn)定。本研究將基于腸道黏膜組織中粘蛋白2(mucoprotein-2,MUC-2)、閉合蛋白2(Claudin-2)表達變化,通過建立葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導的UC小鼠模型,探討清熱化濕調(diào)樞方在預防和緩解DSS結(jié)腸炎模型小鼠腸黏膜屏障功能損傷方面可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

購買于北京斯貝福生物技術有限公司的SPF級C57BL/6小鼠24只,雄性,8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,實驗動物許可證號:SCXK(京)2015-0015。在中國中醫(yī)科學院針灸所SPF級獸舍飼養(yǎng)實驗鼠,在室溫(24±2)℃、相對濕度35%～45%的通風隔音籠舍內(nèi),每隔12小時進行一次光照與黑暗交替飼養(yǎng)。本實驗已由中國中醫(yī)科學院針灸研究所倫理委員會審批,實驗倫理證號:D2021-03-16-2。

1.2 藥物與試劑

中藥免煎顆粒:購于四川新綠藥業(yè),用蒸餾水配至所需濃度得到中藥混懸液,于4 ℃保存?zhèn)溆?使用前恢復室溫并搖勻。清熱化濕調(diào)樞方(烏梅12 g、敗醬草12 g、黃連6 g、當歸10 g、炒白芍12 g、木香9 g、枳實10 g、葛根12 g、麩炒白術10 g、太子參12 g、茯苓15 g、秦皮12 g、兒茶6 g、甘草9 g)1劑生藥轉(zhuǎn)換為免煎顆粒為13 g。

美沙拉嗪混懸液:美沙拉嗪腸溶片(0.5 g/片,LosanPharmma GmbH公司,進口藥品注冊證號:H20171358),外部黃色藥衣于每日干預前刮去,取0.5 g藥片,充分溶于50 mL溫水制成使用。

DSS溶液:美國MP Biomedicals公司(43 kDa,批號160110),用100 mL純水溶解2.5 g的DSS配成2.5%的DSS溶液。

MUC-2單抗(貨號:PAA705Mu01)、抗原修復液(貨號:C1010)、PBS緩沖液(貨號:C1003)、蘇木精染液(貨號:C1001)、二抗(貨號:PAE001)、DAB顯色劑(貨號:C1101),48T(貨號:SEA641Mu),購于武漢云克隆科技股份有限公司;抗閉合蛋白2(Claudin-2)抗體(貨號:ab15098),購于Abcam公司;水合氯醛(批號:EB05980),購于上海士鋒生物科技有限公司;中性組織固定液(批號:R20486) 購于上海源葉生物科技有限公司;蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液(批號: H8070) ,購于北京賽因坦科技有限公司;BSA(貨號:A8020),購于Solarbio公司。

1.3 儀器

電泳儀(型號:DYY-6D)、電泳槽(型號:DYCZ-24DN),北京六一儀器廠;其林貝爾水平搖床(型號:TS-1),海門市其林貝爾儀器制造有限公司;轉(zhuǎn)印槽(型號:JY-ZY5),北京君意東方電泳設備有限公司;X膠片觀片燈(型號:GPD-Ⅱ),北京雅迪萊特醫(yī)療科技有限公司;掃描儀(型號:5600F),佳能公司;高速冷凍離心機(型號:HC-3018R),安徽中科中佳科學儀器有限公司;超聲細胞破碎機(型號:650Y),上海利聞科學儀器有限公司;紫外分光光度計(型號:UV1800),日本島津公司;脫水機(型號:JJ-12J),武漢俊杰電子有限公司;包埋機(型號:KD-BM)、病理切片機(型號:KD-2258)、凍臺(型號:KD-BL)、組織攤片機(型號:KD-P),浙江省金華市科迪儀器設備有限公司;正置光學顯微鏡(型號:CK31),日本奧林巴斯公司。

1.4 分組

24只小鼠進行為期1周的適應性飼養(yǎng),采用隨機函數(shù)進行分組,分為正常組、模型組、清熱化濕調(diào)樞方組、美沙拉嗪組,每組6只。

1.5 干預與造模

參照《中藥藥理研究方法學》[7],按小鼠與人體表面積比等有效劑量折算的比例,作為給藥劑量,將人的日常給藥劑量折算為小鼠等有效劑量。在UC模型小鼠造模過程中,同時進行藥物干預。正常組可自由飲用蒸餾水,其余各組小鼠參照Wirtz等造模方法,給予2.5%的DSS水溶液自由飲用7天。自造模第1天起,每日1次,連續(xù)7天,清熱化濕調(diào)樞方組小鼠予清熱化濕調(diào)樞方灌胃,劑量為1.69 g/(kg·d),美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液灌胃,劑量為0.52 g/(kg·d),正常組和模型組給予0.5 mL純水灌胃,至第8天安樂死小鼠取結(jié)腸組織。

1.6 檢測指標與方法

1.6.1 一般情況 每天對各組小鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、大便性狀、肉眼血便及大便潛血、體質(zhì)量等一般情況的變化進行觀察并記錄。

