義明東，唐新橋，張 強(qiáng)

（南華大學(xué)附屬湘潭市中心醫(yī)院 湘潭 411100）

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis）是一種消耗性的疾病，主要機(jī)制是破壞骨質(zhì)及骨骼的微結(jié)構(gòu)功能[1-2]；骨折是其主要并發(fā)癥，常因一些無關(guān)緊要的小損傷引發(fā)骨折，嚴(yán)重降低了骨質(zhì)疏松癥骨折患者的生活質(zhì)量；有文獻(xiàn)表明，目前世界上因骨質(zhì)疏松癥引起的骨折患者超過890 萬例/年[3]。但是，單純的骨質(zhì)疏松癥極易被忽視，導(dǎo)致診斷及治療不及時(shí)。骨質(zhì)疏松癥受到各種危險(xiǎn)因素的影響，包括家族史、性別、酗酒和濫用藥物、飲食和鍛煉以及女性的雌激素水平。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PO）是骨質(zhì)疏松癥的一種特殊類型，指由絕經(jīng)引起的相關(guān)雌激素戒斷所引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥；其主要特征是伴隨著雌性激素的進(jìn)行性下降，導(dǎo)致骨量降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞，最終使得骨脆性增加，其發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為全世界絕經(jīng)后老年女性的主要健康問題之一[4-5]；給全世界絕經(jīng)后女性患者及家庭帶來了極大的困擾。據(jù)估計(jì)，2010 年在美國(guó)，有多達(dá)1020 萬65 歲及以上的成年人患有骨質(zhì)疏松癥，預(yù)計(jì)每年都會(huì)增加[6]。毫不奇怪，年度骨質(zhì)疏松癥總體發(fā)病率上升后，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患病率也會(huì)有一定程度的增加[7]。因?yàn)檫@些事件每年的死亡率為20%[7]。根據(jù)流行病學(xué)研究，2010 年生活在歐洲聯(lián)盟的2200 萬婦女和550 萬男子患有骨質(zhì)疏松癥[8-9]，有超過350 萬的新殘疾婦女得以維持[10]。特別值得一提的是，預(yù)計(jì)在印度這個(gè)國(guó)家里，50 歲以上人口總數(shù)增幅最高，從2013 年的1.2 億增加到2050 年的6.2 億[11]。在埃及，有報(bào)告表明，絕經(jīng)后婦女中存在骨質(zhì)疏松癥（28.4%）和骨量減少（53.9%），并且全球范圍內(nèi)其發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)[4]。

及早預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥是降低絕經(jīng)后婦女骨折并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的最佳治療方案[3]；當(dāng)今臨床上用于治療骨質(zhì)疏松的藥物種類繁多，如降鈣素、二膦酸鹽類、甲狀旁腺激素及雌激素替代療法等藥物，包括阿侖膦酸鈉（Alendronate，AN）在內(nèi)的二膦酸鹽是目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一線藥物。但骨質(zhì)疏松癥是一種長(zhǎng)期的病理過程，常常需要進(jìn)行長(zhǎng)期的治療[3]，導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率及嚴(yán)重程度大大的增加，例如增加心腦血管意外發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并易引發(fā)各類癌癥的擴(kuò)散或發(fā)展[3]。在21 世紀(jì)后，世界各國(guó)對(duì)骨質(zhì)疏松癥治療的醫(yī)學(xué)研究越來越多，但是各國(guó)的藥理學(xué)家發(fā)現(xiàn)，目前臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物基本上都比二膦酸鹽類藥物有著更多的副作用和器官毒性。有充分的證據(jù)證明雌激素替代療法（Estrogen replacement therapy，ERT）對(duì)老年和絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[1]，不幸的是，連續(xù)的使用ERT 具有嚴(yán)重的副作用，例如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的發(fā)生或進(jìn)展加速[1]。因此，需要新的藥物來預(yù)防或治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，或者減輕副作用。故進(jìn)入21 世紀(jì)后，各國(guó)的藥理學(xué)家深入的探索了骨質(zhì)疏松癥的治療及預(yù)防新方法。

