樂 薇，姚函伶，楊格格，吳貽森，徐派的＊＊

（1.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 武漢 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院 武漢 430065）

功能性消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是以進(jìn)食后出現(xiàn)飽脹不適、上腹部燒灼性疼痛為主，伴惡心、噯氣，或見焦慮、抑郁等心理癥狀的非器質(zhì)性胃腸疾病[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，功能性胃腸疾病在中國的發(fā)病率高達(dá)35%，其中FD的患病率約占比1/6[2]。目前關(guān)于FD 的研究多集中在胃排空延遲、腦-腸軸功能紊亂、內(nèi)臟高敏性、十二指腸炎癥等領(lǐng)域[3-6]，其中腦-腸軸作為大腦和胃腸道的雙向調(diào)節(jié)軸，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)層面可通過下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamicpituitary-adrenal axis，HPA）軸分泌激素，在正常情況下，HPA 軸有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，參與機體應(yīng)激反應(yīng)的作用。當(dāng)長期慢性應(yīng)激導(dǎo)致HPA 軸功能亢進(jìn)時，可影響機體的消化、免疫、情志，導(dǎo)致FD 的發(fā)病[7]。5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin releasing homone，CRH）廣泛分布于腦和胃腸組織中，可增強腦與胃腸之間的內(nèi)在聯(lián)系，被稱之為“腦腸肽”[7]。研究顯示，電針可抑制亢進(jìn)的HPA軸，下調(diào)5-HT、CRH 的表達(dá)，有加速胃排空，恢復(fù)胃腸消化功能，抗焦慮等作用[8-9]。5-羥色胺3 受體（5-hydroxytryptamine-3 receptor，5-HT3R）作為5-HT唯一的離子通道型受體，其高電流密度可加重胃腸不適，并與抑郁情緒的產(chǎn)生密切相關(guān)[10]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2（Corticotropin-releasing-factor receptor 2，CRHR2）是CRH 的亞型受體，可與CRH 多肽緊密結(jié)合，有減輕內(nèi)臟疼痛，抗抑郁的作用[11]。NOD樣受體蛋白6（Nod-like receptor pyrin domaincontaining protein 6，NLRP6）在腸上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，可以組成炎癥小體復(fù)合物[12]與杯狀細(xì)胞一起參與腸道免疫的調(diào)控，在腸道黏液分泌、黏膜屏障、腸道炎癥方面有正向的調(diào)節(jié)作用[13]。

本課題前期已從胃腸動力、內(nèi)臟高敏性、十二指腸炎癥、焦慮抑郁情緒等[14-17]層面展開研究，實驗表明電針可有效提升FD 治療效果，但電針降低FD 大鼠HPA 軸的具體作用機制還有待深入研究，本實驗建立FD模型大鼠，以大鼠下丘腦、胃腸為觀察點，旨在從行為學(xué)、細(xì)胞、分子學(xué)角度，觀察電針對FD 模型大鼠曠場自主活動行為，胃黏膜細(xì)胞，十二指腸杯狀細(xì)胞，下丘腦5-HT3R、CRH，十二指腸CRHR2、NLRP6 的水平，探討電針對FD大鼠HPA軸的干預(yù)作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物與分組

SPF 級SD 雄性大鼠，40 只，體質(zhì)量180-200 g，由三峽大學(xué)動物實驗中心供應(yīng)，許可證號：SCXK（鄂）2022-0012。SD 大鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房，室溫（22±2）℃，晝夜明暗交替12 h，SD 大鼠自由采食無菌飼料、飲用無菌水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機取10 只SD 大鼠組成空白組，剩余SD 大鼠行造模處理，14 天造模結(jié)束后，隨機取10 只SD 大鼠組成模型組，10 只SD 大鼠組成電針組。電針組繼續(xù)予以14 天電針干預(yù)。本實驗所有操作均符合《湖北省動物管理條例》條文規(guī)定（HUCMS202203001）[18]。

