肖凌 高春蕾 郭偉 王寧 張萱 劉明

1衡水市人民醫(yī)院呼吸與危重癥科（河北衡水 053000）；河北省中醫(yī)院 2呼吸與危重癥科， 3呼吸二科（石家莊 050011）

急性肺損傷（acute lung injury， ALI）是一種由肺內外各致病因素導致的急性肺組織細胞損傷，以肺部浸潤、低氧血癥和水腫為主要臨床表現(xiàn)，在世界范圍內具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。ALI若不及時干預，會進一步發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress， ARDS），引起心、腎等多組織器官功能障礙［2］，這也是造成重癥監(jiān)護中患者死亡的重要因素。目前臨床上還沒有確切的ALI 治療方案。治療控制原發(fā)病，遏制其誘導的全身失控性炎癥反應，是預防和治療ALI 的必要措施［3］。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子κB（NF-κB）是參與調節(jié)炎癥相關疾病發(fā)病機制的關鍵信號通路［4-5］。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷后，MAPKs、ERK、JNK 和p38 均參與了肺中信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）的激活。也有研究［7］表明，NF-κB 的激活可以促進促炎癥細胞因子的產(chǎn)生，而這些細胞因子又可以反過來激活NF-κB，從而放大炎癥信號。而MAPK 是啟動NF-κB 激活的經(jīng)典途徑［8］。此外，MAPK-NF-kB 的激活可促進TNF-α、IL-1β 和IL-6 的生成。研究［9］表明，抑制MAPK/NF-κB 通路的激活可改善肺部損傷，降低脂多糖（LPS）誘導的ALI 小鼠的死亡率。黨參是桔?？浦参稂h參、川黨參和素花黨參的干燥根，是我國傳統(tǒng)的補益藥物。現(xiàn)代藥理學研究表明，黨參具有抗氧化和改善機體免疫的作用，而黨參多糖和黨參皂苷是其主要有效成分，在機體的免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎、抗癌/抗腫瘤和調節(jié)腸道菌群方面起著重要作用［10-14］。但在LPS 誘導的ALI 中，黨參多糖是否可以通過MAPK/NF-κB 信號通路減輕炎癥反應，發(fā)揮肺功能和肺組織保護作用尚未見相關報道。本研究采用通過LPS 誘導建立ALI小鼠模型，并探討黨參多糖對ALI 小鼠炎癥反應和肺組織的保護作用及其機制，旨在為黨參多糖的藥理作用研究提供數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物清潔級雄性昆明小鼠，6～8 周齡，體質量18～22 g。購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，使用許可證號：SCXK（冀）2020-002，倫理委員會批準（編號：IACUC-Hebmu-P-2022019）。實驗動物飼養(yǎng)于恒溫恒濕，明暗各12 h 的清潔動物房內，飼養(yǎng)條件及飼養(yǎng)流程均符合《實驗動物管理條例》。

1.1.2 試劑和設備大腸桿菌脂多糖（批號L2880）購自美國Sigma 公司；黨參多糖（純度90%，批號A7863A）購自上海士鋒生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號G1120）和瑞氏-吉姆薩（Giemsa）染液（批號G1020）購自北京索萊寶科技有限公司；地塞米松片（國藥準字H44024469）購自廣東華南藥業(yè)集團有限公司；總蛋白提取試劑盒（批號78510）購自美國Thermofisher 公司；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒IL-1β（批號ab222503）、IL-6（批號ab222503）、MPO（批號ab155458）、TNF-α（批號ab208348）均購自美國Abcam 公司，p-p38 MAPK（批號4511）、p-IκB-α（批號2859）、p-p65（批號3033）兔抗鼠一抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（批號ab205718）購自美國Abcam 公司；酶標儀和垂直電泳儀均購自美國Bio-rad 公司；光學顯微鏡、石蠟切片機和烤片機購自德國Leica 公司；多參數(shù)肺功能檢測系統(tǒng)購自上海玉研科學儀器有限公司；烘箱購自于蘇州德力電熱設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備50 只小鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松組、黨參多糖高劑量組和黨參多糖低劑量組，每組10 只。除對照組以外，其余各組小鼠均通過腹腔注射LPS（10 mg/kg）的方式構建小鼠ALI 模型［15］。黨參多糖高劑量組和低劑量組分別給予300 mg/kg 和150 mg/kg 黨參多糖灌胃，地塞米松組給予5 mg/kg 地塞米松，對照組和模型組均每天給予生理鹽水灌胃。建模12 h 后，取2 只模型組小鼠，光鏡下觀察其肺組織病理形態(tài)學變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺組織下葉明顯肺泡水腫、出血及大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，表示造模成功。