大量文獻(xiàn)表明炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)過度是絕經(jīng)后婦女易患骨質(zhì)疏松癥重要的發(fā)病機(jī)制[2,5,12]。絕經(jīng)婦女的共同特征是體內(nèi)抗氧化劑水平的降低及氧化應(yīng)激反應(yīng)過度，并且機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激后，可以使體內(nèi)的炎癥因子水平升高；氧化應(yīng)激反應(yīng)一般是因自由基的過量產(chǎn)生、機(jī)體內(nèi)源性抗氧化機(jī)制表達(dá)水平降低或體內(nèi)炎性分子水平的增加而增加[12]。骨代謝指標(biāo)及骨周轉(zhuǎn)換標(biāo)志物指標(biāo)可體現(xiàn)骨轉(zhuǎn)換速度的水平，顯示骨質(zhì)疏松的程度。橙皮苷（Hesperidin，HP）是陳皮、柑橘等柑橘屬植物果實(shí)中的主要化合物，同時(shí)也是主要的藥效成分[13]；具有多種多樣的藥理活性，例如抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)、抗高膽固醇血癥、抗癌的作用。橙皮苷的抗炎、抗氧化和改善微循環(huán)的作用已通過各種研究報(bào)告，使用各類分析系統(tǒng)進(jìn)行了報(bào)道[13-15]。橙皮苷在動(dòng)物模型及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已被證明可通過降低炎性細(xì)胞因子水平和抗氧化作用來減輕炎癥反應(yīng)及其所導(dǎo)致的疼痛反應(yīng)[16]。同時(shí)，橙皮苷在紫外線B輻射引起的皮膚損傷的小鼠模型中，被證明有著抗氧化應(yīng)激和抗炎的作用[17]，這是通過下調(diào)機(jī)體所分泌的炎性細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6[18]來發(fā)揮作用。其可通過多途徑對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生影響，且暫未有文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)證明橙皮苷具有明顯的副作用，臨床上目前越來越多的把橙皮苷用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的輔助治療，是預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在藥物；但橙皮苷的作用機(jī)制仍未探索完善，近年來，各國(guó)的藥理學(xué)家對(duì)橙皮苷治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制的研究越來越多。橙皮苷可以抑制破骨細(xì)胞的分化[19]；但針對(duì)于抗炎及抗氧化機(jī)制所發(fā)表文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)較少。本實(shí)驗(yàn)通過建立摘除雙側(cè)卵巢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的大鼠模型并用各種濃度橙皮苷來干預(yù)，設(shè)立正常及OVX 對(duì)照組及AN 的干預(yù)作為對(duì)照，觀察橙皮苷對(duì)OVX大鼠模型的炎癥因子及超氧化物指標(biāo)變化，探討橙皮苷通過抗氧化和抗炎機(jī)制在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的抗骨質(zhì)疏松作用。

1 材料與思路

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)中使用的主要實(shí)驗(yàn)材料見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料

1.2 研究思路

具體實(shí)驗(yàn)研究思路見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)研究思路

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方案

2.1.1 模型的建立

手術(shù)之前將SD 大鼠在正常條件下飼養(yǎng)4周，在進(jìn)行手術(shù)前，讓SD 雌性大鼠適應(yīng)代謝籠環(huán)境7 天，自由進(jìn)食和水；然后，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham 組）和OVX 組；所有的實(shí)驗(yàn)性手術(shù)均在戊巴比妥（50 mg·kg-1）麻醉狀態(tài)下進(jìn)行。隨后將OVX 組大鼠進(jìn)行雙側(cè)去卵巢手術(shù)，將Sham 組大鼠進(jìn)行假手術(shù)；并在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)飼養(yǎng)4 周，以成功建立OVX 大鼠模型；4周后隨機(jī)選擇12 只OVX 及假手術(shù)組大鼠（各6 只大鼠），通過使用骨密度儀統(tǒng)一測(cè)定其距髁間窩約4 mm附近干骺端的骨密度（Bone mineral density，BMD，g·cm-2）來驗(yàn)證OVX大鼠模型建立成功。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)方案