1.2 主要試劑與儀器

CRHR2抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號：25267-2-AP）；NLRP6 抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號：A15628）；內(nèi)參抗體GAPDH（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：GB12002）；HE 染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1003）；阿利新藍(lán)染液套裝（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1027）；三氯甲烷（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，貨號：10006818）；華佗穴位電針儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，型號：SDZ-Ⅱ型）；一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，0.28 mm×25 mm）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad，型號：CFX）；超微量分光光度計（賽默飛世爾中國科技有限公司，型號：NanoDrop2000）；酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：RT-6100）；臺式高速冷凍離心機（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，型號：D3024R）；轉(zhuǎn)印電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號：SVT-2）；正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司，型號：Nikon Eclipse E100）；全景切片掃描儀（三達(dá)科技股份有限公司，型號：PANNORAMIC 1000）等。

2 方法

2.1 建立FD大鼠模型

除10只空白組大鼠外，剩余大鼠均采取冰生理鹽水灌胃+不規(guī)則飲食+夾尾造模處理[19]，每日8∶30 和15∶00灌胃，提前解凍冰生理鹽水待用，當(dāng)出現(xiàn)部分流動液體后開始灌胃，每只灌胃2 mL。灌胃結(jié)束后行夾尾處理，采用240 mm 止血鉗，將止血鉗頭部用自粘繃帶包裹，夾取部位選擇大鼠尾端1/3 處，輕輕夾起尾端，激怒大鼠，使其撕咬同籠大鼠，讓全籠大鼠處于一種焦躁、恐慌的狀態(tài)。操作過程中隨時觀察大鼠尾端情況，避免夾的太緊或時間過長而引發(fā)尾部缺血壞死，每次30 min，每天2 次，連續(xù)夾尾14 天。每日實驗結(jié)束后，查看大鼠尾部狀態(tài)，破皮處予以消毒處理，避免尾部感染。雙日8∶00清除大鼠籠子里剩余的飼料，行禁食處理，補充無菌水，自由飲水。當(dāng)大鼠表現(xiàn)為喜扎堆，蜷縮角落，少動，毛發(fā)雜亂發(fā)黃，大便稀軟，可聞及刺激腥臭味，剩余飼料增多，體質(zhì)量增長緩慢，提示造模成功[20]。

2.2 干預(yù)方法

空白組：常規(guī)飼養(yǎng)，不做特殊干預(yù)處理。模型組：造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)，在電針組電針干預(yù)期間，抓取模型組大鼠，穿自制鼠衣，用相同的方法固定于鼠架上，每次30 min，每天1次，連續(xù)干預(yù)14天。電針組：造模結(jié)束第2天，用自制鼠衣將大鼠固定于鼠架上，暴露雙側(cè)上、下肢，取印堂（兩眼眶上緣最高點連線的中點，向下平刺5 mm）、內(nèi)關(guān)（前肢內(nèi)側(cè)，距腕關(guān)節(jié)約3 mm 的尺橈骨縫間，直刺1 mm）以及足三里（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨頭下約5 mm處，直刺7 mm），定位參考《實驗動物常用穴位名稱與定位 第2部分：大鼠》[21]，穴位消毒后，用一次性毫針（0.28 mm×25 mm）針刺，快速破皮，得氣后，開啟華佗牌電針儀，1 組電極連接同側(cè)內(nèi)關(guān)、足三里針柄，一共2 組電極，采用連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強度1 mA，四肢微微抖動即可，干預(yù)結(jié)束后，拔出電針，無菌棉球按壓，避免出血。每次電針干預(yù)時長為30 min，每天1次，連續(xù)干預(yù)14天。

2.3 取材

電針干預(yù)結(jié)束后行最后1 次曠場實驗，實驗結(jié)束后，采用隨機排列表法，每組選取5 只大鼠，予以禁食處理，為第2 天取材做準(zhǔn)備。腹腔注射，麻醉大鼠，全身麻醉后，用手術(shù)刀片逐層切開，暴露腹腔，找到胃賁門及幽門，用細(xì)線結(jié)扎，剪斷連接處，取出全胃，剪取胃竇，置于裝有4%多聚甲醛的痰杯中固定。后用鑷子分離與其他組織相連的腸管，剪取多段十二指腸組織，沿腸壁一側(cè)剪開十二指腸，清除腸內(nèi)容物后，置于-80℃保存待用。剪取腦，迅速剝離全腦，在冰臺上取大鼠下丘腦組織，將分離出的下丘腦組織用冰生理鹽水沖洗，除去血液后，再用濾紙吸干水分，置于凍存管內(nèi)，后加入RNA 保存液，放入干冰中迅速冷凍待檢。

