李文昕 盧敏君 林莉 劉月琴 朱小蘭

江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院（鎮(zhèn)江市婦幼保健院）生殖醫(yī)學(xué)中心，中心實(shí)驗(yàn)室（江蘇鎮(zhèn)江 212001）

女性在40 歲之前出現(xiàn)卵巢功能障礙，引起閉經(jīng)及相關(guān)伴隨癥狀，稱為早發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency， POI）［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，POI 在一般人群中的發(fā)病率約為1%［2］。在社會(huì)層面上，一直存在著推遲生育的趨勢(shì)，但女性的卵巢儲(chǔ)備功能卻隨年齡增長(zhǎng)而逐步下降［3］。通過(guò)經(jīng)典的序貫激素替代療法很難恢復(fù)卵巢功能，且伴有副作用［4］。因此，挖掘POI 發(fā)病（或發(fā)生）的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)POI 的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)高危人群進(jìn)行早期預(yù)防與干預(yù)顯得尤為重要。

卵巢儲(chǔ)備功能減退和卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是POI 患者低妊娠率最重要的原因［5］，卵巢顆粒細(xì)胞（GCs）可以為卵母細(xì)胞成熟提供必要的營(yíng)養(yǎng)支持和微環(huán)境［6］。在哺乳動(dòng)物卵巢中，不到1%的卵泡排卵，其余99%的卵泡在排卵前會(huì)發(fā)生閉鎖［7］，而GCs 凋亡在卵泡閉鎖中起主要作用［8］。最近的研究表明，GCs 的功能障礙主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減少、凋亡增加［9］，找到GCs 增殖及凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子可能為POI 的防治提供新的策略。

隨著RNA 測(cè)序的發(fā)展，越來(lái)越多的環(huán)狀RNA（circRNAs）被發(fā)現(xiàn)和鑒定。與以5'帽端和3'尾端終止的線性RNA 不同，circRNAs 既沒(méi)有5'至3'極性，也沒(méi)有聚腺苷酸化尾巴［10］，不易被RNase R 降解［11］且擁有更長(zhǎng)的半衰期［12］。此外，因circRNAs具有組織特異性且高度保守，往往被認(rèn)為是各種疾病的潛在生物標(biāo)志物［13-14］。circRNAs 已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等各種生物過(guò)程［15］。近年來(lái)對(duì)于circRNAs的研究日益增多，但circRNAs 與POI 的相關(guān)性及其調(diào)節(jié)POI 的機(jī)制還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，尋找與POI 相關(guān)的circRNAs并闡明其在POI 中的作用，有助于POI 的早期預(yù)防與干預(yù)。

本研究在POI 患者的GCs 及血清中發(fā)現(xiàn)了共同下調(diào)的circRAF1 并探究其生物來(lái)源。此外，本研究結(jié)果表明，circRAF1 的表達(dá)與臨床卵巢功能指標(biāo)的血清水平相關(guān)，并通過(guò)干擾KGN 細(xì)胞中circRAF1 的表達(dá)證實(shí)了其在GCs 增殖和凋亡中的調(diào)節(jié)作用，為尋找POI 的新型生物學(xué)標(biāo)記物提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源選取2022 年6 月至2023 年7 月于江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精和（或）卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射-胚胎移植（in vitrofertilization or intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，IVF/ICSI-ET）的POI 患者（POI 組）50 例；同期選取因男方和（或）輸卵管因素在本中心行IVF/ICSI-ET 的卵巢儲(chǔ)備功能正常的患者（NC 組）50 例作為對(duì)照，2 組年齡及BMI相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），具有可比性。本研究中所有POI 患者均由主治及以上醫(yī)師明確診斷。收集患者的GCs 和血清樣本（月經(jīng)期第2～3 天清晨空腹抽?。＝?jīng)江蘇大學(xué)附屬第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)要求，所有受試者均自愿參加并簽署書(shū)面知情同意書(shū)?；颊呋拘畔⒁?jiàn)表1。