將30只OVX 大鼠隨機(jī)分為5組，用來驗(yàn)證模型建立成功的正常雌性大鼠6 只為正常對(duì)照組，共6 組；具體分組及處理如下：Sham組：Sham大鼠+1% CMC混懸液；模型組：OVX 大鼠+1% CMC 混懸液；HP1 組：OVX大鼠+5 mg·kg-1HP；HP2 組：OVX 大鼠+10 mg·kg-1HP；HP3 組：OVX 大鼠+20 mg·kg-1HP；AN 組：OVX 大鼠+2.5 mg·kg-1AN。

各組大鼠均使用1% CMC 混懸液作為溶媒劑，通過上述的藥物及濃度，保證每只大鼠每日入量一致，在每日早晨經(jīng)口灌胃給所有大鼠，均在手術(shù)后第4 周開始給藥，共持續(xù)10周。每只大鼠在被處死前均置于在代謝籠中24 h；從所有大鼠的腹主動(dòng)脈中收集血液樣品，并離心分離血清，將血清樣品保存在-20℃的標(biāo)本柜中；用來測(cè)定不同的生化參數(shù)。立即將各組大鼠稱重；處死后，去除所有大鼠的左股骨，包裹股骨，將股骨儲(chǔ)存在-20℃的標(biāo)本柜中；用來測(cè)定骨密度和進(jìn)行生物力學(xué)分析。

2.2 骨鈣磷平衡指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1 血清鈣離子測(cè)定

采用甲基麝香草酚藍(lán)（Methyl thymol blue complexon， MTB）法測(cè)得Ca2+水平；用儲(chǔ)存的血清測(cè)定鈣水平，按生化試劑盒說明書操作，通過在酶標(biāo)儀儀器上測(cè)定520 nm的吸光度來計(jì)算游離鈣濃度。

2.2.2 血清磷離子測(cè)定

采用鉬酸銨分光光度法測(cè)得血清磷離子（P5+）的水平；同樣用儲(chǔ)存的血清測(cè)定磷水平，按生化試劑盒說明書操作，通過在酶標(biāo)儀儀器上測(cè)定660 nm 的吸光度來計(jì)算血清中磷的含量。

2.3 血清炎性分子水平的測(cè)定

使用ELISA 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的水平；使用儲(chǔ)存的血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒的說明書來操作，并且通過酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度值測(cè)定血清IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。

2.4 骨氧化應(yīng)激因子的測(cè)定

取出儲(chǔ)存的股骨，在冷0.9%生理鹽水中勻漿，達(dá)到勻漿（10%），然后在離心機(jī)中以15000 r-min 離心，獲得澄清的上清液。

2.4.1 TBARS的測(cè)定

采用TBAR 法估計(jì)骨氧化應(yīng)激酶硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（Thiobarbiturates，TBARS）；在生化試劑盒中，加入不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物醛類和實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，生成有色物，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記，通過酶標(biāo)儀測(cè)定最大吸收峰于450 nm 處的吸光度，計(jì)算大鼠左股骨中TBARS的水平。

2.4.2 GSH、GPx的測(cè)定

使用DTNB 法測(cè)得谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化氫酶（Glutathione peroxide，GPx）的水平；嚴(yán)格按照生化試劑盒說明書操作，加入一定量的DTNB 試劑和實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，生成的復(fù)合物，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記，在412 nm處有特征吸收峰；并且吸光度與GSH含量成正比，與GPx含量呈反比；412 nm處吸光度的上升即可反應(yīng)GSH 的活性。412 nm 處吸光度的下降即可反應(yīng)GPx 的活性；可測(cè)得大鼠左股骨中GSH和GPx的水平。

2.4.3 GR、GST和CAT的測(cè)定

采用紫外吸收法測(cè)定谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase，GST）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）的水平；將實(shí)驗(yàn)標(biāo)本分別與GR 測(cè)定液、GST 測(cè)定液、CAT 測(cè)定液混勻；通過酶標(biāo)儀測(cè)定240 nm 波長(zhǎng)的初始吸光度和1 min 后的吸光度。計(jì)算兩者間的差值，即可測(cè)得大鼠左股骨中GR、GST、CAT的水平。