2.4 觀察指標(biāo)與檢測方法

2.4.1 大鼠一般狀態(tài)

每日8∶00給各組大鼠稱重，觀察并記錄各組大鼠實驗過程中的活動度、進(jìn)食量、體質(zhì)量的變化情況、毛發(fā)的整潔度、大便的干燥度等。

2.4.2 曠場實驗

采用曠場實驗檢測各組大鼠的自主行為以及對陌生環(huán)境的緊張度。分別于造模結(jié)束后、干預(yù)1 周及干預(yù)2周后進(jìn)行曠場實驗，調(diào)試好設(shè)備后，將大鼠放置于長寬均40 cm，高50 cm 的正方形反應(yīng)箱的中央?yún)^(qū)域，適應(yīng)30 s 后，開始計時，每只大鼠測試時長為5 min，采用Smart 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，記錄5 min內(nèi)大鼠的自主運動距離和運動速度，全程保持安靜，以免干擾大鼠活動。每只大鼠檢測完畢后，先噴灑75%乙醇酒精，再用酒精濕巾清潔前1 只大鼠留在反應(yīng)箱內(nèi)壁及底面的大小便，最后用干紙巾擦干，以排除前一只大鼠留下來的氣味干擾。

2.4.3 大鼠胃竇組織病理學(xué)變化

采用HE 染色法檢測，取胃竇組織，石蠟包埋，用切片機切成厚度5 μm的薄片，蘇木素染色5 min，自來水洗，分化液分化，再次水洗，返藍(lán)液藍(lán)化，入伊紅染液中染色5 min，漂洗透明，樹膠封片。置于×200 光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠胃竇組織形態(tài)。

2.4.4 大鼠下丘腦5-HT3R、CRH表達(dá)

采用實時熒光定量PCR 法檢測，取100 mg凍存的下丘腦組織，剪碎后充分研磨至無肉眼可見組織塊，用TRIzol 法提取總RNA，取10 μL RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用實時熒光定量PCR 儀進(jìn)行目的mRNA含量檢測。5-HT3R、CRH 和GAPDH 引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，序列見表1。反應(yīng)條件95℃持續(xù)30 min 預(yù)變性，然后95℃持續(xù)15 s，最后60℃持續(xù)30 s，連續(xù)40 次，監(jiān)測熔解曲線，以2-△△Ct法算出大鼠下丘腦5-HT3R、CRH mRNA相對表達(dá)量。

表1 mRNA引物序列

2.4.5 大鼠十二指腸CRHR2，NLRP6蛋白表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測，取50 mg 十二指腸組織，添加250 μL RIPA 裂解液，低溫研磨，提取蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白的質(zhì)量濃度；經(jīng)SDS-PAGE 凝膠泳道上樣，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)膜，室溫封閉30 min；添加一抗（CRHR2 1∶1000，NLRP6 1∶1000），4℃恒溫孵化一夜，用TBST 洗膜3 次，添加HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗小鼠IgG 1∶5000），室溫孵化30 min，添加ECL 溶液曝光，GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件提取目的條帶灰度值。

2.4.6 大鼠十二指腸杯狀細(xì)胞的表達(dá)

采用阿利新藍(lán)染色法檢測，取凍存的十二指腸組織，石蠟包埋，超薄切片后，脫臘水洗，將切片浸泡于阿利新藍(lán)A 染液中10 min，水洗后，用阿利新藍(lán)B 染液浸染細(xì)胞核3 min，至細(xì)胞核清晰，脫水透明，樹膠封片。使用CaseViewer2.2 掃描瀏覽軟件選取組織的目的區(qū)域進(jìn)行成像（×100），成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件分別測量每張切片中5 根絨毛上皮長度（mm），并計算上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量，可按照如下方法計算：單位長度杯狀細(xì)胞=杯狀細(xì)胞/腸腺上皮長度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

