吳曉萍

福建中檢華日食品安全檢測(cè)有限公司（福州 350028）

茶葉作為一種商品，從其產(chǎn)生發(fā)展至今對(duì)中國(guó)經(jīng)濟(jì)及全球貿(mào)易的發(fā)展起到重要影響作用。世界上存在的3種非酒精類(lèi)（咖啡、可可和茶葉）飲料中，由于茶葉含有大量多酚、咖啡因和芳香等物質(zhì)，在抗癌、抗氧化和抗炎等方面具有一定功效，茶葉這一獨(dú)特的飲品已贏得全球眾多人的喜愛(ài)，成為世界上最受歡迎的飲料之一[1-2]。

茶葉中存在多種化學(xué)物質(zhì)，在農(nóng)藥殘留的檢測(cè)過(guò)程中會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)度產(chǎn)生一定的干擾作用，因此在檢測(cè)前期需要增加對(duì)茶葉的前處理凈化過(guò)程，從而提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有關(guān)茶葉的前處理方法主要包括2種，分別為QuEChERS法[3-7]和固相萃取法[8-11]。其中，QuEChERS法具有操作簡(jiǎn)便、快捷的特點(diǎn)，尤其與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）結(jié)合使用可以大幅提高檢測(cè)效率。GB 2763.1—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中2,4-滴丁酸鈉鹽等112種農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定茶葉的滅草松及其代謝物的臨時(shí)限量為0.1 mg/kg，但尚未指定檢測(cè)的方法。因此建立一種檢測(cè)滅草松及其代謝物在茶葉上的殘留的方法具有重要意義。

采用QuEChERS的前處理方法凈化茶葉，采用LCMS/MS聯(lián)用的分析方法對(duì)茶葉中的滅草松及其代謝物進(jìn)行定量測(cè)定，建立GB 2763.1—2022中滅草松及其代謝物松殘留分析方法，可滿(mǎn)足茶葉中多農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，為后續(xù)制定滅草松及其代謝物殘留分析的標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜（1290）-三重四極桿（6475）（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；低速分離機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；滅草松及代謝產(chǎn)物6-羥基滅草松、8-羥基滅草松（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）及石墨炭黑（GCB）（上海安譜技術(shù)有限公司）；檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（國(guó)藥集團(tuán)）；所用溶劑及其他試劑皆為色譜純；試驗(yàn)用水為3次濾后的純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備：準(zhǔn)確移取1 mL質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的滅草松及其代謝物于10 mL容量瓶并定容至刻度，得到100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：準(zhǔn)確吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度線(xiàn)，獲得質(zhì)量濃度10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，放于-18 ℃冰箱中存儲(chǔ)備用。

1.3 樣品的前處理

將茶葉500 g，粉碎后，過(guò)0.300 mm（50目）篩，裝入8號(hào)塑料袋，待用。精確稱(chēng)取2.0 g（精確至0.01 g）茶葉粉于50 mL聚四氟乙烯離心管中，向其中添加5 mL超純水將其浸泡30 min，添加15 mL的1%（V/V）乙酸乙腈溶液、5 g無(wú)水氯化鈉、1.5 g醋酸鈉，陶瓷均質(zhì)后在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取其上清液于5 mL離心管（含混合凈化劑PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 100 mg和MgSO4750 mg）渦漩2 min，置于15 000 r/min的轉(zhuǎn)速下高速離心5 min，過(guò)膜后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.4 LC-MS/MS儀器條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為4 mmol/L乙酸銨水溶液（0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）、電子噴霧離子源（ESI-）。離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃、毛細(xì)管電壓3.5 kV，噴霧壓強(qiáng)35 psi，脫溶劑氣流量12 L/min。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為得到最佳質(zhì)譜條件，將0.1 μg/mL混標(biāo)在MS1正負(fù)模式下進(jìn)行掃描得最佳模式下母離子，對(duì)每個(gè)化合物去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化得到最佳模式，試驗(yàn)結(jié)果表明滅草松、6-羥基滅草松和8-羥基滅草松在負(fù)模式下響應(yīng)較大。通過(guò)子離子掃描和MRM掃描得到最佳的碎片離子和碰撞能量，具體參數(shù)詳見(jiàn)表2。

