徐 鑫，矯賓賓，李曉琦，方自林，張 冠

（1.中日友好醫(yī)院 泌尿外科，北京 100029；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬朝陽(yáng)醫(yī)院 泌尿外科，北京 100020）

膀胱癌是一種起源于尿路上皮的常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均較高，嚴(yán)重威脅了人們的健康。細(xì)胞焦亡，也被稱(chēng)為細(xì)胞炎性壞死，是一種新形式的程序性細(xì)胞死亡形式[1]，焦亡被認(rèn)為是對(duì)抗感染的重要機(jī)制，它在腫瘤的發(fā)展中起著重要作用[2]。炎性囊泡、氣皮蛋白和促炎細(xì)胞因子是焦亡的重要組成部分，在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用[3～5]。因此，焦亡可能是腫瘤發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物或基因標(biāo)記，也可能對(duì)發(fā)現(xiàn)膀胱癌的預(yù)后相關(guān)基因標(biāo)記具有重要意義。焦亡與腫瘤進(jìn)展之間的關(guān)系是復(fù)雜的。一方面，焦亡抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；另一方面，焦亡也會(huì)形成一種可以將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送到癌細(xì)胞并促進(jìn)其生長(zhǎng)的微環(huán)境[6]。由于焦亡對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有顯著影響，因此影響腫瘤的預(yù)后[6]。當(dāng)焦亡發(fā)生時(shí)，一系列信號(hào)分子和細(xì)胞因子被激活和釋放，同時(shí)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)反應(yīng)被激活[7]，焦亡的強(qiáng)促炎作用與腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)有關(guān)，但具體過(guò)程尚不清楚。已有研究表明，焦亡在腫瘤的發(fā)生和抗腫瘤過(guò)程中起著重要作用；然而，焦亡相關(guān)基因（pyroptosis-related genes，PRGs）在膀胱癌中的價(jià)值尚未被闡明，因此，我們研究了PRGs 的表達(dá)譜及其與預(yù)后相關(guān)的意義，以及相關(guān)的調(diào)控軸，并探討膀胱癌中焦亡與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

通過(guò)CSC 癌癥瀏覽器下載癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含406 個(gè)膀胱癌樣本數(shù)據(jù)、437 份膀胱癌樣本的miRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)和410份臨床資料。本研究的所有過(guò)程均遵循TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)指導(dǎo)方針和政策。

1.2 焦亡相關(guān)基因（PRGs）的獲取

我們從此前的綜述[6，8～10]中共獲得33 個(gè)PRGs（表1），使用“l(fā)imma”和“reshape2”軟件包檢測(cè)膀胱癌與正常組織之間的PRGs表達(dá)差異。

表1 33個(gè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因名稱(chēng)（PRGs）

1.3 功能富集分析

應(yīng)用R 軟件中的cluster-Profiler 軟件包進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）2 種途徑分析。獲得了GO 通路（生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分）和KEGG通路。

1.4 預(yù)后相關(guān)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在單變量Cox 回歸分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)LASSO Cox 回歸分析建立預(yù)后基因模型，使用R 軟件中的“glmnet”軟件包和LASSO Cox 回歸進(jìn)行相關(guān)基因的選擇和刪除。

為了評(píng)估PRGs的預(yù)后價(jià)值，我們進(jìn)一步采用多因素cox 回歸分析來(lái)評(píng)估PRGs 與生存率之間的相關(guān)性，最后保留6 個(gè)基因及其系數(shù)，根據(jù)最小準(zhǔn)則確定懲罰參數(shù)λ。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中406 例膀胱癌患者分為低危亞組和高危亞組，通過(guò)Kaplan-Meier 分析比較2 組的總生存時(shí)間（OS）。采用R 軟件中的“survival”“survminer”和“timeROC”軟件包生成1、3、5 年生存率的受試者特征曲線（ROC），每個(gè)變量的P值、風(fēng)險(xiǎn)比（HR）和95%置信區(qū)間（CI）顯示在基于“forestplot”軟件包的森林圖中。

采用網(wǎng)絡(luò)工具TIMER 來(lái)分析預(yù)后PRGs 與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性，包括目標(biāo)PRGs表達(dá)、目標(biāo)PRGs表達(dá)與大量免疫細(xì)胞（B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞）浸潤(rùn)的相關(guān)性，以及基因表達(dá)與腫瘤純度的關(guān)系。

