肖俐 羅淑敏 徐芳 路鵬鵬 邢恩鴻 李偉華

1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北省泛血管疾病重點實驗室 （河北承德 067000）；2首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院肝病研究所 （北京 100069）

樹突狀細胞（dendritic cell， DC）是機體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC），其可通過MHC 分子呈遞抗原肽誘導初始T 細胞激活和分化，在機體免疫過程中發(fā)揮著重要作用［1-3］。近些年研究［4-5］表明，樹突狀細胞來源的外泌體（dendritic cell-derived exosomes， DEX）因其攜帶有親代DC 大量特征性蛋白，被證實也具有抗原提呈的作用。目前關(guān)于此方面的研究有很多，但是體外培養(yǎng)時間對DC 及其DEX 免疫相關(guān)膜蛋白的影響，以及DC 與DEX 兩者表達免疫相關(guān)膜蛋白水平是否具有相關(guān)性，至今未見相關(guān)報道。因此本文就不同培養(yǎng)時間，對小鼠DC 及其DEX 表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ水平進行研究，旨在明確不同培養(yǎng)時間點DC 及其DEX功能變化情況，為今后相關(guān)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小鼠C57BL/6 雄性小鼠（H-2b）（6～8 周），購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。所有動物實驗均在首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院肝病研究所動物研究室，按照機構(gòu)倫理委員會授權(quán)和特別批準的程序（許可證號AEEI-2023-151）進行。

1.2 試劑與儀器細胞因子：重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 GM-CSF（Cat：AF-315-03-20UG，Lot：0413AF055，PEPROTECH，美國），腫瘤壞死因子α TNF-α（Cat：AF-315-01A-20UG，Lot：0913AFC5 4，PEPROTECH，美國），白介素4 IL-4（Cat：AF-214-14-20UG，Lot：1118AFC49，PEPROTECH，美國）；流式抗體：APC Human Anti-Mouse CD11c antibody（Cat：550261，Lot：1209238，BD，美國），PE Human Anti-Mouse CD80 antibody（Cat：553769，Lot：2040971，BD，美國）， BV510 Human Anti-Mouse MHC-Ⅰ antibody（Cat：116523，Lot：B388327，Biolegend），APC Human Anti-Mouse MHC-Ⅱ antibody（Cat：FAB6118A，Lot：ABJY0120111，RD，美國），488 Human Anti-Mouse CD81 antibody （Cat：FAB4865G，Lot：1609468，RD，美國）；BCA 試劑盒（Cat：P1511，北京普利萊生物有限公司）。超速離心機（型號：Optima XPN-100，Bcekman Coulter，美國）；Amnis 量化成像分析流式細胞儀（型號：ImageStream Mk Ⅱ，Luminex，美國）；全電動倒置熒光顯微鏡（型號：Ti-E，Nikon，日本）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠骨髓細胞的提取取6～8 周齡C57 BL/6 雄性小鼠，將小鼠脫頸處死后，酒精浸泡消毒3～5 min。剪掉小鼠腿部皮毛層，沿著小鼠股骨根部將大腿剪下。刮刀將小鼠腿部肌肉剝離，取出股骨和脛骨置于裝有1640 培養(yǎng)基的6 孔板中，剪刀剪掉股骨和脛骨兩端，暴露出骨髓腔。1 mL注射器吸取1640 培養(yǎng)基，針頭穿進骨髓腔中，對骨髓腔進行反復(fù)沖洗直到骨髓腔變白。將帶有骨髓細胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至15 mL 離心管中，室溫下500g，離心5 min。得到細胞沉淀后加入1 mL 紅細胞裂解液，混勻后，靜置30 s，隨后加入10 mL 培養(yǎng)液終止裂解，再于500g離心5 min。棄上清，加入3 mL培養(yǎng)液，充分混勻后，靜置10～20 s，吸取上清液至另一新的15 mL 離心管中，500g離心5 min，得到小鼠DC 前體細胞即小鼠骨髓前體-單核細胞。