表1 本研究的患者信息Tab.1 Patients information for this study ±s

表1 本研究的患者信息Tab.1 Patients information for this study ±s

注：BMI，體質(zhì)量指數(shù)；AMH，抗苗勒管激素；E2，雌二醇；FSH，卵泡刺激素；LH，促黃體生成素；AFC，竇卵泡計(jì)數(shù)

P值0.458 0.513 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001項(xiàng)目年齡（歲）BMI（kg/m2）AMH（ng/mL）E2（pmol/L）FSH（IU/L）LH（IU/L）AFC（個(gè)）NC組（n = 50）31.50±5.50 21.10±2.84 4.94±3.90 181.00±91.00 6.26±3.68 6.58±4.33 12.50±5.50 POI組（n = 50）33.00±5.00 21.53±2.57 0.50±0.49 80.50±67.50 32.19±7.11 22.55±11.52 5.00±4.00

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合POI 診斷標(biāo)準(zhǔn)［16］：女性在40 歲之前出現(xiàn)月經(jīng)稀發(fā)/閉經(jīng)> 4 個(gè)月，間隔1 個(gè)月以上檢測(cè)兩次FSH 水平> 25 U/L；（2）臨床資料保存完整者；（3）未伴有其他任何疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有其他內(nèi)分泌和（或）免疫疾病者；（2）伴有嚴(yán)重的心血管、腎臟等疾病者；（3）既往3 個(gè)月服用激素者。

1.2 方法

1.2.1 GCs 的提取在取卵期間收集直徑為16～20 mm的卵泡進(jìn)行進(jìn)一步分析。將樣品4 000 r/min離心4 min，去除大部分上清以獲取GCs沉淀。加入透明質(zhì)酸酶（80 IU/mL）后在37 ℃、5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中孵育30 min。1 500 r/min 離心10 min 棄上清，使用含有10%胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）和1%青霉素-鏈霉素（美國(guó)Hyclone 公司）的DMEM/F12（美國(guó)Gibco 公司）培養(yǎng)基重懸GCs，并在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染本研究涉及的KGN 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Si-circRAF1（sense：5'-GCAGGAUGAUUGAGAUUGUTT-3'，antisense：5'-ACAAUCUCAAUCAUCCUGCTT-3'）和相應(yīng)的對(duì)照（si-NC）均購(gòu)自中國(guó)蘇州吉瑪基因股份有限公司。按照制造商的說(shuō)明，使用lipofectamine2000 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 RNA提取、RNase R處理和RT-qPCR根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）裂解細(xì)胞提取總RNA。在1 μg 總RNA 中加入4 U RNase R（美國(guó)Lucigen 公司），37 ℃中孵育30 min，70 ℃ 10 min 終止反應(yīng)。使用HiScript II Q RT SuperMix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）對(duì)加入或沒(méi)加入RNase R 的總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進(jìn)行RT-qPCR。GAPDH 或U6 被用來(lái)作為內(nèi)源性參考。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成。相關(guān)基因RT-qPCR 擴(kuò)增引物見(jiàn)表2。

表2 引物名稱及序列Tab.2 Primers names and sequences

1.2.4 普通PCR 及產(chǎn)物鑒定根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用基因組DNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取細(xì)胞gDNA。分別以cDNA 及gDNA為模板，設(shè)計(jì)circRAF1 的聚合引物和發(fā)散引物（引物見(jiàn)表2）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（反應(yīng)體系50 μL）。使用1 × TAE 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）配制2%瓊脂糖凝膠，擴(kuò)增產(chǎn)物在120 V 恒壓條件下電泳30 min。在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，并判斷擴(kuò)增片段的位置。

1.2.5 放線菌素D（act-Dactinomycin， ACTD）處理將KGN 細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)箱中孵育24 h 后加入ACTD（美國(guó)sigma 公司），分別在培養(yǎng)0、6、12 和24 h 后使用TRIzol 試劑提取總RNA。