選用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊用LSD 檢驗，方差不齊采用Dunnett-t檢驗；組內(nèi)比較采用重復(fù)測量方差分析法。以P<0.05 或P<0.01 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的一般狀態(tài)比較

造模前，各組大鼠反應(yīng)靈敏，常有毛發(fā)修飾行為，糞便干燥。造模14天后，模型組和電針組大鼠反應(yīng)遲鈍，昏睡，毛發(fā)發(fā)黃雜亂，大便不成形伴腥臭味。電針干預(yù)14天后，與模型組相比，電針組大鼠機警，動作敏捷，毛發(fā)柔順，大便顆粒狀，無明顯刺激異味。

3.2 各組大鼠曠場實驗對比

造模后，與空白組相比，模型組和電針組大鼠的曠場自主運動距離明顯縮短，運動速度明顯減慢（P<0.01）；干預(yù)2 周后，與空白組相比，模型組大鼠的曠場自主運動距離及運動速度均呈下降趨勢（P<0.01），中央?yún)^(qū)運動減少，多在周圍區(qū)徘徊。與模型組相比，電針組大鼠的曠場自主運動距離及運動速度均明顯上升（P<0.01），其中央?yún)^(qū)穿行次數(shù)增多。見圖1及表2-3。

圖1 各組電針干預(yù)2周后的曠場實驗軌跡比較

表2 各組大鼠干預(yù)前后自主運動距離比較（±s，n=10，cm）

表2 各組大鼠干預(yù)前后自主運動距離比較（±s，n=10，cm）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

干預(yù)2周后1487.35±334.58 250.52±85.75**1417.13±359.21△△組別空白組模型組電針組造模后1514.01±316.02 378.45±260.09**394.04±227.6**干預(yù)1周后1498.22±332.59 345.3±188.44**1251.76±372.54△△

表3 各組大鼠干預(yù)前后運動速度比較（±s，n=10，cm·s-1）

表3 各組大鼠干預(yù)前后運動速度比較（±s，n=10，cm·s-1）

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01。

干預(yù)2周后11.29±2.15 4.34±1.69**10.63±1.79△△組別空白組模型組電針組造模后10.03±2.03 5.51±1.85**5.89±1.53**干預(yù)1周后11.25±1.56 5.23±1.57**10.64±1.89△△

3.3 各組大鼠胃竇組織病理學(xué)形態(tài)比較

空白組大鼠的胃竇黏膜排列有序，各層肌纖維上色均勻，間質(zhì)細(xì)胞無明顯增生，未見炎癥反應(yīng)。模型組大鼠的胃竇基質(zhì)組織液分泌增多，黏膜有輕度水腫，可見疏松的結(jié)締組織，淋巴細(xì)胞。電針組大鼠的胃竇黏膜外觀形態(tài)正常，各層肌纖維著色一致，細(xì)胞排列整齊，黏膜上皮完整，未見明顯細(xì)胞脫落，沒有炎癥細(xì)胞聚集。見圖2。

圖2 各組大鼠胃竇組織病理學(xué)形態(tài)比較（HE染色，×200）

3.4 各組大鼠下丘腦中5-HT3R、CRH表達(dá)比較

與空白組相比，模型組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH大幅升高（P<0.05）。與模型組相比，電針組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH大幅降低（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH表達(dá)（±s，n=5）

表4 各組大鼠下丘腦5-HT3R、CRH表達(dá)（±s，n=5）

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

CRH 0.81±0.18 2.02±0.2*0.78±0.13△△組別空白組模型組電針組5-HT3R 1.05±0.3 2.66±0.76*1.11±0.28△

3.5 各組大鼠十二指腸中CRHR2、NLRP6 蛋白表達(dá)比較

與空白組相比，模型組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6 蛋白表達(dá)量大幅降低（P<0.05）。與模型組相比，電針組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6 蛋白表達(dá)大幅升高（P<0.05）。見圖3及表5。