2.5 骨周轉(zhuǎn)換指標(biāo)的測(cè)定

在骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)試劑盒中采用ELISA 法測(cè)得大鼠血清中骨特異性堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、β 膠聯(lián)降解產(chǎn)物（β-Crosslaps，β-CTX）和酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）的水平和血清骨鈣素（Osteocalcin，OC）的活性；分別將預(yù)先包被人骨特異性堿性磷酸酶（B-ALP）捕獲抗體、人骨特異性堿性磷酸酶（B-ACP）捕獲抗體、人骨特異性堿性磷酸酶（β-CTX）、人骨特異性骨鈣素（OC）捕獲抗體加入96孔板中，設(shè)置樣本孔和標(biāo)本孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，再加入HRP 標(biāo)記的檢測(cè)抗體，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm 波長(zhǎng)的吸光度，就可以計(jì)算出血清中ALP、ACP、β-CTX和OC的水平。

2.6 骨密度測(cè)量

骨密度分為面積骨密度和體積骨密度；面積骨密度是指所測(cè)單位面積所含有的骨礦物質(zhì)。使用儲(chǔ)存的股骨以1 mm·s-1的速度在數(shù)字DR 雙能X 線骨密度測(cè)試儀上測(cè)得大鼠左股骨的面積骨密度，用g·cm-2來表示大鼠的BMD。

2.7 生物力學(xué)的評(píng)估

通過進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠左股骨的生物力學(xué)參數(shù)。在三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)儀器上的測(cè)試件中間及兩端位置分別測(cè)量測(cè)試件的長(zhǎng)、短外徑，然后將制備好的大鼠左股骨放置于儀器的支座上，以測(cè)試件與支座的接觸為點(diǎn)接觸，其橫截面短軸的方向與載荷方向一致，記錄位移（mm）和中心載荷；直至骨折發(fā)生在骨中。可用此方法測(cè)定楊氏模量（Young’s mod）、最大應(yīng)力（Maximum load）、最大載荷（Maximum load）和能量吸收（Engergy）的水平。

2.8 SIRT1基因檢測(cè)

2.8.1 逆轉(zhuǎn)錄PCR

采用cDNA 分離試劑盒，以大鼠股骨作為標(biāo)本常規(guī)提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR 法進(jìn)行1 步PCR：37℃15 min，最后85℃ 5 s，使酶變性失活，最后4℃保存10 min。沉默調(diào)節(jié)蛋白1（Recombinant Sirtuin 1，SIRT1）基因上游引物：5’-CCAGATCCTCAAGCCATG-3’，下游引物：5’-TTGGATTCCTGCAACCTG-3’。

2.8.2 PCR檢測(cè)

PCR 檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行，PCR 反應(yīng)條件：第一步95℃預(yù)變性30 s；第二步95℃變性5 s，第三步60℃退火40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)31 s，最后進(jìn)行溶解階段。所有結(jié)果經(jīng)GAPDH 內(nèi)參校正后，ΔΔCt 法計(jì)算最終結(jié)果并采用2-ΔΔCt表示。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 橙皮苷對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

在各組大鼠治療期間，Sham 組、OVX 各組大鼠均顯示體質(zhì)量增加；而經(jīng)過HP 或AN 治療后顯著降低了大鼠的體質(zhì)量增加量（P<0.001）（圖2），且HP 的影響呈濃度依賴性（圖2）；這些結(jié)果提示經(jīng)過去卵巢手術(shù)后，雌性大鼠的體質(zhì)量增加幅度較前顯著增加，經(jīng)過HP 及AN 處理后可有效的抑制大鼠體質(zhì)量的增加幅度。

圖2 HP對(duì)大鼠體質(zhì)量增加水平的影響（±s）

3.2 橙皮苷對(duì)Ca2+和P5+的影響

在骨質(zhì)疏松期間，測(cè)得Ca2+和P5+水平升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與Sham 組大鼠相比，OVX 組大鼠均表現(xiàn)出增加的Ca2+和P5+（圖3），HP 顯著降低了Ca2+和P5+的水平（圖3）（P<0.001）。同時(shí)，HP的影響呈濃度依賴性，AN組表現(xiàn)為類似的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖3 HP對(duì)大鼠的血清Ca2+和P5+水平的影響（±s）