1.6.2 疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)評分[8]根據(jù)Murano M等[9]的研究,評估小鼠體質(zhì)量下降、大便性狀以及潛血情況,并計算出各組小鼠DAI評分,對疾病活動情況進行評估。DAI評分=(體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+潛血分數(shù))/3。

1.6.3 測量結(jié)腸長度及觀察結(jié)腸切片組織學變化 干預結(jié)束后,用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉小鼠并將其處死,分離結(jié)腸后測量結(jié)腸長度,在結(jié)腸遠端約1 cm處取病理組織,用10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片,病理染色。在光鏡下觀察小鼠結(jié)腸切片組織學變化。

1.6.4 用蛋白印跡法檢測結(jié)腸組織MUC-2、Claudin-2蛋白表達水平 將結(jié)腸組織剪碎,取蛋白樣品測定濃度。加適量濃縮SDS-PAGE蛋白上清緩沖液,通過電泳及轉(zhuǎn)膜。完成轉(zhuǎn)膜后,室溫封閉PVDF膜1小時,用PBST進行沖洗。將一抗稀釋至1∶500,一抗孵育,在室溫水平搖床上緩慢搖動1小時,PBST沖洗3次;二抗孵育方法重復上述操作。利用化學發(fā)光檢測系統(tǒng),在化學發(fā)光底物中加入PVDF膜,然后放進增光屏的暗盒中進行曝光,掃描圖片顯影、定影。以GAPDH單抗檢測作為內(nèi)參對照,利用ImageJ V1.8.0.112對目標蛋白條帶的灰度值加以分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較

正常組小鼠狀態(tài)良好、毛色黑亮,進食和飲水均正常。模型組在第3～5天,部分小鼠糞便潛血陽性,造模結(jié)束時,該組大部分小鼠見肉眼血便,出現(xiàn)腹瀉,可明顯觀察到活動遲緩,精神萎靡,喜蜷縮,小部分無肉眼血便小鼠同樣顯示糞便潛血陽性。與模型組比較,美沙拉嗪組及清熱化濕調(diào)樞方組小鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)色澤黑亮,活動未見明顯遲緩,大便稀軟及便血情況較少。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量、DAI評分及結(jié)腸長度比較

與正常組相比,模型組、美沙拉嗪組和清熱化濕調(diào)樞方組小鼠的體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)。美沙拉嗪組和清熱化濕調(diào)樞方組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但與模型組比較,兩組小鼠均顯示體質(zhì)量增加, DAI評分下降, 結(jié)腸長度增長(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、DAI評分及結(jié)腸長度比較

2.3 各組小鼠結(jié)腸病理情況比較

圖1示,正常組小鼠腸黏膜上皮完整,杯狀細胞數(shù)量較多,固有層排列整齊,具有完整的隱窩結(jié)構(gòu),無炎細胞浸潤。模型組小鼠腸黏膜上皮缺損,杯狀細胞明顯減少,固有層和隱窩結(jié)構(gòu)破壞嚴重,見大量炎細胞浸潤。美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸黏膜上皮可見多處黏膜中斷,固有層排列欠規(guī)整,部分隱窩結(jié)構(gòu)破壞,杯狀細胞減少,少量炎細胞浸潤。清熱化濕調(diào)樞方組小鼠結(jié)腸組織中黏膜上皮基本完整,杯狀細胞較多,隱窩結(jié)構(gòu)完整且規(guī)律排列,無炎細胞浸潤。

注:A 正常組;B 模型組;C 美沙拉嗪組;D 清熱化濕調(diào)樞方組。

2.4 各組小鼠蛋白表達水平比較

模型組小鼠MUC-2蛋白表達與正常組比較明顯降低(P<0.05);美沙拉嗪組和清熱化濕調(diào)樞方組小鼠MUC-2蛋白表達與模型組比較明顯升高(P<0.05)。模型組小鼠Claudin-2蛋白表達與正常組比較明顯降低(P<0.05);清熱化濕調(diào)樞方組小鼠Claudin-2蛋白表達與模型組比較明顯升高(P<0.05),美沙拉嗪組小鼠Claudin-2蛋白表達雖有增加趨勢,但與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義,見表2。各組小鼠結(jié)腸組織MUC-2、Claudin-2蛋白電泳圖見圖2。

注:A 正常組;B 模型組;C 美沙拉嗪組;D 清熱化濕調(diào)樞方組。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織MUC-2、Claudin-2蛋白相對表達比較鼠只=6)

3 討論

根據(jù)腹痛、腹瀉、下利赤白膿血等臨床表現(xiàn),潰瘍性結(jié)腸炎可歸屬于中醫(yī)學“腸澼”“泄瀉”“下利”“休息痢”等范疇。病位在大腸,久病易損肝腎,其根本責之于脾虛。本病主要病機在于脾虛引起的內(nèi)濕不運,郁久化熱,濕熱相搏,下注大腸,氣血搏結(jié),腸道血絡脂膜受損,血敗肉腐而成瘍。大腸濕熱膠著不化,氣血津液運行受阻,因濁成痰,搏血成瘀,致大腸傳導失司,脾胃升降失調(diào),中焦樞機逆亂而出現(xiàn)腹痛、腹瀉、下利赤白、里急后重等癥狀。治療當緊扣脾虛濕熱蘊腸,脾胃樞機失衡的核心病機,以清腸化濕、健脾調(diào)樞為主。

