楊貞 江少如 陳小燕 陳曉琳 鄧偉民 郭新宇

1揭陽市人民醫(yī)院（廣東揭陽 522000）；2中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（廣州 510010）；3前海人壽廣州總醫(yī)院（廣州 511325）

作為體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer， IVF-ET）的重要環(huán)節(jié)，控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation， COH）的應用促使多個卵泡同時發(fā)育。已有研究證實COH 的過程中，促性腺激素釋放激素激動劑、促性腺激素的使用，可能破壞卵細胞遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和核質(zhì)成熟的同步性，影響卵細胞發(fā)育，降低胚胎質(zhì)量、著床率和妊娠率［1-2］。因此，如何提高卵泡及胚胎質(zhì)量一直是生殖醫(yī)學領(lǐng)域的重點關(guān)注問題和研究熱點。

本課題組前期的臨床研究證實，具有益氣血作用的經(jīng)后增殖方能提高IVF-ET 中胚胎移植成功率和妊娠率［3］，隨后的動物實驗研究證實經(jīng)后增殖方能降低COH 大鼠卵巢組織中促凋亡蛋白Bim 的表達，提高生長分化因子9（growth differentiation factor 9， GDF9）基因和蛋白的表達，促進卵泡發(fā)育［4］。但經(jīng)后增殖方通過哪些與細胞增殖和凋亡有關(guān)的通路實現(xiàn)上述作用尚不清楚。本研究擬通過對p38MAPK 和NF-κB 信號通路相關(guān)因子表達的檢測，觀察經(jīng)后增殖方對COH 大鼠卵巢GDF9 分泌及顆粒細胞（granulosa cells，GCs）凋亡的影響，探討其作用機制，完善益氣血法經(jīng)后增殖方應用于IVF-ET 的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雌性大鼠18只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量180～220 g，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2021-0041，飼養(yǎng)于SPF 實驗室，光照12 h 晝夜交替，自由取水和攝食，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗，以陰道脫落細胞涂片檢查動情周期。動物實驗方案已獲得醫(yī)院倫理委員會批準，批準編號：201903。實驗遵照《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》（國科發(fā)財字〔2006〕398 號）。

1.2 藥品醋酸曲普瑞林（GnRHa，瑞士輝凌，批號：S11775A），孕馬血清促性腺激素（PMSG，北京索萊寶，批號：601Q021），人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠藥業(yè)，批號：201202），經(jīng)后增殖方（顆粒劑，10 g/袋，相當于生藥：黨參15 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、甘草6 g、熟地黃12 g、白芍12 g、當歸6 g、川芎6 g、菟絲子15 g、鹿角霜20 g、杜仲15 g、山萸肉10 g、川椒3 g。廣東一方制藥，批號：J2001003）。

1.3 主要試劑及儀器逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo，貨號：K1622），熒光定量PCR 檢測試劑盒（美國Genecopoeia，貨號：AOPR-1200），BCA法蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物，貨號：KGPBCA），HRP標記的GAPDH優(yōu)質(zhì)內(nèi)參（上?？党缮?，貨號：KC-5G5），Anti-GDF9抗體（英國abcam，貨號：ab93892），Anti-p38（phospho T180+Y182）抗體（英國abcam，貨號：ab4822），Anti-NF-κB p65 抗體（英國abcam，貨號：ab140751），Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），Mouse/Human ads-HRP（美國Southern Biotech，貨號：4050-05），Tunel試劑盒（美國Promega，貨號：G3250）。

熒光定量PCR 儀（美國ABI，型號：7500），酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific，型號：multiscan MK3），垂直電泳槽（上海天能，型號：VE180），轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能，型號：VE186），電泳儀（北京百晶生物，型號：BG-Power 600i），倒置熒光顯微鏡（德國Leica，型號：DMI6000B）。