我們構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源性RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)，以闡明PRGs在膀胱癌中的潛在功能。ceRNA網(wǎng)絡(luò)由starBase、TargetScan、miRDB、miRWalk 和RNA22 構(gòu)建而成，用于預(yù)測(cè)與PRGs 結(jié)合的miRNA 靶點(diǎn)，用StarBase 預(yù)測(cè)與miRNA 相互作用的lncRNA靶點(diǎn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織和正常組織中DEGs的鑒別

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中比較19 個(gè)正常組織和406個(gè)腫瘤組織的差異表達(dá)基因（DEGs），這些DEGs與33 個(gè)PRGs 的交集包括IL6、PYCARD、CASP6和AIM2 基因，其中1 個(gè)基因（IL6）在腫瘤組織中下調(diào)，其余3 個(gè)基因（CASP6、AIM2、PYCARD）在腫瘤組織中上調(diào)。

2.2 功能富集分析

為了明確PRGs 的功能，我們使用GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。GO 分析表明，這33 種PRGs主要涉及參與凋亡過(guò)程的細(xì)胞因子的產(chǎn)生、炎性小體復(fù)合物和半胱氨酸型內(nèi)肽酶的活性（圖1A、1B、1C，見(jiàn)封二）；KEGG 分析表明，33 個(gè)PRGs主要參與了NOD 樣受體信號(hào)通路（圖1D，見(jiàn)封二）。而33 個(gè)PRGs 在腫瘤和非腫瘤樣本之間的詳細(xì)表達(dá)模式如圖1E（見(jiàn)封二）所示。

圖1 功能富集分析（圓點(diǎn)大小代表富集的基因數(shù)量）

2.3 預(yù)后相關(guān)基因模型的構(gòu)建與分析

將上述33 個(gè)基因進(jìn)行LASSO Cox 回歸分析并構(gòu)建預(yù)后模型，并對(duì)每個(gè)PRGs 與OS 進(jìn)行單因素Cox回歸分析，顯示CASP8、CASP9、AIM2、GSDMB、CASP6 的高表達(dá)與良性預(yù)后相關(guān)（圖2，見(jiàn)封二）。LASSO Cox 回歸和多變量Cox 分析成功鑒定出6 個(gè)基因的特征，具體計(jì)算公式為：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（-0.318×CASP9 表達(dá)值+0.331×PRKACA 表達(dá)值-0.279×CASP6 表達(dá)值-0.186×TNF 表達(dá)值-0.110×AIM2 表達(dá)值-0.313×GSDMB 表達(dá)值）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式計(jì)算的中位數(shù)評(píng)分，將406 例患者平均分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，6 個(gè)基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布、生存狀態(tài)及表達(dá)水平如圖2A 所示。Kaplan-Meier 曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的膀胱癌患者的OS概率低于低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2B），1年、3年和5年生存率的曲線下面積（AUC）分別為0.695、0.687和0.697（圖2C）。同時(shí)，預(yù)測(cè)列線圖顯示與理想模型相比，1年、3 年和5 年OS 的預(yù)測(cè)性能尚可（圖2D）。校準(zhǔn)曲線圖顯示3年實(shí)際生存率與預(yù)測(cè)生存率一致（圖2E），說(shuō)明該列線圖有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖2 預(yù)后基因模型分析

2.4 腫瘤免疫微環(huán)境分析

細(xì)胞焦亡在腫瘤免疫微環(huán)境的形成中起著至關(guān)重要的作用。多變量COX 分析和DEGs 中涉及的PRGs 的交集包括2 個(gè)PRGs，即AIM2 和CASP6，我們進(jìn)一步使用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)明確膀胱癌中預(yù)后相關(guān)PRGs（AIM2 和CASP6）與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性。數(shù)據(jù)顯示AIM2 的表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞（圖3A，P=3.26e-6）和B 細(xì)胞（圖3C，P=2.76e-4）的豐度呈正相關(guān)，而與巨噬細(xì)胞（圖3D，P=1.68e-5）和單核細(xì)胞（圖3E，P=2.57e-13）呈負(fù)相關(guān)。此外，CASP6 的表達(dá)與B 細(xì)胞（圖3H，P=6.26e-4）和巨噬細(xì)胞（圖3I，P=2.97e-3）的免疫浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。