1.3.2 小鼠樹突狀細胞的培養(yǎng)將上述骨髓前體-單核細胞按密度（每孔1 × 106～3 × 106cells）均勻鋪于6孔板中，每孔加入2 mL 1640完全培養(yǎng)基以及20 μg/mL GM-CSF，20 μg/mL IL-4 誘導分化。于第2 天和第5 天半量換液，同時補足細胞因子GM-CSF、IL-4 各1 μL；第6 天加入20 μg/mL TNF-α刺激為成熟DC。刺激成熟后，每周加2-3 次細胞因子GM-CSF，維持細胞生長。

1.3.3 小鼠樹突狀細胞表面免疫膜蛋白的檢測收集培養(yǎng)第5、8、13、20、25、30 天的小鼠DC，500g，離心5 min，洗滌兩遍，然后轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管。加入Anti-mouse CD11c-APC、Anti-mouse CD80-PE、Antimouse MHC-Ⅰ-BV510、Anti-mouse MHC-Ⅱ-APC 抗體各2.5 μL，冰上避光孵育30 min。洗去未結(jié)合抗體，Amnis 量化流式細胞儀檢測，Amnis 分析系統(tǒng)IDEAS 軟件6.2 版本進行分析。

1.3.4 小鼠樹突狀細胞外泌體的提取收集第5、8、13、20、25、30 天小鼠DC 培養(yǎng)上清，500g離心5 min，去除細胞。取上清，2 000g離心10 min，去除死細胞。取上清，10 000g離心30 min，去除細胞碎片及大囊泡。取上清，轉(zhuǎn)至超速離心管中，加入PBS，110 000g離心70 min，得到小鼠DEX。

1.3.5 Western blot（WB）法鑒定小鼠樹突狀細胞外泌體DEX 裂解后，BCA 法檢測蛋白濃度。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，待兩端條帶明顯分離時，停止電泳。電壓100 V，1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜，加入20 μL 小鼠單克隆抗體CD9、CD63、CD81（1∶500稀釋）于4 ℃過夜孵育。一抗孵育結(jié)束后，洗膜3次。加入50 μL山羊抗鼠IgG二抗（1∶2 000稀釋）37 ℃孵育1 h，再次洗膜3 次后，加入顯影劑顯影。

1.3.6 小鼠樹突狀細胞外泌體表面蛋白的檢測100 μL DEX 回流液中加入Anti-mouse CD81-488、Anti-mouse CD11c-APC、Anti-mouse CD80-PE、Antimouse MHC-Ⅰ-BV510、Anti-mouse MHC-Ⅱ-APC 各2.5 μL，冰上避光孵育30 min。孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)至超速離心管中，加入PBS，110 000g離心70 min，洗去未結(jié)合抗體。Amnis 量化成像流式細胞儀檢測，Amnis 分析系統(tǒng)IDEAS 軟件6.2 版本進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布，均以均數(shù)±標準差表示。SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，LSD-t檢驗進行兩兩比較。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow-derived dendritic cell， BMDC）體外培養(yǎng)生長情況前體-單核細胞即小鼠骨髓前體細胞，細胞胞體較小，細胞形態(tài)近似圓形或橢圓形，處于懸浮狀態(tài)（圖1A）。加入GM-CSF 和IL-4細胞因子后，細胞胞體變大，細胞開始出現(xiàn)聚團生長現(xiàn)象，一部分細胞由懸浮轉(zhuǎn)為貼壁狀態(tài)（圖1B）。第6 天，加入TNF-α 后，細胞開始長出偽足樣小突觸，其形態(tài)多呈現(xiàn)出邊緣不規(guī)則的類圓形，此時60%～70%細胞貼壁（圖1C）；第13 天，細胞突觸數(shù)量和長度增加，呈網(wǎng)絡(luò)狀生長，細胞處于完全貼壁狀態(tài)（圖1D）；第20 天，細胞突觸略縮短，一部分細胞由貼壁轉(zhuǎn)為懸浮狀態(tài)（圖1E）；第25 天，細胞聚團生長現(xiàn)象明顯，胞質(zhì)、胞核清晰可見且體積明顯增大（圖1F）；第30 天，細胞長勢依舊良好，核質(zhì)分明，細胞大小不一（圖1G）。