1.4 造模及干預方法18 只雌性SD 大鼠隨機分為3 組：自然排卵（natural ovulation， NO）組（NO組）、COH 組、COH+經(jīng)后增殖方（Jinghou Zengzhi Granules， JHZZG）組（COH + JHZZG 組）。陰道涂片為動情周期第3 天時，COH + JHZZG 組大鼠每天上午9 時給予JHZZG 4.5 g/kg 灌胃，給藥濃度0.33 g/mL，連續(xù)9 d；同時于每天上午9 時腹腔注射GnRHa 2.0 μg/100 g，給藥濃度為20 μg/mL，連續(xù)7 d，第7天同時注射PMSG 40 IU/100 g，給藥濃度為400 IU/mL，48 h 后注射HCG 100 IU/100 g，給藥濃度為1 000 IU/mL，2 h后處死；COH組等體積生理鹽水灌胃，腹腔注射同COH + JHZZG 組。NO 組等體積生理鹽水灌胃及腹腔注射，陰道涂片，進入動情期后處死。3組大鼠處死方式均為腹腔注射10%水合氯醛，劑量為4.0 mL/kg，深入麻醉大鼠后腹主動脈取血留用（用于后續(xù)實驗）；取血后大鼠死亡，快速取出大鼠雙側(cè)卵巢，一側(cè)卵巢經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃凍存，用于mRNA和蛋白表達的檢測；另一側(cè)卵巢置于4%多聚甲醛中固定，用于TUNEL 檢測。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 qRT-PCR方法檢測卵巢中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA的表達qPCR操作按試劑盒說明書進行。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，PCR 反應條件為：95 ℃、10 min 預變性；95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、35 s，退火、變性、延伸，40 個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后從55 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。以β-actin 進行參照，以2-ΔΔCt值表示p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 的相對表達量。各基因名稱、引物序列及擴增長度見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.5.2 Western blot 方法檢測卵巢中p38MAPK、NF-κB、GDF9 蛋白的表達提取大鼠卵巢組織總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白水平后，SDS-PAGE 電泳，蛋白質(zhì)PVDF 膜上轉(zhuǎn)膜，添加一抗Anti-GDF9 抗體（1∶5 000 稀釋），Anti-p38（phospho T180+Y182）抗體（1∶5 000 稀釋），Anti-NF-κB p65抗體（1∶5 000稀釋）及二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H + L），Mouse/Human ads-HRP（1∶20 000 稀釋），添加發(fā)光液，顯影，Image J 軟件處理系統(tǒng)分析蛋白及內(nèi)參灰度值。

1.5.3 TUNEL法檢測卵巢GCs凋亡率TUNEL檢測操作按試劑盒說明書進行，熒光鏡下觀察，200倍視野拍照，用Image J軟件處理系統(tǒng)分析GCs凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊性檢驗采用Levene 法，當方差不齊時，采用Welch 檢驗（校正F檢驗）。qRT-PCR 結(jié)果方差不齊，組間的多重比較選擇Tamhane's T2檢驗分析；Western blot、TUNEL 結(jié)果方差齊，組間的多重比較選擇Bonferroni 檢驗分析。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢組織中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 表達比較與NO 組比較，COH組大鼠卵巢組織中p38MAPK、NF-κB的表達升高（P＜ 0.01），CK2、IκBα 的表達下降（P＜ 0.01），GDF9的表達減少（P＜ 0.01）；與COH組比較，COH +JHZZG組大鼠卵巢組織中p38MAPK、NF-κB的表達下降（P＜ 0.01），CK2、IκBα 的表達升高（P＜ 0.01），GDF9的表達增加（P＜ 0.01）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢組織中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 表達比較Tab.2 Expression of p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA in ovarian tissues ±s

表2 各組大鼠卵巢組織中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 表達比較Tab.2 Expression of p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA in ovarian tissues ±s

注：與NO組比較，*P ＜ 0.01，與COH組比較，△P ＜ 0.01

組別NO組COH組COH+JHZZG組校正F值P值GDF9 1.113±0.134 0.300±0.089*0.573±0.026*△70.690＜ 0.001例數(shù)666 p38MAPK 1.157±0.206 4.355±0.626*2.760±0.644*△75.236＜ 0.001 CK2 1.248±0.260 0.290±0.073*0.575±0.086*△45.576＜ 0.001 IκBα 1.155±0.203 0.605±0.094*2.488±0.571*△43.222＜ 0.001 NF-κB 0.968±0.097 3.458±0.383*2.393±0.323*△148.933＜ 0.001

