聶雅琴 烏日娜 金慧 張廣平 李永明 智利 薛仕煊 娜日格樂

心肌纖維化是多種心臟疾病、進展的重要環(huán)節(jié)，心肌細胞代謝異常、心肌肥厚、冠狀動脈硬化等因素均可導致心臟受損，引起心肌纖維化，造成心臟功能障礙，甚至威脅生命。心肌纖維化主要表現(xiàn)為心肌中膠原纖維過度沉積，膠原濃度和體積分數(shù)顯著升高，膠原類型不均衡及排列紊亂[1]。心肌纖維化參與各種心血管疾病的發(fā)生、進展過程，如充血性心力衰竭、高血壓性心臟病、心肌梗死、擴張型心肌病等。此外，在代謝性疾病中也可見到不同程度的心肌纖維化[2]。研究表明，自噬與心肌纖維化密切相關(guān)。自噬是溶酶體降解蛋白質(zhì)的高度保守過程，對機體的生存、分化、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[3]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）為高度保守的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物細胞中且含量豐富，平均10～15個核小體中含有1個HMGB1分子[4]。HMGB1可促進促炎癥因子產(chǎn)生，參與細胞增殖、分化、侵襲和自噬等過程[5]。本研究探討HMGB1通過調(diào)控自噬對心肌纖維化產(chǎn)生作用，以期為心肌纖維化的預(yù)防及臨床診治提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人心肌細胞AC16購于同派生物科技股份有限公司細胞庫。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）抗體購于英國Abcam公司。HMGB1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62抗體、磷酸肌醇-3-激酶3（PIK3C3）抗體購于美國Sigma公司。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

AC16細胞使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)液）培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，濕度為70%～80%。取生長良好的對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 免疫熒光染色檢測AC16細胞α-SMA的表達水平

將AC16細胞接種于12孔板上，待細胞貼壁后，加入不同濃度的HMGB1（0、4、20、100 μg/L），繼續(xù)培養(yǎng)6 h。每孔加入4%多聚甲醛室溫固定10 min后，加入0.5% Triton X-100室溫靜置10 min。3%牛血清蛋白封閉1 h后，加入α-SMA一抗（稀釋比例1︰100），4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例1︰200），避光室溫孵育1 h。4’6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 Western blot法檢測AC16細胞自噬信號通路蛋白及纖維化因子表達水平

取AC16細胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，加入LC3、P62、α-SMA、CollagenⅠ、p-mTOR、mTOR一抗，4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。ECL顯影，采用Gel-Pro3.0軟件分析蛋白的相對表達水平。

1.5 免疫共沉淀法檢測P62與α-SMA的作用關(guān)系

將細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基丟棄，加入Co-IP裂解液，4 ℃、10 000×g離心30 min，取上清液。按說明書進行操作，將變性后的Input和IP液進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用免疫共沉淀法檢測P62與α-SMA之間是否存在相互作用。

1.6 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組AC16細胞中CollagenⅠ和α-SMA的表達水平比較

Western blot檢測顯示，用不同濃度的HMGB1刺激AC16細胞，AC16細胞中CollagenⅠ與α-SMA的蛋白表達水平呈濃度依賴性升高。組間兩兩比較顯示，各組間CollagenⅠ與α-SMA的蛋白表達水平的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。見表1、圖1。

圖1 不同濃度HMGB1作用于AC16細胞后CollageⅠ和α-SMA蛋白表達情況

表1 不同濃度HMGB1作用于AC16細胞后Collagen Ⅰ和α-SMA的蛋白表達水平比較

免疫熒光染色顯示，HMGB1（100 μg/L）作用于AC16細胞后，α-SMA的表達水平升高。見圖2。

圖2 免疫熒光染色檢測100 μg/L HMGB1作用于AC16細胞后α-SMA的蛋白表達情況

2.2 各組AC16細胞中自噬相關(guān)蛋白的表達水平比較

Western blot檢測顯示，用不同濃度的HMGB1刺激AC16細胞，AC16細胞p-mTOR與mTOR的比值（p-mTOR/mTOR），PIK3C3、不可溶性P62的蛋白表達水平，LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)呈濃度依賴性升高，可溶性P62的蛋白表達水平呈濃度依賴性降低。組間兩兩比較顯示，各組間p-mTOR/mTOR，PIK3C3、不可溶性P62的蛋白表達水平，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。見表2、圖3。