注：A-G 分別為第0、5、8、13、20、25、30 天時鏡下觀察BMDC 形態(tài)圖（20 ×）圖1 BMDC 體外培養(yǎng)不同時間點細胞形態(tài)圖Fig.1 The morphology of BMDC cultured in vitro at different time points

2.2 不同培養(yǎng)時間點小鼠樹突狀細胞免疫膜蛋白表達情況Amnis 量化成像流式細胞儀檢測到小鼠DC 表面免疫膜蛋白CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達情況（圖2）。結(jié)果顯示：細胞培養(yǎng)第5 天即可檢測出CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達。其中CD80 陽性率為（55.48±4.83）%，CD11c 陽性率為（53.28±9.53）%，MHC-Ⅰ陽性率為（73.13±13.04）%，MHC-Ⅱ陽性率為（55.11 ±13.14）% 。第13 天表達水平達高峰，CD80 陽性率為（97.29±0.63）%，CD11c 陽性率為（92.31 ±1.18）%，MHC-Ⅰ陽性率為（97.91±0.49）%，MHC-Ⅱ陽性率為（97.91±0.49）%，與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，圖3A、B、C）。13 d后CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達水平略有降低，但仍保持在較高水平。第30 天，CD80 陽性率為（78.86±2.72）%，CD11c陽性率為（77.67±2.58）%，MHC-Ⅰ陽性率為（85.56±1.31）%，MHC-Ⅱ陽性率為（81.35±2.05）%（表1）。

表1 不同培養(yǎng)時間點對小鼠DC 表面免疫蛋白陽性表達率的影響Tab.1 The effects of different culture time points on the positive expression rate of immunoprotein of BMDC ±s，%

表1 不同培養(yǎng)時間點對小鼠DC 表面免疫蛋白陽性表達率的影響Tab.1 The effects of different culture time points on the positive expression rate of immunoprotein of BMDC ±s，%

脂蛋白CD80 CD11c MHC-ⅠMHC-Ⅱ數(shù)量6666 5 d 55.48±4.83 53.28±9.53 73.13±13.04 55.11±13.14 8 d 92.66±2.70 76.05±4.50 93.68±2.43 84.29±1.49 13 d 97.29 ± 0.63 92.31±1.18 97.91±0.49 97.91±0.49 20 d 91.80 ± 0.48 91.19±2.03 94.14±1.77 94.06±1.78 25 d 90.42±1.58 88.64±1.74 90.10±0.93 86.55±1.82 30 d 78.86±2.72 77.67±2.58 85.56±1.31 81.35±2.05 F值208.89 61.93 15.53 44.13 P值0.000 1 0.000 1 0.000 1 0.000 1

注：A，Amnis 量化成像流式細胞儀檢測DC 表達CD80、CD11c 熒光圖；B，Amnis 量化成像流式細胞儀檢測DC 表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ熒光圖；C，DC 表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ直方圖（BF：明場）圖2 Amnis 量化成像流式細胞儀檢測小鼠DC 表面免疫蛋白圖Fig.2 Amnis image flow cytometey detected the immunoprotein on the surface of BMDC

注：A，不同培養(yǎng)時間點DC 表達CD80 情況；B，不同培養(yǎng)時間點DC 表達CD11c 情況；C，不同培養(yǎng)時間點DC 表達MHC-Ⅰ情況；D，不同培養(yǎng)時間點DC 表達MHC-Ⅱ情況。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001圖3 不同培養(yǎng)時間點小鼠DC 表面免疫蛋白Fig.3 The immunoprotein of BMDC surface at different culture time points

2.3 小鼠樹突狀細胞外泌體鑒定蛋白印跡（Western blot）檢測到DEX 表面特征性蛋白CD9、CD63和CD81，分別為25、50、22 kDa（圖4A）；Amnis量化成像流式細胞儀檢測到CD9-APC、CD63-405和CD81-488 標記的DEX（圖4B）。