1.2.2 小鼠肺功能檢測將各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥（50 mg/kg）深度麻醉，固定于小動物手術臺上，取仰臥位分離暴露氣管后在頸部正中將氣管切開，插入氣管插管后縫合固定。多參數(shù)肺功能檢測系統(tǒng)測定小鼠0.3 s 用力呼氣量（forced expiratory volume in 0.3 second，F(xiàn)EV0.3），用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）以及FEV0.3/FVC。

1.2.3 小鼠肺組織干濕重比（W/D）及肺組織病理學觀察小鼠腹腔注射1%戊巴比妥后，頸椎脫臼法處死，剪開小鼠頸部及胸腔，完整分離氣管及肺組織。切除氣管后，取右肺中葉，稱濕重后放置于培養(yǎng)皿中，60 ℃烘箱內烘干24 h 后稱干肺重，計算肺組織W/D；取右肺下葉10%福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片后，顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.2.4 小鼠肺泡灌洗液中炎性細胞分類和計數(shù)將小鼠處死后，打開胸腔，結扎右肺支氣管，將預冷生理鹽水緩慢注入小鼠左側肺泡內灌洗3 次，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）。1 500 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清后1 mL 生理鹽水重懸細胞，取20 μL 細胞懸液進行細胞涂片，涂片晾干后行Giemsa 染液染色，待玻片晾干后，光學顯微鏡下進行白細胞分類和計數(shù)。

1.2.5 小鼠BALF 和血漿中IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平檢測將小鼠BALF 在4 ℃下3 000g離心10 min，取上清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。并采用眼眶取血? 500 r/min 離心15 min，分離血漿。BALF和血漿均使用ELISA 試劑盒，按照說明書方法，檢測IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平。

1.2.6 小鼠肺組織p-p38 MAPK、p-IκB-α、p-p65的蛋白表達水平檢測取小鼠右肺下葉組織，研磨勻漿后，使用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測組織蛋白濃度。10% SDS-PAGE 凝膠電泳后，將分離蛋白轉至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后，磷酸緩沖液（TBST）洗膜。加入抗p-p38 MAPK、p-IκB-α、p-p65、β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 遍后，加入HRP 標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3遍，ECL顯影液顯色。凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計算灰度值，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達量。

1.2.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般體征對照組小鼠活動和食欲正常，無扎堆情況。模型各組小鼠逐漸呼吸異常，身體發(fā)顫，扎堆聚集。模型組與各治療組均有1 只小鼠死亡，造模成功率為90%。

2.2 小鼠肺功能檢測小鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC 檢測結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC 值顯著降低（P＜ 0.05）；給予黨參多糖后，小鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC 值均有不同程度升高（P＜ 0.05）。見圖1。

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與地塞米松組比較，^P ＜ 0.05，^^P ＜ 0.01圖1 黨參多糖對小鼠肺功能指標的影響Fig.1 Effect of Codonopsis polysaccharide on lung function indexes in mice

2.3 小鼠肺組織W/D 檢測與對照組比較，模型組小鼠肺組織W/D 水平顯著升高（P＜ 0.05）；給予黨參多糖后，小鼠W/D水平均顯著降低（P＜ 0.05）。見圖2。

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01；與地塞米松組比較，^P ＜ 0.05，^^P ＜ 0.01圖2 黨參多糖對各組小鼠肺組織W/D 的影響Fig.2 Effect of Codonopsis polysaccharide on wet mass/dry mass in lung tissue of mice in each group

2.4 小鼠肺組織病理學觀察對照組小鼠肺組織上皮細胞形態(tài)正常，無明顯病理學改變；與對照組比較，模型組小鼠肺泡上皮細胞增生，肺泡隔明顯增厚，間質見大量炎性細胞浸潤，以核呈桿狀的中性粒細胞為主；黨參多糖高劑量組肺泡上皮細胞較為正常，間質見少量炎性細胞浸潤；黨參多糖低劑量組部分肺泡上皮細胞增生，肺泡隔有所增厚，間質見較多炎性細胞浸潤。見圖3。