圖3 不同濃度HMGB1作用于AC16細胞后自噬相關(guān)蛋白的表達情況

表2 不同濃度HMGB1作用于AC16細胞后自噬相關(guān)蛋白的表達水平比較

2.3 P62與α-SMA的關(guān)系

免疫共沉淀實驗顯示，P62與α-SMA存在相互作用。見圖4。

圖4 AC16細胞中p62與α-SMA的相互作用

3 討論

心肌纖維化是以細胞外基質(zhì)（ECM）成纖維細胞異常增殖，膠原過度沉積及異常分布為特征的病理現(xiàn)象。急性心肌缺血及慢性心臟疾病均可導致心臟壓力負荷增加，進而促進心肌纖維化的進展[6]。心臟成纖維細胞（CFB）在心肌纖維化中起重要作用。當機體處于穩(wěn)態(tài)時，CFB通過調(diào)節(jié)ECM的產(chǎn)生維持心臟結(jié)構(gòu)的完整性。在病理條件下，CFB激活、增殖，并分泌過量的ECM蛋白，導致心肌纖維化，引起心律失常、心臟室壁運動減低及心臟重構(gòu)[7-8]。延緩心肌纖維化有助于改善心血管疾病的預(yù)后[9-11]，但目前尚無有效預(yù)防及治療方案。

HMGB1為高度保守的核蛋白，在感染或無菌炎癥時可從細胞中釋放。研究顯示，心肌纖維細胞在高糖高脂（HGHL）干預(yù)后，HMGB1的表達水平顯著增加，提示HMGB1參與HGHL促心臟纖維化過程[12]。張妍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷HMGB1可減輕大鼠心肌梗死導致的纖維化。在急性血吸蟲病導致的肝纖維化中，抑制HMGB1可顯著降低肝纖維化水平[14]。上述研究提示，抑制HMGB1可能是治療組織纖維化的有效途徑。為了明確HMGB1對心肌纖維化的作用，我們前期研究用不同濃度HMGB1作用于小鼠原代心肌成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)HMGB1導致的CollagenⅠ和α-SMA表達水平升高呈濃度依賴性[15]?；诖私Y(jié)果，本研究用不同濃度的外源性HMGB1作用于AC16細胞，結(jié)果提示隨著外源性HMGB1濃度的增加，AC16細胞中心肌纖維化標志蛋白CollagenⅠ和α-SMA表達水平逐漸升高。

有研究發(fā)現(xiàn)，改變自噬水平可以改善心肌纖維化[16]。自噬見于多種心血管疾病，如心肌慢性缺血、心肌纖維化、心臟重構(gòu)等。自噬可抑制細胞凋亡，減輕組織損傷[17]，但過度自噬則導致細胞死亡。因此，只有當自噬活性保持在最佳平衡水平時，才可以保持正常的心血管功能[18]。P62為致癌蛋白，定位于細胞核，當細胞發(fā)生自噬時，細胞質(zhì)中的P62與泛素化蛋白結(jié)合，隨后與自噬小體內(nèi)膜上的LC3-Ⅱ蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并在自噬溶酶體中降解[19]。當自噬受到抑制時，P62的表達水平會明顯增加[20]，所以P62蛋白是自噬發(fā)生的重要標志蛋白。在自噬發(fā)生時，胞漿型LC3即LC3-Ⅰ會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3即LC3-Ⅱ，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可反映自噬水平的高低。為了評估自噬在AC16細胞纖維化中的作用，本研究檢測AC16細胞中自噬標志性蛋白的表達水平，結(jié)果顯示LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大，提示自噬被激活，LC3-Ⅱ的增加可能是由于自噬溶酶體降解過程受阻。同時，p-mTOR/mTOR、PIK3C3的表達水平顯著增加，提示自噬受抑制；可溶性P62的表達水平降低，不可溶性P62的表達水平升高，無論LC3是否發(fā)生由Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化，均代表自噬流受到抑制。以上實驗結(jié)果表明，在高濃度HMGB1作用下，即使AC16細胞中存在更多的LC3-Ⅱ，細胞內(nèi)的自噬流依然受到抑制。

HMGB1可在不同生理條件下從細胞中釋放，參與調(diào)節(jié)心肌細胞自噬及心肌纖維化[21-22]。Du等[23]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素可通過促進HMGB1表達，使心肌細胞自噬和凋亡增加，引起心臟損傷。Hu等[24]發(fā)現(xiàn)，心肌細胞在缺氧/復(fù)氧時，會出現(xiàn)自噬活性的改變，這可能與HMGB1的釋放有關(guān)。本課題組前期通過免疫熒光共定位和免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，在HMGB1的作用下，小鼠原代心肌成纖維細胞內(nèi)α-SMA與P62之間存在相互作用。本研究通過免疫共沉淀實驗驗證，AC16細胞中內(nèi)源性的P62與α-SMA之間存在相互作用，可能導致α-SMA在細胞內(nèi)堆積，并引起自噬流受阻。

本研究證實，外源性HMGB1可抑制AC16細胞中的自噬流，誘導AC16細胞纖維化。抑制HMGB1對心肌細胞的作用，有望成為預(yù)防與治療心肌纖維化的新方法。