3.3 橙皮苷對(duì)炎性分子的影響

機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)在骨質(zhì)疏松發(fā)生進(jìn)展和中起著重要的作用。與Sham 組相比，OVX 組大鼠均表現(xiàn)出炎性分子水平的升高：IL-1β、TNF-α 和IL-6（圖4），HP 治療組顯著降低了OVX 大鼠IL-1β、TNF-α 和IL-6 的水平，且呈濃度依賴性影響（圖4）。AN 組表現(xiàn)為類似的結(jié)果。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖4 HP對(duì)大鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影響（±s）

3.4 抗氧化酶和氧化應(yīng)激參數(shù)分析

OVX 組大鼠與Sham 組大鼠相比，氧化應(yīng)激參數(shù)在骨質(zhì)疏松期間表現(xiàn)為TBARS升高和GSH、GST、GR、GPx 和CAT 下降（圖5）。HP 和AN 給藥處理后均顯著降低了OVX 大鼠的TBARS 水平和升高了OVX 大鼠GSH、GST、GR、GPx 和CAT 的水平，且呈濃度依賴性（圖5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖5 HP對(duì)大鼠股骨TBARS、GSH、GST、GR、GPx和CAT水平的影響（±s）

3.5 骨周轉(zhuǎn)換指標(biāo)參數(shù)分析

下列各圖表清晰的顯示了各組大鼠在給藥后骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)參數(shù)的影響。OVX 組大鼠相比于Sham 組來說，表現(xiàn)為ALP、ACP、β-CTX 和OC 指標(biāo)的升高（圖6）。HP 顯著降低了OVX 大鼠ALP、ACP、β-CTX和OC 的水平，且影響呈濃度依賴性（圖6）。AN 組表現(xiàn)為類似的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖6 HP對(duì)大鼠血清ALP、ACP、β-CTX和OC水平的影響（±s）

3.6 橙皮苷對(duì)骨密度的影響

各組大鼠之間BMD 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果如圖7 所示。與Sham 組大鼠相比，OVX 組表現(xiàn)出BMD 水平的下降（圖7）。經(jīng)過HP 給藥處理后的各組大鼠顯示了OVX大鼠BMD 水平的上調(diào)（圖7），且影響呈濃度依賴性。AN 組跟HP 處理后結(jié)果類似，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖7 HP對(duì)大鼠股骨BMD水平的影響（±s）

3.7 生物力學(xué)參數(shù)分析

OVX 組大鼠表現(xiàn)為骨生物力學(xué)參數(shù)楊氏模量、最大應(yīng)力、最大載荷和能量吸收減少，相對(duì)于Sham 組來說（圖8）。OVX 誘導(dǎo)的大鼠用HP 給藥處理后顯著增加了楊氏模量、最大應(yīng)力、最大載荷和能量吸收的水平（圖8），而且影響呈濃度依賴性，AN 組表現(xiàn)為類似的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖8 HP對(duì)大鼠股骨楊氏模量、最大應(yīng)力、最大載荷和能量吸收水平的影響（±s）

3.8 PCR分析

與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠表現(xiàn)出SIRT1的表達(dá)增加（圖9）。HP 給藥后大鼠顯著以濃度依賴性的方式減少了OVX 大鼠SIRT1 的表達(dá)（圖9）。AN 組表現(xiàn)為類似的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