圖3 各組大鼠十二指腸中CRHR2、NLRP6蛋白表達(dá)情況（±s）

表5 各組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6表達(dá)（±s，n=5）

表5 各組大鼠十二指腸CRHR2、NLRP6表達(dá)（±s，n=5）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

NLRP6 0.87±0.22 0.39±0.06*0.93±0.22△組別空白組模型組電針組CRHR2 1.28±0.11 0.56±0.23**1.34±0.28△△

3.6 各組大鼠十二指腸單位長度杯狀細(xì)胞數(shù)表達(dá)比較

與空白組相比，模型組大鼠十二指腸黏膜排列疏松，腸絨毛結(jié)構(gòu)破碎，可見散在分布的上皮細(xì)胞，上皮杯狀細(xì)胞嚴(yán)重缺失，單位長度杯狀細(xì)胞數(shù)表達(dá)量明顯降低。與模型組相比，電針組十二指腸絨毛排列緊密，組織完整無破碎，阿利新藍(lán)染色均勻，杯狀細(xì)胞無缺失，單位長度杯狀細(xì)胞數(shù)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。見圖4及表6。

圖4 各組大鼠十二指腸組織切片形態(tài)比較（阿利新藍(lán)染色，×100）

表6 各組大鼠十二指腸單位長度杯狀細(xì)胞數(shù)表達(dá)量（±s，n=5，n·mm-1）

表6 各組大鼠十二指腸單位長度杯狀細(xì)胞數(shù)表達(dá)量（±s，n=5，n·mm-1）

注：與模型組比較，△P<0.05。

組別單位長度杯狀細(xì)胞數(shù)51.93±10.21 35.03±5.79 56.62±9.14△空白組模型組電針組

4 討論

早在1991 年，Mearin 等[22]便提出實驗假設(shè)，認(rèn)為FD 患者的消化不良癥狀是由腦-腸軸功能失常而引發(fā)。目前有越來越多的學(xué)者更加深入地研究腦-腸軸功能與FD 的相關(guān)性， Xue等[23]發(fā)現(xiàn)腦腸肽及腸道菌群的異?？蓪δX-腸信號造成干擾，影響胃腸運動及短鏈脂肪酸的釋放，誘導(dǎo)FD 患者出現(xiàn)腸道炎癥和內(nèi)臟高敏性。?chiopu 等[24]通過多數(shù)據(jù)庫的文獻(xiàn)引證，認(rèn)為伴有精神癥狀的FD 患者可通過腸道微生物群來調(diào)控HPA軸，其中HPA軸是腦-腸軸的關(guān)鍵參與者，可對外界壓力、大腦和腸道信號做出反應(yīng)，從而達(dá)到情志與胃腸的雙向調(diào)節(jié)作用。

現(xiàn)代HPA 軸理論可從中醫(yī)經(jīng)絡(luò)循行、臟腑功能角度加以理解。手陽明大腸經(jīng)、足陽明胃經(jīng)以及手太陽小腸經(jīng)均上行絡(luò)腦。腦為髓海，頭部精氣匯聚于腦，稱為頭氣街；脾胃為水谷之海，胃腸精氣匯聚于腹部，稱為腹氣街，兩者由氣街四海相貫通，滲灌氣血津液于全身[25]，可見經(jīng)絡(luò)、氣街四海為腦與脾胃溝通的橋梁?！澳X為元神之府”可主宰人體的生命活動，主司精神及感覺運動。胃腸的受納功能依賴于大腦感知系統(tǒng)的正常運作，若大腦無法獲取胃腸的饑餓信號，即使胃腸功能無異常，胃腸也無法正常受納水谷。“脾在體合肉，主四肢”，脾胃運化水谷，化生氣血津液充養(yǎng)全身，若脾胃虛弱，氣血化生乏源，腦及四肢失于濡養(yǎng)，元神受損，則令人不寐，易感疲乏，日久則肉削肌痿，運動失司[26]。