2.5 小鼠BALF 炎性細胞分類和計數(shù)與對照組比較，模型組小鼠BALF 中性粒細胞和淋巴細胞均明顯升高（P＜ 0.05）；給予黨參多糖后，小鼠中性粒細胞均顯著降低，黨參多糖高劑量組淋巴細胞顯著降低（P＜ 0.05）。見圖4。

注：與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與地塞米松組比較，^P ＜ 0.05，^^P ＜ 0.01圖4 黨參多糖對小鼠BALF 炎性細胞數(shù)量及分類的影響Fig.4 Effect of Codonopsis polysaccharide on number and classification of inflammatory cells in BALF of mice

2.6 小鼠BALF 中IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平檢測與對照組比較，模型組小鼠BALF 中IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平顯著升高（P＜ 0.05）；給予黨參多糖后，小鼠IL-1β、IL-6、髓過氧化物酶（MPO）、TNF-α水平顯著降低（P＜ 0.05）。見圖5。

注：ELISA 法檢測BALF 中IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平。與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01；與地塞米松組比較，^P ＜ 0.05，^^P ＜ 0.01圖5 黨參多糖對小鼠BALF 中IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平的影響Fig.5 Effect of Codonopsis polysaccharide on the levels of IL-1β， IL-6， MPO and TNF-α in BALF of mice

2.7 小鼠血漿IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平檢測與對照組比較，模型組小鼠血漿IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平顯著升高（P＜ 0.01）；給予黨參多糖后，其IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平顯著降低（P＜ 0.01）。見圖6。

注：ELISA 法檢測血漿IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平。與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01圖6 黨參多糖對小鼠血漿中IL-1β、IL-6、MPO、TNF-α 水平的影響Fig.6 Effect of Codonopsis polysaccharide on the levels of IL-1β， IL-6， MPO and TNF-α in plasma of mice

2.8 小鼠肺組織p-p38 MAPK、p-IκB-α、p-p65 的蛋白表達水平檢測與對照組比較，模型組小鼠肺組織p-p38 MAPK、p-IκB-α、p-p65 蛋白水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；給予黨參多糖后，小鼠p-p38 MAPK、p-IκB-α、p-p65 蛋白水平均降低，其中地塞米松組和黨參多糖高劑量組p-p38 MAPK、p-IκB-α、p-p65 蛋白，以及黨參多糖低劑量組p-p38 MAPK 蛋白相對表達差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖7。

注：Western blot 法檢測p-p38 MAPK、p-IκB-α 和p-p65 蛋白表達水平。與對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01；與地塞米松組比較，^P ＜ 0.05，^^P ＜ 0.01圖7 黨參多糖對小鼠肺組織p-p38 MAPK、p-IκB-α 和p-p65 蛋白相對表達水平的影響Fig.7 Effect of Codonopsis polysaccharide on expression levels of p-p38 MAPK、p-IκB-α and p-p65 in lung tissue of mice

3 討論

ALI 是一類非心源性的全身性炎癥反應引起的肺部疾病。LPS 是革蘭氏陰性菌的外膜成分，是ALI 發(fā)病最常見的原因。當LPS 刺激機體時，可激活體內巨噬細胞，導致大量炎癥因子產(chǎn)生，并誘導中性粒細胞在肺間質和肺泡內聚集，從而導致血管充血、肺水腫、肺泡萎縮等一系列肺組織損傷。ALI 主要分為三個階段：急性期（肺組織積液，肺水腫現(xiàn)象），增生期和纖維化期［16］。在ALI早期，中性粒細胞和巨噬細胞聚集在肺部，產(chǎn)生大量炎癥信號，導致肺水腫以及肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的損傷［17-18］。ALI 患者病情進展迅速，患者往往因為體內的“炎癥因子風暴”導致多器官受損和功能衰竭［19-20］。本研究采用腹腔注射LPS的方法建立ALI 模型，模擬了ALI 發(fā)生的病理過程。病理結果發(fā)現(xiàn)，ALI 模型黨參多糖組小鼠肺組織肺泡上皮細胞增生，肺泡隔明顯增厚，以中性粒細胞為主的大量炎性細胞浸潤。這與ALI 病理改變一致，提示成功構建了ALI 模型。