圖9 HP對(duì)大鼠股骨SIRT1表達(dá)水平的影響（±s）

4 討論

大量文獻(xiàn)及研究證明，絕經(jīng)后老年婦女因?yàn)闄C(jī)體的雌激素水平逐步下降，會(huì)導(dǎo)致骨形成的減少，從而破壞骨平衡，容易在組織的層面繼發(fā)骨質(zhì)疏松癥，在機(jī)體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展通常需要長(zhǎng)期的演變過程[5]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)理可以進(jìn)行多方面的研究[3]，其治療方案的研究也越來越多。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的直觀病理機(jī)制是機(jī)體內(nèi)雌激素水平下降和機(jī)體的衰老，主要在于增加了炎性因子的產(chǎn)生，發(fā)揮破骨細(xì)胞的特性；機(jī)體內(nèi)的炎性因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）增加，放大了RANKL 的表達(dá)，通過這一機(jī)制表達(dá)的增加，促進(jìn)體內(nèi)破骨細(xì)胞的形成[20]。局部和全身性骨丟失也是炎癥性風(fēng)濕性疾病的標(biāo)志，反映了骨和機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生之間相互作用的密切聯(lián)系，導(dǎo)致破骨細(xì)胞過度激活，從而導(dǎo)致骨形成和骨吸收的解偶聯(lián)。機(jī)體骨吸收作用的信號(hào)通路主要是核因子-κB（NF-κB）配體受體激活劑（RANKL）系統(tǒng)，其主要是由成骨細(xì)胞表達(dá)；它與破骨細(xì)胞前體和成熟破骨細(xì)胞上的受體RANKL 結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成和骨吸收。SIRT1 基因的表達(dá)與NF-κB 配體受體激活劑（RANKL）系統(tǒng)的表達(dá)息息相關(guān)；此前研究表明，絕經(jīng)后雌二醇水平的降低會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和促紅細(xì)胞生成素水平降低[3]；而機(jī)體血流量與BMD呈正向相關(guān)關(guān)系并近乎同時(shí)發(fā)生[4]，說明體內(nèi)雌激素水平的下降，可以引起血流量水平的變化，是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的一大危險(xiǎn)因素。通過這一發(fā)病機(jī)制，表明增加骨骼內(nèi)血液供應(yīng)的有效植物成分及藥物可能對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥有效；血清中的骨代謝（Ca2+、P5+、ALP、ACP、β-CTX 和OC）的水平變化情況可以反映機(jī)體骨轉(zhuǎn)換的狀態(tài)，體現(xiàn)機(jī)體的骨質(zhì)疏松程度；血清中的炎性細(xì)胞因子指標(biāo)及股骨的氧化應(yīng)激因子及抗氧化酶指標(biāo)可反映機(jī)體的炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)水平；骨密度和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)變化可以反映出骨量的變化，楊氏模量、最大應(yīng)力、最大載荷和能量吸收的測(cè)定可以評(píng)估骨骼的骨質(zhì)水平，SIRT1 基因的表達(dá)變化可以反映NF-kB 配體受體激活劑（RANKL）系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)以SD 雌性大鼠的骨密度、血清骨代謝指標(biāo)、炎性因子、氧化應(yīng)激因子、骨微觀結(jié)果變化及SIRT1基因的表達(dá)為主要變化指標(biāo)研究橙皮苷通過抗炎及抗氧化作用于去卵巢大鼠所起得的治療效果。

骨質(zhì)疏松癥在骨折發(fā)生之前很難明確診斷，影像學(xué)表現(xiàn)也不明顯，所以被稱為是一種沉默的疾病[21]。從中醫(yī)的角度分析，在數(shù)千年以前，各種各類的中草藥就已被用于治療各方面的疾病，特別是對(duì)慢性疾病，中草藥不僅能促進(jìn)骨折的愈合，而且安全性及性價(jià)比均比化學(xué)藥品更高[22-24]，隨著人們對(duì)骨質(zhì)疏松癥的新療法的迫切需要，從中藥里面發(fā)現(xiàn)潛在的骨活性化合物已經(jīng)成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域；并且由于目前用于長(zhǎng)期治療骨質(zhì)疏松癥的臨床藥物所帶來的的副作用，導(dǎo)致在世界范圍內(nèi)，中草藥用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為21 世紀(jì)的研究熱點(diǎn)之一。很多藥理學(xué)家已經(jīng)在開展中草藥生物活性因子的作用及相關(guān)機(jī)制的研究，并取得一定的成果，HP 是柑橘屬植物果實(shí)中的主要活性成分，是大量藥理學(xué)家近年來研究出的可用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的一種潛在藥物[4-5,13-14]，是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的潛在藥物之一。