2.2 各組大鼠卵巢組織中p38MAPK、NF-κB、GDF9 蛋白表達比較與NO 組比較，COH 組大鼠卵巢組織中p38MAPK、NF-κB 的表達升高（P＜0.01），GDF9 的表達下降（P＜ 0.01）；與COH 組比較，COH+JHZZG 組大鼠卵巢組織中p38MAPK、NF-κB 的表達下降（P＜ 0.01），GDF9 的表達升高（P＜ 0.01）。見圖1。

注：A：NO 組，B：COH 組，C：COH + JHZZG 組；與NO 組比較，*P ＜ 0.01；與COH 組比較，△P ＜ 0.01圖1 各組大鼠卵巢組織中p38MAPK、NF-κB、GDF9 蛋白表達比較Fig.1 Expression of p38MAPK， NF-κB， GDF9 proteins in ovarian tissues

2.3 各組大鼠卵巢GCs 凋亡率比較TUNEL 染色后，熒光鏡下，以細胞核呈棕黃色為陽性凋亡細胞。自然排卵組呈現(xiàn)棕黃色的細胞核少，COH 組呈現(xiàn)棕黃色的細胞核多，中藥干預后呈現(xiàn)棕黃色的細胞核減少；與NO 組比較，COH 組大鼠卵巢GCs 凋亡率升高（P＜ 0.01）；與COH 組比較，COH+JHZZG 組大鼠卵巢GCs 凋亡率下降（P＜ 0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組卵巢GCs 凋亡率比較（蘇木素染色，× 200）Fig.2 Ovarian granulosa cells （hematoxylin staining， × 200）

表3 各組大鼠卵巢GCs 凋亡率比較Tab.3 Apoptosis rate of ovarian granulosa cells ±s

表3 各組大鼠卵巢GCs 凋亡率比較Tab.3 Apoptosis rate of ovarian granulosa cells ±s

注：與NO組比較，*P ＜ 0.01，與COH組比較，△P ＜ 0.01

組別NO組COH組COH+JHZZG組F值P值凋亡率0.255±0.032 0.368±0.033*0.266±0.070△10.107 0.002例數(shù)666

3 討論

卵泡中存在大量的GCs，通過合成和表達多種激素、生長因子及其受體，調(diào)節(jié)卵母細胞和卵泡的發(fā)育［5-6］。GCs 的凋亡可抑制該過程，促進卵泡閉鎖［1，7-8］。GDF9 能調(diào)節(jié)GCs 對促卵泡生成素的敏感性［9-10］，調(diào)控GCs 的增殖、分化和排卵及卵泡黃素化［11-12］，是卵泡發(fā)育的重要因子。IVF-ET不可避免地需使用COH 以獲取足夠數(shù)量的卵泡。本研究結(jié)果顯示，與自然排卵組比較，COH 降低了卵巢組織GDF9 的表達，使GCs 凋亡率顯著升高。與以往的研究結(jié)果相符，提示COH 降低了卵泡質(zhì)量。

目前關(guān)于GDF9 與SMAD 信號通路之間關(guān)系的研究已較成熟，有研究發(fā)現(xiàn)豬的卵細胞分泌的GDF9 可以通過PI3K/FOXO3a 通路介導，使卵丘細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白BimEL 表達處于低水平［13］。而GDF9 的調(diào)節(jié)機制很復雜，仍未完全清楚，目前研究熱點在其調(diào)節(jié)機制上及與其他信號通路是否存在聯(lián)系，而關(guān)于GDF9 與p38MAPK 和NF-κB 通路及與卵巢GCs 凋亡關(guān)系的研究均鮮有報道。

