王凝 郝燕 陳大蔚 章志國(guó) 匡丹 張清尹奕琪 魏兆蓮 周平 曹云霞

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 （合肥 230000）；2國(guó)家衛(wèi)生健康委配子及生殖道異常研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（合肥 230000）；3出生人口健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （合肥 230000）；4生殖健康與遺傳安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（合肥 230000）；5安徽省生命資源保存與人工器官工程技術(shù)研究中心 （合肥 230000）； 6安徽省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院 （合肥 230000）

常染色體隱性遺傳性多囊腎?。╝utosomal recessive polycystic kidney disease， ARPKD）為單基因常染色體隱形遺傳病，致病基因是多囊腎/多囊肝病變1 基因（polycystic kidney and hepatic disease 1， PKHD1）或DAZ 相互作用蛋白1 樣基因（DAZ interacting zinc finger protein 1 like， DZIP1L）［1-2］。ARPKD 的發(fā)病率約為1∶10 000～1∶40 000，比常染色體顯性多囊腎?。ˋDPKD）更罕見(jiàn)且更嚴(yán)重。ARPKD 發(fā)病早且十分嚴(yán)重，30%～50%患兒于圍產(chǎn)期或＜ 1 歲時(shí)即因肺功能發(fā)育不全發(fā)病死亡。存活的患兒腎功能將進(jìn)行性惡化，最終進(jìn)展至終末期腎?。‥SRD），預(yù)后很差，成年患者罕見(jiàn)［1，3］。ARPKD 尚無(wú)治愈性干預(yù)措施，其治療為對(duì)癥支持治療（包括長(zhǎng)期腎替代治療），患者并發(fā)癥多、生存質(zhì)量差、治療費(fèi)用昂貴［4］。胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）一直用于篩查患有已知遺傳疾病的夫婦的正常胚胎，以避免通過(guò)產(chǎn)前診斷終止受影響胎兒的妊娠。對(duì)于PKHD1 基因突變攜帶的父母，可通過(guò)植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing， PGT）篩選正常胚胎，或產(chǎn)前診斷篩查患病胎兒來(lái)預(yù)防ARPKD患兒的出生。常規(guī)產(chǎn)前診斷只能在妊娠后進(jìn)行，一旦確診即需治療性引產(chǎn)。而PGT可以在胚胎植入母體子宮前對(duì)胚胎進(jìn)行檢測(cè)，是一種更早期的產(chǎn)前診斷方法，可以避免妊娠后的選擇性流產(chǎn)對(duì)孕婦產(chǎn)生的身心創(chuàng)傷。ARPKD 廣泛的表型和遺傳異質(zhì)性使得需要考慮的基因數(shù)量不斷增加。相較于傳統(tǒng)的通過(guò)PCR 直接檢測(cè)突變或短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat， STR）連鎖分析，基于二代測(cè)序（next generation sequencing， NGS）的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）連鎖分析具有更高的檢測(cè)效率、更低的基因脫扣率、更確定的基因型-表型相關(guān)性，可以幫助克服PKHD1 基因的復(fù)雜性和突變位點(diǎn)的不確定性，實(shí)現(xiàn)定位克隆和產(chǎn)前診斷。國(guó)內(nèi)外運(yùn)用基于NGS 技術(shù)的SNP 連鎖方法對(duì)ARPKD家系進(jìn)行PGT 的報(bào)道較少，本研究在明確PKHD1基因致病突變的情況下，應(yīng)用NGS 對(duì)胚胎行SNP連鎖分析，活產(chǎn)一健康嬰兒，阻斷單基因病在家系中的垂直傳遞，為患者家庭的優(yōu)生優(yōu)育提供保障。

1 資料與方法

1.1 觀察對(duì)象先證者父親（Ⅰ1）：26 歲，PKHD1基因c.10444C > T（p.R3482C），表型正常，既往體健。先證者母親（Ⅰ2）：26 歲，PKHD1 基因c.4303del（p.S1435Vfs*25）（圖1），表型正常，既往體健，G1P0A1，多囊腎胎兒（先證者Ⅱ1）引產(chǎn)史，攜帶父母雙方PKHD1 基因突變，其中c.4303del突變?yōu)槭状螆?bào)道突變。為了避免再次妊娠患兒，這對(duì)夫婦于2021 年8 月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心經(jīng)過(guò)遺傳咨詢后，要求接受試管嬰兒+ 單基因病檢測(cè)（PGT for monogenic gene defects， PGT-M）+ 非整倍體檢測(cè)（PGT for aneuploidies， PGT-A）。已向這對(duì)夫婦充分解釋PGT過(guò)程及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，獲得其完全知情同意。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2017002）。