多年來的研究已經(jīng)證明了骨骼作為一個(gè)器官的核心作用，與其他幾個(gè)組織不斷地交換和調(diào)節(jié)[25]。普遍認(rèn)為，骨骼具有運(yùn)動(dòng)、物理性的保護(hù)內(nèi)部器官和調(diào)節(jié)礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面的作用，還可通過成骨細(xì)胞分泌骨鈣素影響男性生育能力和認(rèn)知功能[26-27]。在骨重塑過程中，機(jī)體可以通過靶向釋放和摻入骨基質(zhì)的方式，來維持機(jī)體血清內(nèi)Ca2+和P5+之間的動(dòng)態(tài)平衡[25]。重塑在整個(gè)骨穩(wěn)態(tài)中的重要作用體現(xiàn)在有利于骨吸收，而不是有利于骨形成，骨重建受損是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等骨病理的基本病理生理機(jī)制[25]。正常人體及正常大鼠機(jī)體的骨質(zhì)吸收和骨質(zhì)形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，而絕經(jīng)后婦女容易繼發(fā)骨質(zhì)疏松，其原因是雌激素水平的下降，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)破骨細(xì)胞增殖分化過于活躍，導(dǎo)致機(jī)體的骨重建失衡，使得機(jī)體骨吸收速度大于骨形成速度，抑制機(jī)體新骨的形成，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，屬于一種高轉(zhuǎn)化性骨質(zhì)疏松癥。在本實(shí)驗(yàn)中，OVX 大鼠血清中的OC水平升高可以表明OVX大鼠新形成的成骨細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，而ALP、ACP 及β-CTX 水平的變化是反映機(jī)體骨形成和骨轉(zhuǎn)換的重要生化指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成功建立高轉(zhuǎn)化性骨質(zhì)疏松癥模型，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床特征相符，表明成功建立OVX骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，可用來作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)研究。

根據(jù)先前的研究，機(jī)體內(nèi)的超氧化物主要包括活性氧（Reactive oxygen species，ROS）及活性氮（Reactive nitrogenspecies，RNS），主要是ROS 參與雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥[12]；過多的過氧化氫被認(rèn)為是損傷細(xì)胞（包括軟骨細(xì)胞）過程中的關(guān)鍵介質(zhì)[28]；活性氧是有氧代謝的副產(chǎn)物，如羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫。通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的，并且是氧的活性衍生物[29]；在生理?xiàng)l件下，ROS作為信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)不同的生物過程。H2O2對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，但加入HP 后抑制作用明顯減弱[30]，來自動(dòng)物研究的證據(jù)支持ROS 對(duì)骨骼健康的有害影響[31-35]。在該實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)OVX 大鼠相對(duì)于Sham 組大鼠來說，增加了TBARS 的水平并降低了內(nèi)源性抗氧化酶的水平；證實(shí)了雌激素缺乏可在一定程度上增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)。HP 能夠通過激活或增加機(jī)體內(nèi)源性抗氧化酶（GSH、GST、GR、GPx 和CAT）的活性，使得體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)下降[36]，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。破骨細(xì)胞因子IL-6、IL-17、干擾素-γ、TNF-α、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等促進(jìn)骨吸收、抑制成骨細(xì)胞[37]。IL-6 是多發(fā)性骨髓瘤中腫瘤漿細(xì)胞產(chǎn)生的重要破骨因子，也是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨質(zhì)丟失的主要預(yù)測(cè)因子[38]。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等Th1 型促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生是繼發(fā)性和原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)[37]。在實(shí)驗(yàn)中，OVX 組大鼠的促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平顯著上升；HP 治療可顯著降低OVX 組大鼠的促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平；OVX 各組大鼠相對(duì)于Sham組大鼠，OVX 大鼠發(fā)生了骨質(zhì)丟失并且機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激因子TBARS堆積升高且抗氧化酶水平下降，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高。OVX 組大鼠經(jīng)過HP 或AN的治療，有效地清除了氧化應(yīng)激因子TBARS，使抗氧化酶GSH、GST、GR、GPx 和CAT 升高；降低了機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，減輕了骨質(zhì)的丟失并延緩了骨質(zhì)疏松的發(fā)生，表明HP 對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)和骨量具有保護(hù)作用；這一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Olalekan 等[39]的數(shù)據(jù)一致，HP能顯著抑制三氯乙烯誘導(dǎo)的果蠅體內(nèi)ROS 的過量產(chǎn)生，提示其具有清除ROS的作用[39]，在很大程度上恢復(fù)了氧化還原和抗氧化平衡[39]。