圖3 PRGs與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系

2.5 mRNA-miRNA-lncRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了闡明PRGs在膀胱癌中的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了mRNA-miRNA-lncRNA 相互作用的網(wǎng)絡(luò)。RNA22、TargetScan、miRDB 和miRWalk 發(fā)現(xiàn)hsalet-7c-5p 是結(jié)合CASP6 的靶向mRNA。進(jìn)一步分析顯示，hsa-let-7c-5p 在膀胱癌中下調(diào)（圖4A，P=1e-11），而低hsa-let-7c-5p 水平的膀胱癌患者有更好的OS（圖4B，P＜0.001）。據(jù)此，我們研究了hsa-let-7c-5p 上游的lncRNA 靶點(diǎn)，構(gòu)建了miRNA-lncRNA 軸，MIR29B2CHG lncRNA 被鑒定為靶點(diǎn)。同樣，MIR29B2CHG lncRNA 在差異表達(dá)（P=0.026）和生存率（P=0.003）方面也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4C、4D）。ceRNA 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控軸如下所示：CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG。

圖4 ceRNA網(wǎng)絡(luò)中MiRNA及l(fā)ncRNA的差異表達(dá)與生存率分析

3 討論

細(xì)胞焦亡是一種新形式的程序性細(xì)胞死亡，在癌癥的發(fā)展和治療機(jī)制中發(fā)揮了雙重作用[8]。一方面，正常細(xì)胞受到細(xì)胞焦亡釋放的大量炎癥因子刺激后，可以導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞；另一方面，細(xì)胞焦亡的激活也可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡，因此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞焦亡可能是一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。在本研究中，我們首先評(píng)估了33 種已知PRGs在膀胱癌中的表達(dá)水平和預(yù)后價(jià)值，與正常組織相比，膀胱癌組織中CASP6、PYCARD、AIM2表達(dá)升高，IL6 表達(dá)降低（|logFC|＞1，P＜0.05）。我們采用LASSO Cox 回歸分析，基于6 種預(yù)后PRGs（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后基因模型，與理想模型相比，預(yù)測(cè)圖顯示1 年、3 年和5 年的OS 均預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確，這表明焦亡相關(guān)基因可以用于膀胱癌生存期的預(yù)測(cè)，具有一定的臨床意義。

在將DEGs 和相關(guān)基因納入列線圖之后，我們的分析顯示AIM2 和CASP6 可以對(duì)預(yù)后產(chǎn)生較好的預(yù)測(cè)。AIM2 是一種細(xì)胞質(zhì)的先天性免疫受體，可以識(shí)別在致病性攻擊期間釋放的雙鏈DNA，能夠?qū)е露喾N多蛋白寡聚復(fù)合物的組裝，而這些復(fù)合物被稱(chēng)為炎癥小體[10，11]。AIM2 能夠激活CASP-1，并通過(guò)ASC介導(dǎo)的緊密連接蛋白刺激IL-1β 和IL-18的成熟和釋放，而這一過(guò)程也可能促進(jìn)焦亡的發(fā)生[12]。然而AIM2 在各種癌癥中的作用可能也不同，AIM2在結(jié)腸癌和肝癌中具有抑瘤功能，但在皮膚鱗癌中卻具有促瘤功能[8，13]，AIM2基因具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，這導(dǎo)致了結(jié)直腸癌中頻繁的基因突變[14，15]。此外，Patsos 等學(xué)者[16]發(fā)現(xiàn)AIM2 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期（G2/M 期）阻滯來(lái)降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖；Hu 等[17]指出AIM2 的缺失可以通過(guò)標(biāo)靶肝臟中的纖維連接蛋白-1（FN1）來(lái)促進(jìn)了上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化（EMT）；他們的研究表明，新發(fā)現(xiàn)的HBx/AIM2/FN1 軸是肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)。AIM2 的下調(diào)可以使侵襲蛋白酶MMP1 和MMP13 的表達(dá)下調(diào)[13]，從而導(dǎo)致皮膚鱗癌細(xì)胞侵襲能力的降低，AIM2 的下調(diào)也能導(dǎo)致體內(nèi)皮膚鱗癌異種移植物的生長(zhǎng)和血管化受到抑制[13]。這些研究結(jié)果為AIM2 在腫瘤進(jìn)展中的作用提供了證據(jù)，并提示AIM2 炎性小體有可能作為這些侵襲性和轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)，因此，AIM2 可能在不同的癌癥類(lèi)型中發(fā)揮獨(dú)特的作用。