1.2.6 核質(zhì)分離使用細(xì)胞核與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）分離細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。收集細(xì)胞，加入200 μL 預(yù)先混入5 μL RNase Inhibitor 的試劑A，冰浴10～15 min。加入10 μL試劑B，冰浴3～5 min。4 ℃ 12 000g/min離心5 min 后，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，加入TRIzol 試劑抽提胞漿RNA。對(duì)于沉淀，吸盡上清后加入TRIzol 試劑抽提胞核RNA。

1.2.7 蛋白質(zhì)提取和免疫印記（WB）使用含有1%蛋白酶抑制劑（北京索萊寶科技有限公司）的RIPA 緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）裂解細(xì)胞，提取蛋白。測(cè)定樣品蛋白濃度，加入5 ×Lodding 緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），水浴煮沸5 min。蛋白裂解物用10% SDS-PAGE 凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司）上。PVDF 膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h 后分別與FSHR 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，1∶1 000）、PCNA 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，1∶500）、Bcl-2 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，1∶500）、Casp-3 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，1∶500）和Bax 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，1∶500）在4 ℃下孵育過(guò)夜，GAPDH 抗體（美國(guó)Proteintech公司，1∶10 000）作為內(nèi)參。IgG 抗體（合肥白鯊生物科技有限公司，1∶10 000）在室溫下孵育2 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL；南京諾唯贊生物科技股份有限公司）曝光。

1.2.8 EdU 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)使用EdU 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）檢測(cè)細(xì)胞增殖。將KGN 細(xì)胞接種于24 孔板中，按照試劑盒的說(shuō)明，對(duì)EdU進(jìn)行標(biāo)記（紅色）；每孔加入250 μL 5 μg/mL 1× Hoechst 33342 反應(yīng)液，進(jìn)行細(xì)胞核染色（藍(lán)色），制片后立即用熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）拍攝圖片。

1.2.9 CCK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)使用CCK-8 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）檢測(cè)細(xì)胞活力。將KGN細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染24、48、72和96 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖。每孔加入10 μL CCK-8溶液，空白對(duì)照組（不包含細(xì)胞）添加相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8 溶液；培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h 后使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450，并計(jì)算細(xì)胞存活百分比，計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活百分比=［（實(shí)驗(yàn)組OD450-空白對(duì)照組OD450）/（對(duì)照組OD450-空白對(duì)照組OD450）］×100%

1.2.10 JC-1 線粒體凋亡檢測(cè)使用JC-1 線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)線粒體凋亡。將KGN 細(xì)胞接種于24 孔板中，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配制染色工作液（10 μg/mL）和染色緩沖液。每孔加入250 μL 染色工作液，在培養(yǎng)箱中孵育20 min，用染色緩沖液清洗細(xì)胞2 次后制片，立即用熒光顯微鏡拍攝照片。

1.2.11 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)使用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。將KGN 細(xì)胞接種于24 孔板中，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌1次。用含0.3% Triton X-100 的PBS 室溫孵育5 min，PBS洗滌2 次。根據(jù)說(shuō)明書(shū)配制適量的TUNEL 檢測(cè)液，每孔加入25 μL TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3 次后制片，立即用熒光顯微鏡拍攝圖片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代表3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 軟件（9.0 版）進(jìn)行計(jì)算并生成統(tǒng)計(jì)圖。兩組之間的差異使用雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的表達(dá)如下：ns 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P＜ 0.05；**P＜ 0.01；***P＜ 0.001；****P＜ 0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 circRAF1 在POI 患者GCs 與血清中表達(dá)下調(diào)為了尋找與卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)的circRNAs，對(duì)GEO 數(shù)據(jù)集（GSE97193）進(jìn)行了再分析，該數(shù)據(jù)包括3 例高齡（AA， ≥ 38 歲）IVF 患者和3 例年輕（≤ 30 歲）IVF 患者GCs 中circRNAs 的RNA-seq 數(shù)據(jù)。共有179 個(gè)circRNAs（包括61 個(gè)下調(diào)和117 個(gè)上調(diào)的circRNAs）在卵巢GCs 中存在差異表達(dá)（圖1A-B）。在這些下調(diào)的circRNAs 中，分析了其宿主基因的功能，發(fā)現(xiàn)circ_0064365 的宿主基因RAF1 參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。由于circ_0064365來(lái)源于RAF1，將其命名為circRAF1。隨后，提取了正常卵巢儲(chǔ)備患者和POI患者的GCs，并用FSHR免疫熒光染色進(jìn)行鑒定（圖1C）。RT-qPCR結(jié)果顯示，circRAF1 在POI 患者的GCs 及血清中明顯下調(diào)（P＜ 0.000 1），見(jiàn)圖1D-E。