在此實(shí)驗(yàn)中，OVX 大鼠由于雌激素缺乏可導(dǎo)致血鈣及血磷水平升高，而經(jīng)過HP 及AN 治療后大鼠的血Ca2+和P5+水平有所下降，可以有效的治療骨質(zhì)疏松癥。此前的文獻(xiàn)顯示，血Ca2+水平的增加可能是由于改變了腸道內(nèi)源性抗氧化劑狀態(tài)，促進(jìn)了腸道對(duì)Ca2+的吸收[3]。骨周轉(zhuǎn)換物的指標(biāo)可反映骨形成功能，在此實(shí)驗(yàn)中，顯然，OVX 大鼠的骨周轉(zhuǎn)換物質(zhì)水平上升，相對(duì)于Sham 組來說，HP 可以有效的通過降低骨周轉(zhuǎn)換物來治療骨質(zhì)疏松癥。BMD 是指單位組織或器官內(nèi)礦物質(zhì)的含量，BMD 是反映骨量的主要指標(biāo)，也是決定骨強(qiáng)度的主要因素，骨骼骨密度水平的變化可以反應(yīng)出骨量的細(xì)微變化。OVX 組大鼠的BMD 水平相對(duì)于Sham 組大鼠明顯降低，HP 及AN 治療后OVX 大鼠BMD 顯著升高，表明了HP 能有效地增加OVX 大鼠的骨量。三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)可以精準(zhǔn)的反映骨骼的彎曲功能，而相關(guān)生物力學(xué)參數(shù)（楊氏模量、最大應(yīng)力、最大載荷和能量吸收）均可通過三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)得，在此實(shí)驗(yàn)中，OVX 組大鼠的生物力學(xué)參數(shù)有著顯著的下降，而經(jīng)過HP 及AN 治療后，OVX 大鼠的生物力學(xué)參數(shù)有著明顯的提升。進(jìn)一步表明了HP 具有抗骨質(zhì)疏松作用。以前的研究表明[41]SIRT1 在骨代謝和質(zhì)量中起到重要的作用。植物相關(guān)成分對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有潛在的影響[40]，并且使得SIRT1 也增加了增殖和分化。當(dāng)前研究表明，SIRT1表達(dá)的減少，可增加嚙齒動(dòng)物中的BMD[41]。在目前的實(shí)驗(yàn)方案中，OVX 組大鼠SIRT1基因的表達(dá)顯著上升，經(jīng)過HP 及AN 治療后顯著降低。故間接的反映了橙皮苷的抗骨質(zhì)疏松作用。

在當(dāng)前對(duì)HP 的相關(guān)研究中，在HP 通過抗炎和抗氧化作用在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥這一領(lǐng)域研究相對(duì)較少，相反，研究其他的作用機(jī)制相對(duì)較多。但此前大量文獻(xiàn)表明橙皮苷具有抗炎及抗氧化的作用[13-15]，而炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是PO 的主要發(fā)病機(jī)制之一[2,5,12]，通過此次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HP 可呈濃度依賴性的方式通過維持Ca2+和P5+水平的平衡、降低促炎細(xì)胞因子、增強(qiáng)抗氧化能力、降低骨周轉(zhuǎn)換物質(zhì)水平、增強(qiáng)BMD和降低SIRT1 基因的表達(dá)來在OVX 誘導(dǎo)形成的骨質(zhì)疏松癥大鼠中發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用；表明橙皮苷可通過抗炎及抗氧化作用機(jī)制在一定程度上預(yù)防或治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。

但本實(shí)驗(yàn)仍有不足之處，OVX 大鼠的研究模型有一定的局限性且未涉及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，因此需要進(jìn)一步的細(xì)胞研究或其他體外研究驗(yàn)證其作用機(jī)制。同時(shí)，HP的濃度選取是否覆蓋橙皮苷對(duì)OVX 大鼠的各項(xiàng)生化指標(biāo)、骨生物力學(xué)及基因的影響濃度峰值尚不可知，需要更多的體外研究驗(yàn)證HP 其濃度依賴性。總之，HP 可以作為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物，但具體治療效果需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)甚至臨床相關(guān)研究。