圖1 先證者PKHD1 基因c.10444C > T（父源）和c.4303del（母源）突變Sanger 測(cè)序圖Fig.1 Sanger sequencing diagram of c.10444C > T （paternal origin） and c.4303del （maternal origin） mutations in the proband's PKHD1 gene

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建先證者和父母雙方SNP 單體型提取引產(chǎn)胎兒皮膚組織和男女雙方外周血DNA，在突變位點(diǎn)兩側(cè)2M 區(qū)域內(nèi)選擇若干信息豐富、緊密連鎖的SNP，提交給Ion AmpliSeq Designer 網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。經(jīng)多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification， MDA）、多重PCR、純化、建庫(kù)、富集后，采用NGS 測(cè)序、選擇有效SNPs 來(lái)建立SNP 單倍型。

1.2.2 胚胎培養(yǎng)、活檢及囊胚玻璃化冷凍黃體期長(zhǎng)方案促排卵后，采用卵胞漿內(nèi)單精子注射方式進(jìn)行授精，受精后繼續(xù)培養(yǎng)至第5 天或第6 天，待囊胚形成后在激光輔助下取大約5～10 個(gè)滋養(yǎng)外胚層（TE）細(xì)胞進(jìn)行活檢?；顧z的囊胚單管單枚玻璃化冷凍處理，編號(hào)。

1.2.3 PGT-M 與PGT-A 聯(lián)合診斷對(duì)活檢細(xì)胞進(jìn)行多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification， MDA）、多重PCR、純化、建庫(kù)、富集后，采用Sanger 測(cè)序直接檢測(cè)PKHD1 基因突變和基于NGS的SNP 連鎖分析鑒別攜帶突變的染色體兩種方法進(jìn)行PGT-M，同時(shí)進(jìn)行拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV）分析以進(jìn)行低深度的PGT-A。

1.2.4 FET 和隨訪評(píng)估使用自然周期來(lái)準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜進(jìn)行胚胎解凍移植（frozen-thawed embryo transfer， FET）。生化妊娠在移植后14 d 查血人絨毛膜促性腺激素（hCG）確定；移植后4 周行經(jīng)陰道B 超查看孕囊確定宮內(nèi)妊娠，移植后6～8 周經(jīng)陰道B 超查看胎心排除胎停，孕18～24 周時(shí)行羊膜腔穿刺術(shù)獲得胎兒DNA 行Sanger 測(cè)序驗(yàn)證PGT結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 先證者父母和先證者的SNP 單倍型選擇突變位點(diǎn)兩側(cè)2M 區(qū)域內(nèi)的335 個(gè)信息豐富的SNP成功構(gòu)建先證者及其父母的SNP 單倍型，區(qū)別確認(rèn)了父母的正常及風(fēng)險(xiǎn)染色體。

2.2 體外受精結(jié)果獲卵數(shù)20 枚，MII 數(shù)19 枚，受精數(shù)17 枚，卵裂17 枚，其中雙原核受精數(shù)16 枚，2PN 卵裂數(shù)16 枚。

2.3 植入前遺傳學(xué)檢測(cè)將培養(yǎng)第5 天后第6 天得到的優(yōu)質(zhì)囊胚分別標(biāo)記為D501、D601、D602、D603、D604 和D605，行TE 活檢。PGT 結(jié)果顯示，6 個(gè)胚胎中，D601、D603、D604、D605 未檢測(cè)到突變且為整倍體胚胎，D501 攜帶PKHD1 基因c.4303del突變（雜合子）且6 號(hào)染色體三體嵌合，D602 測(cè)序數(shù)據(jù)波動(dòng)大，無(wú)法判斷。

2.4 FET 結(jié)果選擇1 枚未檢測(cè)到突變的優(yōu)質(zhì)整倍體胚胎進(jìn)行凍融胚胎移植（D601），在第3 個(gè)月經(jīng)周期行單囊胚解凍移植。移植14 d 后外周血hCG 陽(yáng)性，移植40 d 后經(jīng)陰道超聲見(jiàn)單個(gè)孕囊，大小為43 mm × 40 mm，胚芽長(zhǎng)21.9 mm，可見(jiàn)心管搏動(dòng)。孕18 周經(jīng)羊膜腔穿刺獲得胎兒DNA，Sanger 測(cè)序未檢測(cè)到PKHD1 基因c.10444C > T 和c.4303del 突變，證實(shí)了PGT 結(jié)果。孕38+2周順產(chǎn)一正常男嬰，體質(zhì)量3.05 kg，健康狀況良好。