注：A，聚類圖；B，火山圖；C，通過(guò)FSHR 免疫熒光鑒定GCs；D-E，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)NC 組（n = 50）和POI 組（n = 50）GCs 和血清中circRAF1 的表達(dá)；F，circRAF1 環(huán)化示意圖；G，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了KGN 細(xì)胞中circRAF1 的存在；H-I，ACTD 和RNase R 處理后，通過(guò)RT-qPCR 測(cè)定circRAF1 和RAF1 的表達(dá)；J-K，核質(zhì)分離法和FISH 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circRAF1 在KGN 細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。ns 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；**P ＜ 0.01；****P ＜ 0.000 1圖1 circRAF1 在POI 患者GCs 與血清中下調(diào)Fig.1 CircRAF1 is down-regulated in GCs and serum of POI patients

2.2 circRAF1 在KGN 細(xì)胞中的鑒定與特征長(zhǎng)達(dá)253 bp 的circRAF1 由RAF1 的6-7 號(hào)外顯子環(huán)化而成（圖1F）。為了驗(yàn)證circRAF1的特征，使用發(fā)散引物和聚合引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，circRAF1 在KGN 細(xì)胞中表達(dá)，且只有在cDNA 中以發(fā)散引物才能擴(kuò)增出circRAF1（圖1G）。ACTD實(shí)驗(yàn)顯示，circRAF1比線性RAF1擁有更長(zhǎng)的半衰期（P＜ 0.01），見(jiàn)圖1H。RAF1在RNase R 消化后表達(dá)量明顯降低（P＜ 0.000 1），而circRAF1 表達(dá)量無(wú)明顯變化（P> 0.05），這表明circRAF1相比于RAF1具有更強(qiáng)的耐RNase R 消化的特征（圖1I）。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)（圖1J）和FISH 實(shí)驗(yàn)（圖1K）表明大部分circRAF1 位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 circRAF1 與卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)為了驗(yàn)證circRAF1 與卵巢儲(chǔ)備功能的相關(guān)性，首先分析50 例POI患者中，circRAF1的表達(dá)與臨床卵巢儲(chǔ)備功能指標(biāo)（E2、 AMH、 FSH、 LH、 AFC）的相關(guān)性，結(jié)果顯示：circRAF1 的表達(dá)與血清中基礎(chǔ)E2和AMH水平呈正相關(guān)（P＜ 0.001），見(jiàn)圖2A-B，而與血清中基礎(chǔ)FSH、LH 水平呈負(fù)相關(guān)（P＜ 0.001），圖2C-D。同樣地，所有血清樣本（n= 100）的相關(guān)分析顯示，circRAF1 的表達(dá)與血清中基礎(chǔ)E2和AMH 水平呈正相關(guān)（P＜ 0.001），見(jiàn)圖2E-F，而與血清中基礎(chǔ)FSH、LH 水平呈負(fù)相關(guān)（P＜ 0.001），圖2G-H，同時(shí)，circRAF1 的表達(dá)與AFC 呈正相關(guān)（P＜ 0.001），見(jiàn)圖3I。這表明circRAF1 與卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)，有望成為POI 的新型生物學(xué)標(biāo)記。