注：A，蛋白質(zhì)印跡法檢測DEX 上CD9、CD63 和CD81 蛋白表達；B，Amnis 量化成像流式細胞儀檢測外泌表面特異性標志物（BF：明場）圖4 Western blot 和Amnis 量化成像流式細胞儀檢測DEX 特異性標志物Fig.4 Western blot and Amnis image flow cytometey detection the markers of exosomes

2.4 不同培養(yǎng)時間點DEX免疫膜蛋白表達情況Amnis 量化成像流式細胞儀檢測到CD81 陽性DEX免疫相關(guān)膜蛋白CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達情況（圖5A、B、C）。結(jié)果顯示：CD81陽性DEX表達CD80、CD11c、和MHC-Ⅱ水平以第5 天表達最高，其中CD80 陽性表達率為（37.96±5.67）%，CD11c 陽性表達率為（49.59±9.22）%，MHC-Ⅱ陽性表達率為（57.67±16.53）%，組間差異有統(tǒng)計學意義（圖6A、B、D，P＜ 0.01）；CD81 陽性DEX 表達MHC-Ⅰ水平以第13天表達最高（圖7C），陽性表達率為（81.30±5.41）%。見表2。

表2 不同培養(yǎng)時間點對小鼠DEX 免疫相關(guān)膜蛋白陽性表達率的影響Tab.2 The effect of different culture time points on the positive expression rate of immune-related membrane proteins in mouse dendritic cell exosomes ±s，%

表2 不同培養(yǎng)時間點對小鼠DEX 免疫相關(guān)膜蛋白陽性表達率的影響Tab.2 The effect of different culture time points on the positive expression rate of immune-related membrane proteins in mouse dendritic cell exosomes ±s，%

脂蛋白CD80 CD11c MHC-ⅠMHC-Ⅱ數(shù)量6666 5 d 37.96±5.67 49.59±9.22 60.83±10.10 57.67±16.53 8 d 26.57±6.71 35.98±8.94 73.46±6.17 55.19±6.12 13 d 20.56±7.39 35.41±10.47 81.30±5.41 28.94±1.76 20 d 10.46±8.26 24.90±8.81 63.32±8.23 22.00±6.70 25 d 18.34±10.97 22.55±21.61 56.85±13.31 16.20±3.31 30 d 15.04±6.10 22.74±10.20 71.84±13.47 16.84±4.09 F值9.49 4.38 5.07 33.20 P值0.000 1 0.004 0.002 0.000 1

注：A，CD81 陽性DEX 表達CD80 和CD11c 熒光圖；B，CD81 陽性DEX 表達MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ熒光圖；C，CD81 陽性DEX 表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ直方圖（BF：明場）圖5 Amnis 量化成像流式細胞儀檢測CD81 陽性DEX 表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ情況Fig.5 Amnis image flow cytometry detected the expression of CD80，CD11c， MHC-Ⅰ and MHC-Ⅱ in CD81 positive exosomes.

注：A，不同培養(yǎng)時間點CD81 陽性DEX 表達CD80 情況；B，不同培養(yǎng)時間點CD81 陽性DEX 表達CD11c 情況；C，不同培養(yǎng)時間點CD81陽性DEX 表達MHC-Ⅰ情況；D，不同培養(yǎng)時間點CD81 陽性DEX 表達MHC-Ⅱ情況。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001圖6 不同培養(yǎng)時間點CD81 陽性DEX 表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ情況Fig.6 The expression of CD80， CD11c， MHC-Ⅰ and MHC-Ⅱ in CD81 positive exosomes at different culture time points

注：A，不同培養(yǎng)時間點DC 和DEX 表達CD80 的變化趨勢；B，不同培養(yǎng)時間點DC 和DEX 表達CD11c 的變化趨勢；C，不同培養(yǎng)時間點DC 和DEX 表達MHC-Ⅰ的變化趨勢；D，不同培養(yǎng)時間點DC 和DEX 表達MHC-Ⅱ的變化趨勢圖7 小鼠DC 及DEX 表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的變化趨勢Fig.7 Amnis image flow cytometry detected the expression of CD80， CD11c， MHC-Ⅰand MHC-Ⅱ in BMDC and DEX at different culture time points