中性粒細胞是LPS 誘導的肺部炎癥反應中最重要的細胞之一，MPO 水平是中性粒細胞浸潤組織的有效衡量指標。本研究結果顯示，造模后小鼠BALF 中性粒細胞、淋巴細胞以及MPO 水平明顯升高，而給予黨參多糖后，高劑量黨參多糖組小鼠中性粒細胞和淋巴細胞以及低劑量黨參多糖組小鼠中性粒細胞水平明顯降低。同時，造模后小鼠BALF 中水平明顯升高，給予黨參多糖后，其水平明顯降低。提示黨參多糖能降低急性肺損傷小鼠BALF 的中性粒細胞和淋巴細胞水平，緩解中性粒細胞對肺組織的浸潤程度，不同程度緩解肺泡上皮細胞的增生。同時，肺功能檢測發(fā)現(xiàn)，ALI 模型小鼠肺功能明顯降低，給予黨參多糖后，肺功能不同程度地好轉。證明黨參多糖可改善急性肺損傷小鼠肺功能。

當肺泡-毛細血管屏障的完整性被破壞時，表現(xiàn)為肺水腫。而肺組織W/D 增高是肺組織水腫的重要表征［21-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，ALI 模型小鼠W/D 水平明顯升高，給予黨參多糖后，其水平明顯降低。提示黨參多糖可緩解急性肺損傷小鼠肺水腫。

MAPK 家族是一類高度保守的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、增殖和分化中起著重要作用，并通過不同途徑形成相應的傳導通路，發(fā)揮不同的生物學效應。其中，p38MAPK 是介導細胞生長、發(fā)育、分裂和死亡的應激蛋白激酶，可對不同環(huán)境應激和炎癥細胞因子的刺激做出反應，并與TNF-α 的產(chǎn)生密切相關［24］。而TNF-α 是ALI 發(fā)病學研究的焦點，在肺泡毛細血管屏障的損傷中起著重要作用［25］。NF-κB 是位于Toll 樣受體信號通路下游的關鍵轉錄因子。當炎癥或免疫反應發(fā)生時，活化的IκB-α 被磷酸化后，使NF-κB/p65 移位到細胞核，結合炎癥相關基因，從而刺激促炎癥介質的釋放［26］。多項研究［27-28］表明，NF-κB 參與了LPS 誘導的ALI，并與TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎癥因子的產(chǎn)生有關。這些炎癥因子除了作用于炎癥通路，進一步促進炎癥因子的分泌以外，還能直接損傷血管內皮細胞和肺泡上皮細胞等功能細胞，損傷肺泡原毛細血管屏障，增加肺泡-血管屏障通透性，降低肺順應性和肺功能［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 誘導ALI 后，小鼠BALF 和血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平明顯升高，肺組織p-p38 MAPK、p-IκB-α 和p-p65 蛋白相對表達明顯增加。而給予黨參多糖后，黨參多糖組小鼠BALF 和血漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均明顯降低。同時，高劑量黨參多糖組小鼠p-p38 MAPK、p-IκB-α 和p-p65 蛋白和低劑量黨參多糖組小鼠p-p38 MAPK 蛋白相對表達明顯降低，提示ALI 模型小鼠肺組織功能產(chǎn)生障礙，而黨參多糖可對抗這些作用。因此，認為黨參多糖能發(fā)揮肺組織的保護作用可能是通過抑制MAPK/NF-κB 信號通路的激活來完成的。

綜上所述，黨參多糖可減輕LPS 誘導的ALI 模型小鼠的炎癥反應，降低炎癥細胞對肺組織的浸潤，減輕肺水腫，改善肺功能，可能是通過抑制MAPK/NF-κB 信號通路的激活來完成的。本研究初步探索了黨參多糖在ALI 中的抗炎及肺組織保護作用，為黨參多糖治療LPS 誘導的ALI 提供理論依據(jù)。但本研究還存在一定的局限性，僅涉及全身給藥引起的ALI，后續(xù)本課題組還將繼續(xù)完善其他給藥方式引起的ALI 及其機制研究，為不同病因ALI 的治療和藥物研發(fā)提供進一步研究數(shù)據(jù)。

【Author contributions】GAO Chunlei， GUO Wei and WANG Ning performed the experiments and wrote the article.XIAO Ling performed the experiments.XIAO Ling and ZHANG Xuan revised the article.LIU Ming designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.