3 討論

臨床較常見(jiàn)的遺傳性腎病是ADPKD，患病率約1/1 000，主要由PKD1 或者PKD2 基因突變引起［5］。而本研究中為常染色體隱性多囊腎病，是由PKHD1基因突變或DZIP1L 基因突變導(dǎo)致的常染色體隱形遺傳病，發(fā)病率僅為1∶10 000～1∶40 000，要罕見(jiàn)的多。致病基因PKHD1 位于第6 號(hào)染色體6p21.1-p12，長(zhǎng)約472 kb，編碼蛋白為4 047 個(gè)氨基酸的纖囊素（fibrocystin/polyductin， FPC）。FPC 缺陷可引起纖毛功能紊亂、腎小球囊內(nèi)上皮細(xì)胞異常增殖和轉(zhuǎn)運(yùn)異常，最終導(dǎo)致腎小管、膽管囊性擴(kuò)張及纖維化［6-7］。

ARPKD 大多發(fā)病早且嚴(yán)重，胎兒期即可出現(xiàn)雙側(cè)腎臟增大、皮髓質(zhì)分化差、微小囊腫形成、肺功能發(fā)育不全，可導(dǎo)致30%～50%的新生兒死亡。新生兒期存活的患兒可相繼出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂、代謝性酸中毒及高血壓等腎小管功能異常的癥狀，并隨年齡增長(zhǎng)進(jìn)行性惡化，最終進(jìn)展至ESRD，并伴有肝纖維化進(jìn)行性加重，導(dǎo)致門脈高壓，預(yù)后較差，成年患者罕見(jiàn)［3-10］。

PKHD1 具有復(fù)雜的基因型-表型相關(guān)性，其大尺寸、復(fù)雜的剪接模式和轉(zhuǎn)錄譜、廣泛的等位基因異質(zhì)性、大量錯(cuò)義突變和新突變以及我們對(duì)蛋白質(zhì)功能的有限理解為建立PKHD1 的基因型-表型相關(guān)性帶來(lái)了挑戰(zhàn)。鑒于這些挑戰(zhàn)，基因型-表型相關(guān)性側(cè)重于突變的類型，而不是突變的特定位點(diǎn)［11］。幾乎所有攜帶兩個(gè)截?cái)嗤蛔兊幕颊叨硷@示出嚴(yán)重的表型和新生兒期死亡。在新生兒期存活的患者通常至少有一個(gè)錯(cuò)義突變，但是反過(guò)來(lái)，一些錯(cuò)義變化可能和截?cái)嗤蛔円粯泳哂衅茐男裕?2］。

PKHD1 基因以編碼區(qū)的點(diǎn)突變致病為主［13］，目前，HGMD（www.hgmd.cf.ac.uk）中報(bào)道的PKHD1突變種類已達(dá)911 種，其中約65.75%為錯(cuò)義/無(wú)義突變，15.26%為小片段缺失，4.10%為小片段插入，1.20%為小片段插入缺失，3.62%為大片段缺失，0.04%為大片段插入，0.02%為復(fù)合突變，其中c.107C > T（p.Thr36Met）是最常見(jiàn)的突變。本研究中先證者攜帶的PKHD1 基因c.4303del（p.S1435Vfs*25）突變?yōu)槭状螆?bào)道，該變異為截?cái)嗤蛔?，根?jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南，提示為致病突變位點(diǎn)，該突變的發(fā)現(xiàn)豐富了PKHD1基因的突變數(shù)據(jù)庫(kù)，針對(duì)該突變行PGT，亦為首次。

7 例由纖毛相關(guān)基因DZIP1L 突變導(dǎo)致的ARPKD患者在2017年由LU等在4個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的家族中首次發(fā)現(xiàn)。DZIP1L 位于3 號(hào)染色體（3q22.1-q23），具有16 個(gè)外顯子，編碼767 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，定位于纖毛過(guò)渡區(qū)，負(fù)責(zé)將基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到睫狀軸突［2］。與PKHD1 突變相比，DZIP1L 突變是ARPKD 的罕見(jiàn)原因，且迄今為止描述的DZIP1L 突變患者的臨床病程總是中等的，沒(méi)有一個(gè)顯示圍產(chǎn)期死亡。

正常人群中PKHD1 突變雜合子攜帶率約為1/70，攜帶者夫妻每次妊娠的孩子有25%的風(fēng)險(xiǎn)患病，50%的風(fēng)險(xiǎn)攜帶致病基因。胎兒腎臟異常在妊娠中晚期才能通過(guò)超聲檢查發(fā)現(xiàn)［14-16］。對(duì)于ARPKD 高風(fēng)險(xiǎn)家庭，基因診斷是金標(biāo)準(zhǔn)。常規(guī)產(chǎn)前診斷方法通常在孕中期行羊水穿刺進(jìn)行診斷，若發(fā)現(xiàn)胎兒為ARPKD，則孕婦會(huì)面臨治療性引產(chǎn)帶來(lái)的身心傷害。而PGT 在胚胎植入前進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，是一種更早期的產(chǎn)前診斷方法，可以避免因妊娠ARPKD 胚胎或非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)，可以阻斷PKHD1 突變基因在該家系中的垂直傳遞。因此，PGT 與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)［13，16］。