表2 3種農(nóng)藥的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能和去簇電壓

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

關(guān)于滅草松及其代謝物的提取方式大部分是在酸性條件下，使用丙酮或乙腈進(jìn)行提取。結(jié)果表明，丙酮提取出的樣液顏色比乙腈的深，且與水互溶不利于后期的凈化。對(duì)于液相來(lái)說(shuō)，丙酮不適合直接上機(jī)。試驗(yàn)比較純乙腈或乙酸乙腈兩者溶劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。如圖2所示，含有乙酸的乙腈回收率明顯高于乙腈，這跟滅草松屬于偏酸性化合物有關(guān)，在酸性條件下，使目標(biāo)物在基質(zhì)中呈分子態(tài)有利于提取。

圖1 3種化合物的提取離子色譜圖

圖2 不同提取劑對(duì)3種化合物的回收率的影響

2.2.2 凈化劑的選擇

茶葉中主要雜質(zhì)有如色素、生物堿、甾醇和茶多酚、水分及其他干擾物質(zhì)。茶多酚是主要干擾成分，而葉綠素和葉黃素是茶葉中最直接可見(jiàn)的干擾色素成分。Na2SO4和MgSO4常用于除水劑，Na+的半徑相對(duì)于Mg2+大，周?chē)梢匀菁{更多水分子，結(jié)合水的數(shù)目多，但Mg2+電荷大，半徑小，與水的結(jié)合能力較強(qiáng)，故無(wú)水硫酸鎂可作為除水劑。分別優(yōu)化PSA、C18和GCB的用量，往陰性綠茶樣品添加質(zhì)量濃度20 μg/kg的混標(biāo)，PSA、GCB和C18的用量為10，50，100，150和200 mg，以3種農(nóng)藥加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明（見(jiàn)圖3），隨著PSA用量增加，3種農(nóng)藥回收率越來(lái)越低，目標(biāo)物是酸性農(nóng)藥被堿性的PSA吸附嚴(yán)重，其余兩者跟目標(biāo)物無(wú)明顯吸附，當(dāng)每毫升加入PSA、C18和GCB的量分別為50，100和100 mg時(shí)，3種農(nóng)藥回收率在70%～110%，凈化效果最佳。故試驗(yàn)采用50 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB和750 mg MgSO4組合凈化劑。

圖3 吸附劑組成對(duì)提取回收率的影響

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的線(xiàn)性范圍、檢出限與定量限

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，用茶葉空白樣品提取液將3種農(nóng)藥混合儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋配得1，5，10，20，40，50和100 μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（橫坐標(biāo)x為32種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度μg/L，縱坐標(biāo)y為定量離子峰面積），計(jì)算3種農(nóng)藥在基質(zhì)中的檢出限（3倍信噪比），以最小添加濃度為定量限。結(jié)果顯示，3種農(nóng)藥各自線(xiàn)性良好（在基質(zhì)匹配濃度范圍內(nèi)），相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，滅草松及其代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松3種農(nóng)藥的檢出限為0.42，0.12和0.014 μg/kg。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)在農(nóng)藥分析的過(guò)程中普遍存在，用陰性茶葉配制濃度與乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)樣液，以二者的響應(yīng)峰面積的比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)的大小。其中，當(dāng)ME=0.8～1.2時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；反之為中強(qiáng)等基質(zhì)效應(yīng)[12]。結(jié)果顯示，滅草松的值為0.28，6-羥基滅草松為0.21，8-羥基滅草松為0.23，由此判定基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量則可減少基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的結(jié)果誤差從而提高準(zhǔn)確度。

2.3.3 加標(biāo)回收率與精密度

向空白茶葉基質(zhì)中添加3個(gè)含量水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10，20和100 μg/kg），每個(gè)加標(biāo)水平皆做6次平行試驗(yàn)，優(yōu)化檢測(cè)條件后進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，3種化合物在茶葉中的平均回收率為83.4%～99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）區(qū)間分別為1.2%～7.3%。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法的準(zhǔn)確度和精密度可以滿(mǎn)足試驗(yàn)要求[13]。

表3 3種化合物回收率和精密度（n=6）

2.4 樣品的測(cè)定

采用建立的方法測(cè)定40批市售茶葉樣品中3種農(nóng)藥，尚未有檢出。

3 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化不同的提取方式、凈化劑用量建立基于分散相萃取法聯(lián)合LC-MS/MS檢測(cè)茶葉中滅草松及其代謝物的分析方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快捷、定性定量準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可應(yīng)用于茶葉中3種新增農(nóng)藥（滅草松及其代謝物6-羥基滅草松和8-羥基滅草松）的殘留檢測(cè)，為解決茶葉的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)提供技術(shù)指導(dǎo)。