2.5 小鼠樹突狀細胞與其分泌外泌體免疫膜蛋白相關(guān)性小鼠DC 培養(yǎng)第13 天CD80、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達水平最高，隨著培養(yǎng)時間增加，表現(xiàn)出先遞增后下降趨勢；DEX 膜上CD80、CD11c、和MHC-Ⅱ表達水平以第5 天最高，隨培養(yǎng)時間增加，總體呈下降趨勢，MHC-Ⅰ以第13 天表達水平最高（圖7）。結(jié)果提示，DC 與DEX 表達免疫相關(guān)膜蛋白水平趨勢不同，無明顯相關(guān)性。

3 討論

DC 是機體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細胞，主要參與抗原提呈與加工處理，在許多免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［6-7］，而其表面的免疫膜蛋白是發(fā)揮功能的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，小鼠DC 培養(yǎng)至第5 天，約50%以上細胞上表達CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ免疫分子，此時為未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells， imDCs）。imDCs 主要存在于外周組織中，當機體識別到病原微生物入侵時，其直接攝入抗原，抗原吞噬能力較強［8］。加入TNF-α 刺激分化至第13 天，DC 表面免疫膜蛋白表達水平隨著細胞成熟度逐漸增加達到峰值。DC 表面MHC 類分子的表達增加，從而使DC 發(fā)揮強大的抗原呈遞能力［9］。隨著培養(yǎng)時間增加，鏡下觀察成熟DC 數(shù)量逐漸減少，但是DC培養(yǎng)第30 天，Amnis 量化成像流式細胞儀檢測到MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽性表達率均達80%以上，抗原提呈能力依舊較強。

近年來，DC 來源外泌體已成為腫瘤疫苗領(lǐng)域的新星［10］。本研究顯示，DEX 攜帶大量與免疫激活相關(guān)的組織相容性復(fù)合體MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子CD80 和黏附因子等，與文獻報道［11-12］一致。其中CD80、CD11c、和MHC-Ⅱ表達水平以第5 天最高，然后隨培養(yǎng)時間增加，總體呈下降趨勢。體外培養(yǎng)第5 天時，為DC 未成熟狀態(tài)，有研究報道［13］，DC 未成熟時分泌的DEX 蛋白量平均比成熟時高0～0.5 倍，提示DC 未成熟時DEX 上免疫膜蛋白可能比成熟狀態(tài)時高。同時，DC 早期分泌的DEX 膜上一些免疫蛋白表達高，提示在DEX的疫苗或免疫治療實驗中使用DC 早期DEX 可能更有利于抗原提呈，更能激發(fā)機體的免疫反應(yīng)。

外泌體是由細胞分泌的，它可攜帶分泌細胞的一些生物學分子，為了進一步明確DC 及其分泌的DEX 表面免疫膜蛋白的相關(guān)性，我們分析了DC表面CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ表達水平與DEX 上CD80、CD11c、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達水平，結(jié)果顯示，兩者表達水平未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。原因可能是外泌體雖然由細胞分泌，但其攜帶的生物學分子需要經(jīng)過細胞內(nèi)的分選機制進行分選，然后包裝到外泌體分泌出細胞外，因此，外泌體膜上攜帶的蛋白不一定與分泌細胞上的膜蛋白保持一致。

以DC 和DEX 為主的免疫治療在未來有著廣闊的應(yīng)用前景，提高體外培養(yǎng)DC 以及DEX 的質(zhì)量，保持其較強的抗原提呈能力，對當前研究和應(yīng)用具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的小鼠DC 高表達免疫相關(guān)的膜蛋白，在一定時間內(nèi)可穩(wěn)定維持。其分泌的DEX 也攜帶有豐富的免疫相關(guān)膜蛋白，但DC 與DEX 表面的免疫相關(guān)蛋白未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。

【Author contributions】XIAO Li performed the experiments and wrote the article.LUO Shumin analyzed the data.XU Fang and LU Pengpeng collected information and helped the experiments.XING Enhong revised the article.LI Weihua designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.