等位基因脫扣（ADO）是可能導(dǎo)致PGT-M 誤診、可移植胚胎數(shù)目減少的重要問(wèn)題［17］。ADO 是由等位基因不等擴(kuò)增引起的某些等位基因未檢測(cè)到，是單細(xì)胞PCR 的固有缺陷。PKHD1 較大且ARPKD 相關(guān)變異數(shù)量眾多，直接測(cè)序漏診率很高，需要更靈敏的檢測(cè)方法降低ADO 率［18］。SNPs指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多樣性，在群體中的頻率> 1%。SNP 連鎖分析方法間接診斷胚胎基因型方法如下：通過(guò)NGS 或芯片檢測(cè)父母和胚胎的目標(biāo)基因上下游1-2M 內(nèi)SNPs 作為遺傳標(biāo)記，在家系中構(gòu)建單倍型，再通過(guò)檢測(cè)胚胎是否攜帶風(fēng)險(xiǎn)單體型來(lái)判斷胚胎是否攜帶基因突變。由于采用SNP 作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建了單體型，對(duì)胚胎進(jìn)行基因檢測(cè)時(shí)，可檢測(cè)位點(diǎn)大大增加，且NGS 具有高通量、高覆蓋率和高靈敏度的特征，所以相比于傳統(tǒng)的通過(guò)PCR 方法直接檢測(cè)突變或STR 連鎖分析，基于NGS 的SNP 連鎖分析具有更高的檢測(cè)效率、更低的等位基因脫扣率、更確定的基因型-表型相關(guān)性［19-21］。作為遺傳標(biāo)記，SNP 與STR 相比，有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）SNP 是二態(tài)性的，只需+/-的分析，適于快速、規(guī)?；Y查；（2）SNP 數(shù)量更大、分布更廣泛；（3）SNP更穩(wěn)定；（4）部分SNP 本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)；（5）與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，SNP 芯片具有廉價(jià)、快速的優(yōu)點(diǎn)；（6）SNP 連鎖分析可以直接對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)基因型和單體型的同時(shí)診斷［22-23］。本研究中通過(guò)連鎖分析方法，在突變位點(diǎn)兩側(cè)2M 區(qū)域內(nèi)選擇335 個(gè)信息豐富、緊密連鎖的SNP 位點(diǎn)作為遺傳連鎖標(biāo)記，成功構(gòu)建先證者父母的單體型，說(shuō)明該方法是安全有效的，減少了因等位基因脫扣導(dǎo)致的誤診［13］。有1 枚胚胎未獲明確診斷，主要考慮是活檢細(xì)胞數(shù)目偏少，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

SNP 連鎖分析的局限性在于需要完整家系來(lái)構(gòu)建家系單體型來(lái)進(jìn)行診斷，在無(wú)法獲取先證者DNA 的情況下，SNP 單體型方法無(wú)法奏效。在發(fā)生減數(shù)分裂重組的情況下，SNP 單體型分析也有可能存在無(wú)法診斷的情況。若患者卵巢功能較差，無(wú)法獲取足夠卵子和胚胎，患者行PGT 的成功率會(huì)大大降低。本研究中，無(wú)上述情況，可進(jìn)行常規(guī)SNP 連鎖分析。在一些特殊情況下，如沒(méi)有患兒DNA 保存，可嘗試通過(guò)致病胚胎極體或單精子構(gòu)建家系單體型［24］。也可以通過(guò)三代長(zhǎng)讀測(cè)序，直接尋找患者SNP 位點(diǎn)，而不依賴于家系成員［25］。

綜上所述，本研究應(yīng)用基于NGS 的SNP 連鎖分析技術(shù)，成功對(duì)ARPKD 家系進(jìn)行了準(zhǔn)確、高效的PGT-M，降低了等位基因脫扣導(dǎo)致的PGT-M 誤診率，避免了因選擇患病或非整倍體胚胎而導(dǎo)致的流產(chǎn)問(wèn)題，阻斷了ARPKD 在該家系中的垂直傳遞，為未來(lái)預(yù)防ARPKD 出生缺陷的提供了參考，并且發(fā)現(xiàn)了PKHD1 基因的一個(gè)新突變，豐富了ARPKD 的突變數(shù)據(jù)庫(kù)。

【Author contributions】WANG Ning performed the experiments and wrote the manuscript.HAO Yan performed the experiments and helped to revise the manuscript.CHEN Dawei， ZHANG Zhiguo，KUANG Dan， ZHANG Qing and YING Yiqi helped to recruit the patients.WEI Zhaolian， ZHOU Ping and CAO Yunxia analysed the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.