注：A-D，采用Pearson 相關(guān)分析法分析血清中circRAF1 的表達(dá)與POI 患者（n = 50）血清E2、AMH、FSH、LH 濃度的相關(guān)性；E-H，采用Pearson 相關(guān)分析方法分析血清中circRAF1 的表達(dá)與所有受試者（n = 100）血清E2、AMH、FSH、LH 濃度的相關(guān)性；I，采用Pearson 相關(guān)分析方法分析血清中circRAF1 的表達(dá)與所有受試者（n = 100）AFC 的相關(guān)性圖2 circRAF1 與卵巢儲(chǔ)備功能相關(guān)Fig.2 Correlation between circRAF1 and ovarian reserve function

2.4 干擾circRAF1 抑制KGN 細(xì)胞的增殖為了進(jìn)一步探究circRAF1 的功能，設(shè)計(jì)了針對(duì)circRAF1 的小干擾RNA（si-circRAF1），并在KGN 細(xì)胞中對(duì)circRAF1 進(jìn)行干擾。與對(duì)照組相比，干擾circRAF1 后，circRAF1 的表達(dá)下調(diào)（P＜ 0.05），見(jiàn)圖3A，細(xì)胞增殖能力下降（P＜ 0.05），見(jiàn)圖3B，細(xì)胞活力降低（P＜ 0.01），見(jiàn)圖3C。此外，增殖相關(guān)基因FSHR、PCNA 和Bcl-2 mRNA 及其對(duì)應(yīng)蛋白表達(dá)水平也顯著降低（P＜ 0.05），見(jiàn)圖3D-G。綜上所述，干擾circRAF1 抑制了KGN 細(xì)胞的增殖能力。

注：A，RT-qPCR 檢測(cè)si-circRAF1 的干擾效率；B，EdU 檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；C，CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力；D-F，RT-qPCR 檢測(cè)FSHR、PCNA 和Bcl-2 mRNA 的表達(dá)；G，WB 檢測(cè)FSHR、PCNA 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)。*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01圖3 干擾circRAF1 抑制KGN 細(xì)胞的增殖Fig.3 Silencing circRAF1 inhibits the proliferation of KGN cells

2.5 干擾circRAF1 促進(jìn)KGN 細(xì)胞凋亡線粒體膜電位的破壞是細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志性事件，檢測(cè)了干擾circRAF1 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，干擾circRAF1 后，KGN 細(xì)胞線粒體膜電位下降（P＜ 0.05，圖5A-B），凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜ 0.05，圖5C-D）。此外，凋亡相關(guān)基因Casp-3、Bax mRNA 及其對(duì)應(yīng)蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05，圖5E-H），Bcl-2/Bax 下降（P＜ 0.05，圖5I）。這些結(jié)果表明，干擾circRAF1 促進(jìn)KGN細(xì)胞凋亡。

注：A-B，JC-1 檢測(cè)細(xì)胞線粒體凋亡；C-D，TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡；E-F，RT-qPCR 檢測(cè)Casp-3 和Bax mRNA 的表達(dá)；G-H，WB 檢測(cè)Casp-3 和Bax 蛋白的表達(dá)；I，Bcl-2 與Bax 表達(dá)水平的比值。*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001圖4 干擾circRAF1 促進(jìn)KGN 細(xì)胞凋亡Fig.4 Silencing circRAF1 promotes apoptosis in KGN cells

3 討論

由于卵泡閉鎖和周期性排卵，原始卵泡數(shù)量在女性整個(gè)生命過(guò)程中逐步下降，并隨年齡的增長(zhǎng)而加速［17］。異常的卵泡閉鎖會(huì)導(dǎo)致原始卵泡過(guò)早耗竭，繼而發(fā)生卵巢功能不全［18］。卵巢GCs凋亡是卵泡閉鎖的重要機(jī)制［19］。這表明促進(jìn)GCs增殖，抑制GCs 凋亡可以挽救受損的卵巢結(jié)構(gòu)和功能。