而CASP6 則在促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡中起著重要作用，并且已被證明可以調(diào)節(jié)炎性小體的激活，包括NLRP3、ASC 和CASP1 的激活，從而促進(jìn)GSDMD 誘導(dǎo)的焦亡[18，19]。在本研究中，CASP6 與膀胱癌患者的OS 負(fù)相關(guān)，因此，CASP6可能作為促癌基因在膀胱腫瘤組織中富集。重要的是，Yao 等[20]提出的證據(jù)表明，CASP6 可以通過(guò)調(diào)節(jié)4T1 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的侵襲；體外研究中，CASP6蛋白水平或活性的降低抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲。對(duì)于卵巢癌細(xì)胞，CASP6 的過(guò)表達(dá)和細(xì)胞質(zhì)局限化可能與層粘連蛋白A 的降解和缺乏有關(guān)[21]。對(duì)于胃癌和結(jié)直腸癌，Lee 等發(fā)現(xiàn)CASP6在60%的胃癌和90%的結(jié)直腸癌中表達(dá)，表明CASP6 基因偶爾會(huì)發(fā)生突變[22]，這些數(shù)據(jù)還表明CASP6 缺乏可能與胃癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。雖然CASP6 可能是影響癌癥患者生存的重要基因，但其提高膀胱癌患者生存率的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。鑒于膀胱的數(shù)據(jù)有限，不同腫瘤的結(jié)果往往相互矛盾，我們關(guān)于AIM2 和CASP6 的研究結(jié)果為進(jìn)一步的研究提供了一些見(jiàn)解，我們的研究發(fā)現(xiàn)2 個(gè)基因（AIM2、CASP6）可能是BLCA 中焦亡的執(zhí)行者，6 個(gè)基因（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）可能對(duì)焦亡起了調(diào)節(jié)作用，而另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是上述2 個(gè)PEGs 與免疫浸潤(rùn)顯著相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了焦亡在腫瘤免疫微環(huán)境中起著至關(guān)重要的作用。

我們還構(gòu)建了mRNA-miRNA-lncRNA 網(wǎng)絡(luò)和CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG 調(diào)控軸。hsa-let-7c-5p 屬于保守的let-7 家族，是已被充分研究的與許多癌癥類(lèi)型有關(guān)的miRNA 之一[23～25]。Hsa-let-7c-5p 在多種癌癥類(lèi)型中下調(diào)，如非小細(xì)胞肺癌[26]、胰腺癌[27]和前列腺癌[28]。而Pudova等[29]利用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)工具研究發(fā)現(xiàn)，在三陰性乳腺癌中，與PFS 相關(guān)的C1orf132（也稱(chēng)為MIR29B2CHG）和MIR29B2CHG（rs=0.31）lncRNA的表達(dá)顯著下調(diào)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)hsalet-7c-5p和MIR29B2CHG lncRNA與膀胱癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。這些證據(jù)表明CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG lncRNA 調(diào)控軸也可能在膀胱癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可進(jìn)行進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證。

當(dāng)然，我們的研究也有一定的局限性。首先，我們的樣本是來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的回顧性公開(kāi)數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步的前瞻性隊(duì)列數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。其次，我們構(gòu)建的預(yù)后模型中只包含6 個(gè)PRGs，許多與焦亡無(wú)關(guān)的有價(jià)值的基因可能被排除在外。綜上，我們研究表明細(xì)胞焦亡與膀胱癌密切相關(guān)，全面的生物信息學(xué)分析為預(yù)測(cè)膀胱癌患者的預(yù)后提供了新的基因標(biāo)記，并為進(jìn)一步研究膀胱癌中PRGs與免疫之間的關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)。