足三里是水谷之海匯聚之所，內(nèi)關(guān)是心包經(jīng)氣聚集之要，兩者合用是臨床治療FD 的經(jīng)典配穴[27]。前期研究表明，針刺足三里可刺激胃體收縮，增加胃腸道的蠕動，還可加速胃腸道黏膜的修復(fù)[28]。針刺內(nèi)關(guān)可降低胃腸炎癥反應(yīng)，增強機體免疫力，又可下調(diào)腦區(qū)復(fù)雜度，緩解焦慮情緒[29]。鄭嘉怡等[26]認(rèn)為情志不暢可誘發(fā)或加重FD，減弱胃腸的運動功能；而胃腸排空的延遲易興奮HPA 軸，刺激CRH 的釋放，增加抑郁情緒的發(fā)作風(fēng)險，表明壓力可雙向調(diào)節(jié)FD 大腦與胃腸功能。因此，本研究在足三里、內(nèi)關(guān)的基礎(chǔ)上搭配有解郁調(diào)神的印堂作為干預(yù)選穴。李翔等[30]研究發(fā)現(xiàn)，采用針刺印堂的方法來干預(yù)抑郁模型小鼠可增加小鼠曠場實驗中央?yún)^(qū)活動時間，提升糖水偏好實驗百分比，表明針刺印堂有緩解小鼠抑郁樣行為的作用。三穴同用，以期能較好地探討電針對FD 大鼠HPA 軸的作用機制。

曠場實驗是一項用于評估實驗大鼠抑郁狀態(tài)的行為學(xué)指標(biāo)，大鼠的自主活動水平可反映其興奮性和對陌生環(huán)境的適應(yīng)性[31]。本實驗結(jié)果顯示：造模后，與空白組大鼠相比，模型和電針組大鼠曠場自主運動水平顯著下降，說明FD 大鼠經(jīng)過多因素造模刺激后出現(xiàn)類似人類的抑郁樣情緒，經(jīng)過2周的干預(yù)后，電針組大鼠自主運動距離和運動速度及中央?yún)^(qū)穿行活動均得到提升，與本課題前期實驗結(jié)果相一致，提示電針可有效改善大鼠的焦慮和抑郁行為。

5-HT 是調(diào)節(jié)胃腸功能的重要腦腸肽之一，在腦和腸道均有分布，異常釋放的5-HT 與其受體結(jié)合，可增強內(nèi)臟敏感性、誘發(fā)胃腸炎癥、降低胃腸動力[32]。5-HT3R[33]是5-HT 的受體之一，被活化的5-HT3R 可改變Na+、K+、Ca2+離子的通透性，促進(jìn)細(xì)胞外Na+、K+、Ca2+離子內(nèi)流，增強5-HT3R 通道電流密度，可引發(fā)腹脹、腹痛等胃腸道不適癥狀，同時神經(jīng)元Na+、K+、Ca2+在5-HT3R 受體介導(dǎo)的離子通道中異常流動，可加重抑郁情緒的發(fā)作[10]。隊列調(diào)查研究顯示，抑郁情緒或心理壓力會增加FD 的發(fā)病風(fēng)險。長期的慢性應(yīng)激會過度興奮HPA 軸，升高下丘腦CRH 水平，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放，增加腸道黏膜通透性[34]。CRHR2 是CRH受體之一，在腦和胃腸均有表達(dá)，與CRH 多肽Ucn2 和Ucn3 存在高親和力，主要發(fā)揮拮抗應(yīng)激反應(yīng)的作用，如抗焦慮[11]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)D 大鼠下丘腦5-HT3R、CRH 明顯增多，十二指腸CRHR2 蛋白表達(dá)減少，結(jié)合FD 大鼠曠場自主運動的減弱、光鏡下觀察到胃竇黏膜的水腫及炎癥細(xì)胞的浸潤情況，說明機體的過度應(yīng)激致使HPA 軸興奮性增高，體內(nèi)的激素、神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多，引發(fā)胃腸與心理情緒的異常。電針干預(yù)后，5-HT3R、CRH 顯著下降，CRHR2 蛋白水平升高，曠場自主運動水平提升，胃竇腫脹及炎癥情況得以改善，提示電針印堂、內(nèi)關(guān)、足三里可下調(diào)5-HT3R、CRH 的表達(dá)，提升CRHR2 蛋白水平，這與電針抑制HPA 軸過度興奮，降低胃腸炎癥，緩解抑郁情緒的作用相一致。