由于circRNAs 獨(dú)特的穩(wěn)定性、多樣性和特異性，具有作為候選診斷、預(yù)后和治療靶點(diǎn)的潛力［20］。近年來(lái)，腎癌［21］、胃癌［22］、肝癌［23-24］、甲狀腺癌［25］等都已找出高靈敏度的circRNAs 指標(biāo)作為生物標(biāo)志物來(lái)輔助臨床診斷。最近的證據(jù)顯示，circRNAs 與多種卵巢疾病相關(guān)，包括多囊卵巢綜合征［26-27］、卵巢早衰［28］和上皮性卵巢癌［29］等。本研究在POI 患者GCs 及血清中發(fā)現(xiàn)了共同下調(diào)的circRAF1。隨后證實(shí)了circRAF1具有較長(zhǎng)的半衰期和較高的穩(wěn)定性。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)circRAF1 與臨床卵巢功能指標(biāo)血清水平和AFC 高度相關(guān)，這都說(shuō)明circRAF1 有望成為提示POI 的新型生物標(biāo)志物。

此前的研究表明，RAF1 可以介導(dǎo)FSH 的信號(hào)傳導(dǎo)，以刺激GCs 中E2的合成和分泌［30］。另有研究表明，RAF1 可以通過(guò)調(diào)節(jié)LAGE1 調(diào)控下咽癌細(xì)胞增殖與凋亡［31］。來(lái)源于RAF1 的circRAF1 可能行使著與其宿主基因相似的生物學(xué)功能。此前，已有多項(xiàng)研究證實(shí)circRNAs 參與卵巢功能的調(diào)節(jié)，例如：circLDLR 通過(guò)miR-1294/CYP19A1 軸調(diào)節(jié)E2的分泌［32］；circ_0118530 缺失抑制KGN 細(xì)胞增殖、遷移、氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子釋放［33］；circ_0023942 通過(guò)調(diào)節(jié)CDK-4 抑制GCs 增殖［34］；敲低circ-FURIN 通過(guò)miR-195-5p/BCL2 軸抑制GCs 的增殖并誘導(dǎo)凋亡［35］。然而，circRAF1是否參與卵巢功能的調(diào)節(jié)目前尚未知曉，本研究對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究將KGN 細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-circRAF1 構(gòu)建circRAF1 低表達(dá)KGN 細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾circRAF1 抑制了KGN 細(xì)胞增殖，促進(jìn)了凋亡，這表明circRAF1 在卵巢功能中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，納入研究的樣本量較小，還需要更多的大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)證明circRAF1 作為未來(lái)POI 生物標(biāo)志物的有效性。此外，由于時(shí)間有限，本研究未能深入探究circRAF1 下游通路及其下游因子在POI 中的作用。不過(guò)眾所周知，circRNAs 往往通過(guò)作為miRNA 的分子海綿［36］和RNA 結(jié)合蛋白［37］來(lái)執(zhí)行多種功能，一些circRNAs 甚至在多種病理生理過(guò)程中充當(dāng)翻譯模板［38］。后續(xù)的研究也將從以上幾個(gè)方面為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探究circRAF1 調(diào)節(jié)卵巢功能的可能機(jī)制。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：POI 患者GCs 及血清中的circRAF1 表達(dá)水平下調(diào)，且與卵巢儲(chǔ)備功能下降有關(guān)。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：干擾circRAF1 可以抑制KGN 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。這都表明circRAF1 可能通過(guò)調(diào)控GCs 的功能影響POI 的發(fā)生發(fā)展。在后續(xù)的研究中，可以在細(xì)胞和動(dòng)物水平進(jìn)一步探討circRAF1 調(diào)控GCs 功能的具體分子機(jī)制，為POI 防治研究提供新的視角和思路。

【Author contributions】LI Wenxin was responsible for experimental operation， data collection and analysis， statistical analysis and paper writing； LU Minjun was responsible for data collection and analysis； LIN Li and LIU Yueqin were responsible for sample collection；ZHU Xiaolan was responsible for experimental design， research guidance， paper revision and financial support.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.