p38MAPK 是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases， MAPKs）家族的成員，由細胞外的多種應激反應信號與受體特異性結(jié)合而激活，控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達活性，在細胞因子產(chǎn)生、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和細胞凋亡過程中起重要作用［14］。在睪丸、卵巢中主要有p38δ 亞型的表達［15］。NF-κB 作為細胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬于NF-κB/Rel 蛋白家族，參與機體炎癥、組織損傷修復及免疫等調(diào)節(jié)［16］，在卵細胞生長和胚胎發(fā)育等過程中調(diào)控與凋亡有關(guān)的基因表達［17］。此前有研究在DNA 損傷的細胞中發(fā)現(xiàn)p38MAPK 能激活酪蛋白激酶2（casein kinase 2， CK2），介導NF-κB 抑制因子α（inhibitor of NF-κB-α， IκBα）磷酸化，繼而激活NF-κB［18］。活化的NF-κB 通過線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑調(diào)節(jié)細胞凋亡的過程［19-21］。本研究中，與自然排卵組比較，COH 促使p38MAPK 和NF-κB 表達增加，CK2 和IκBα 表達減少，這可能是COH 使GDP9 分泌減少，GCs 凋亡增加的作用途徑。

現(xiàn)代醫(yī)學“下丘腦-垂體-卵巢”性腺軸與中醫(yī)學“腎氣-天癸-沖任”生殖軸相對相應。不孕癥與腎氣虧虛，沖任氣血不足有關(guān)。近年來有臨床研究證實，補腎養(yǎng)血活血中藥能改善子宮內(nèi)膜容受性［22］，提高IVF 中COH 患者的優(yōu)胚率和凍胚率［23］。本研究中，具有益氣血作用的經(jīng)后增殖方由八珍湯（黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、熟地黃、當歸、白芍、川芎）加山萸肉、菟絲子、鹿角霜、杜仲、川椒組成。方中四君子湯補氣健脾，四物湯補血養(yǎng)血活血，加山萸肉、菟絲子、鹿角霜、杜仲、川椒補腎填精、溫陽暖宮，全方共奏補益氣血、溫腎助陽、養(yǎng)精種子之功。用現(xiàn)代工藝制成顆粒劑，藥效穩(wěn)定。本課題組早前的臨床觀察表明該方能提高雌激素分泌的水平，促進卵泡發(fā)育，改善卵母細胞質(zhì)量，增強胚胎著床潛能，進而提高胚胎的種植率［3］。后續(xù)的動物研究提示經(jīng)后增殖方能促進Bcl-2 的表達，抑制Bax 和Caspase3 的表達［24］，促進GCs 的增殖和卵丘-卵母細胞復合體的發(fā)育，并維持Bim 低表達水平［4］，從而提高COH 卵泡和胚胎質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，在COH 的基礎(chǔ)上應用經(jīng)后增殖方，能降低COH 大鼠卵巢組織p38MAPK 和NF-κB 的表達，提高CK2、IκBα 的表達，從而提高GDF9 的表達水平，降低GCs 的凋亡率，提示經(jīng)后增殖方可能通過p38MAPK/CK2/IκBα/NF-κB 通路改善COH 卵細胞質(zhì)量。

綜上所述，經(jīng)后增殖方能提高COH 大鼠卵巢GDF9 的表達，降低卵巢GCs 凋亡率，其作用機制可能是通過調(diào)控p38MAPK/CK2/IκBα/NF-κB 信號通路來實現(xiàn)的。本研究首次探討了經(jīng)后增殖方對p38MAPK/CK2/IκBα/NF-κB 信號通路的影響，進一步完善經(jīng)后增殖方改善IVF 妊娠結(jié)局的作用機制。本文的不足之處是，尚未對p38MAPK 和NF-κB 下游效應因子進行深入研究，及經(jīng)后增殖方可否通過調(diào)控其他信號通路起到相同的效果，這將是后續(xù)研究的方向。

【Author contributions】YANG Zhen designed the study， performed the experiments， wrote and reviewed the article.JIANG Shaoru designed the study.CHEN Xiaoyan and CHEN Xiaolin analyzed the data.DENG Weimin and GUO Xinyu revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.