NLRP6 可識別腸道微生物、細(xì)菌代謝產(chǎn)物、病毒RNA 以及細(xì)菌脂磷壁酸，有增強腸道防御、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、參與機體炎癥免疫應(yīng)答的作用[35]。腸道黏膜屏障的缺損使體內(nèi)的細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)損害腸黏膜，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。杯狀細(xì)胞及其分泌物是黏液屏障的重要組成部分，具有維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)的作用[36]。Wlodarska 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏NLRP6 炎癥小體的小鼠，腸道的黏膜屏障受到損害，無法正常清除腸道黏膜表面的病原體，加大了腸道持續(xù)感染的風(fēng)險，其機制可能是黏蛋白顆粒無法和腸上皮融合進(jìn)而影響?zhàn)さ鞍椎陌伦饔?，也可能是杯狀?xì)胞自噬缺陷干擾了腸道黏液的分泌。Holzer 等[38]認(rèn)為慢性應(yīng)激可興奮HPA 軸，擾亂機體胃腸微生物菌群以及腸道穩(wěn)態(tài)。眾所周知，腸黏膜屏障是由腸黏膜細(xì)胞和免疫細(xì)胞所構(gòu)成，是機體抵抗外界病原菌侵襲的一道重要防線。如果腸道黏膜屏障的功能受損，就會對腸道細(xì)菌和外源性有害物質(zhì)的入侵產(chǎn)生影響，引發(fā)機體的過度免疫反應(yīng)，進(jìn)而引起機體的病變[39]。在這當(dāng)中，杯狀細(xì)胞以及其所分泌的黏蛋白組成了腸道免疫的第一道防線，在抵御外部刺激和微生物侵入的時候，為腸道提供了保障，對維持腸道共生菌群的平衡有很大的幫助作用，對維持十二指腸屏障的正常功能具有重要意義[40]。朱春洋等[41]采用四逆散干預(yù)FD 模型大鼠，采用阿利新藍(lán)染色法觀察到FD 模型大鼠十二指腸杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與本實驗結(jié)果一致。此外，杯狀細(xì)胞還可通過其分泌物三葉因子-3 和腸道杯狀細(xì)胞特異性蛋白-抵抗素樣分子 β 共同保障腸道屏障的完整，在此過程中由杯狀細(xì)胞表達(dá)的羥基轉(zhuǎn)移酶可防止黏蛋白的降解，降低腸道炎癥、癌細(xì)胞的致病風(fēng)險[42]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多因素干預(yù)建立的FD 模型大鼠的NLRP6蛋白表達(dá)下降，在阿利新藍(lán)染色實驗中，模型組大鼠十二指腸腸絨毛排列疏松，上皮杯狀細(xì)胞表達(dá)下降，提示FD 大鼠十二指腸黏膜屏障受損。電針組大鼠NLRP6 蛋白表達(dá)增高，腸絨毛排列緊密，組織染色均勻，上皮杯狀細(xì)胞數(shù)明顯增多，提示電針印堂、內(nèi)關(guān)、足三里可激活NLRP6 蛋白，促進(jìn)杯狀細(xì)胞表達(dá)，進(jìn)而增加腸道黏液的分泌，修復(fù)十二指腸黏膜屏障的同時還可清除有害的病原體。

綜上所述，本研究從行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)、激素和黏膜屏障等角度驗證電針印堂、內(nèi)關(guān)、足三里可作用于HPA軸，不僅可以調(diào)節(jié)胃腸動力，減輕胃腸炎癥，修復(fù)黏膜屏障，而且在心理、抑郁情緒等方面有顯著的調(diào)節(jié)作用，這也與中醫(yī)學(xué)“脾（胃）-腦”神識系統(tǒng)理論[7]相符合。