清熱化濕調(diào)樞方重用烏梅,取其酸澀止瀉之用,《本草求真》言烏梅“收澀之性,而使下脫上逆皆治”,敗醬草清熱解毒、消癰排膿,白芍苦酸入肝,養(yǎng)肝陰而柔剛木桀驁之威,故能養(yǎng)血柔肝,木達則土和,故能緩急止痛,白術、太子參、茯苓、炙甘草四味取四君子之意,健脾益氣,使脾健而行,非專止瀉而瀉自能止,又久瀉耗氣傷津,故取太子參易人參以健脾益氣。木香配黃連、秦皮善治濕熱瀉痢,伍枳實調(diào)氣而除痞脹,當歸養(yǎng)血和血,兒茶苦澀收斂,葛根升發(fā)清陽,調(diào)暢脾胃樞機,鼓舞脾胃陽氣上升而瀉止,取“清氣在下,則生飧泄”之意。甘草和中緩急,調(diào)和諸藥。上藥合用共奏清熱化濕,健脾調(diào)樞之功?，F(xiàn)代藥理學研究表明,烏梅具有抗炎、抗菌等作用[10-11],其機制可能與影響細胞通透性有關。敗醬草提取物可下調(diào)促炎因子而發(fā)揮抗炎功效[12]。

實驗結(jié)果表明,經(jīng)美沙拉嗪和清熱化濕調(diào)樞方干預后的小鼠與模型組相比,如軟便、便血等一般情況均有明顯改善,疾病活動指數(shù)得分下降,組織病理、黏膜結(jié)構(gòu)損害不明顯。以上結(jié)果顯示,清熱化濕調(diào)樞方在預防和穩(wěn)定DSS結(jié)腸炎小鼠的腸組織病理損傷方面效果突出,與美沙拉嗪近乎等效。

在UC的發(fā)生和發(fā)展中,腸道屏障功能起著不容忽視的作用,UC腸道黏膜屏障損傷或早于炎癥表現(xiàn)在多項研究中體現(xiàn)[13-14]。腸黏膜屏障是腸道重要的“防線”,它可以阻止病原體、細菌、毒素等與上皮直接接觸,進入體循環(huán)[15]。黏蛋白是黏液的主要成分,其屏障和潤滑功能在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面起著至關重要的作用[16-17]。MUC-2是結(jié)腸黏液屏障中最主要的黏蛋白,在結(jié)腸黏膜杯狀細胞的細胞質(zhì)中表達,MUC-2的高度糖基化保護蛋白免遭降解,并促進與水的相互作用,有利于形成黏液凝膠,使細菌與上皮分離,保護腸道正常結(jié)構(gòu)功能,使機體能夠有效抵御細菌及毒素的侵害[18],并能在一定程度上修復機械損傷,從而起到保護結(jié)腸黏膜的作用[19]。因此MUC-2的含量可以作為衡量結(jié)腸黏膜完整性及修復程度的重要生物學指標。主要由上皮緊密連接中跨膜蛋白和胞質(zhì)支架蛋白組成的腸道黏膜機械屏障是腸道屏障中最重要的組成部分。Claudin蛋白是構(gòu)成緊密連接復合體的主要結(jié)構(gòu),不同的Claudin分子對緊密連接的通透性有不同的影響。一部分Claudin分子被稱為“l(fā)eaking”Claudin,它們可以形成特異性離子通道,從而提高上皮和內(nèi)皮通透性,其中就包括Claudin-2[20-21]。Claudin-2與孔隙形成有關,表達上調(diào)可能會增加細胞旁通透性,影響緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能,導致黏膜屏障結(jié)構(gòu)功能紊亂[22]。

經(jīng)本次實驗發(fā)現(xiàn),與模型組比較,DSS結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中Claudin-2、MUC-2的表達,在美沙拉嗪和清熱化濕調(diào)樞方干預后,表現(xiàn)出較高的恢復程度,這表明清熱化濕調(diào)樞方對黏蛋白的恢復以及腸黏膜屏障的修復有顯著的作用,并且其療效與美沙拉嗪近似。

綜上,清熱化濕調(diào)樞方可以有效預防DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜損傷,其作用機制可能與促進結(jié)腸組織中黏蛋白MUC-2、Claudin-2的分泌,使黏膜愈合,從而維護黏膜屏障完整性有關。本實驗存在以下不足,如未對腸道免疫屏障、腸道菌群等方面進行研究,而僅從腸黏膜機械與化學屏障的相關蛋白探索了部分機制,后續(xù)應進一步拓展研究范圍,為清熱化濕調(diào)樞方預防UC復發(fā)提供更可靠的實驗證據(jù)。