周美麗，王瑞，盧薇，王巖

寶雞市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心（寶雞 721000）

香蘭素類增香劑作為一類廣譜型香料，在食品、飲料、化妝品、日用化學(xué)品及醫(yī)藥等領(lǐng)域使用非常廣泛，其不僅可用作定香調(diào)香劑、協(xié)調(diào)劑及矯味劑，還能給產(chǎn)品增添濃郁的香草味和奶香味，食品中常用的有香蘭素及其甲基、乙基合成物[1-2]。香蘭素是人類合成最早的香精之一，產(chǎn)量亦居全球首位[3]。香蘭素與硫酸二甲酯在堿性環(huán)境中反應(yīng)生成的甲基香蘭素香氣濃郁持久，而乙基香蘭素的香氣則是香蘭素的3～4倍。香蘭素類化合物是公認(rèn)的較安全的食品添加劑，低劑量使用可發(fā)揮多重作用且呈現(xiàn)出有益健康的特性，高劑量的攝入則會(huì)導(dǎo)致人產(chǎn)生頭暈、惡心、嘔吐等不適，甚至?xí)p壞人體肝、腎等器官[3]。

GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對食品中可使用的香精種類、使用范圍及使用注意事項(xiàng)進(jìn)行明確規(guī)定，這類增香物質(zhì)不允許在大米中使用?；谖覈忝咨a(chǎn)現(xiàn)狀，大部分仍依賴進(jìn)口，且成本較高，一些不法企業(yè)為迎合消費(fèi)者通過將普通大米添加香精偽裝成泰國香米等，騙取消費(fèi)者而不當(dāng)?shù)美@件事情在“3·15”晚會(huì)也遭到曝光而公之于眾。關(guān)于這3種香料的檢測方法有分光光度法、電化學(xué)法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等[4-5]。試驗(yàn)選擇液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法2種方法對于大米中3種香精成分進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液相色譜法因選擇性差，不能很好將甲基香蘭素、乙基香蘭素進(jìn)行有效分離，容易造成色譜峰的重合，無法準(zhǔn)確定性。因此，選擇高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測3種物質(zhì)，以期建立快速高效便捷和準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1260 Infinity ⅡLC/TQ型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；KQ-500 DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA VORTEX GENIUS3型渦旋混合器（德國IKA公司）；UPH-IV-20TN型超純水機(jī)（四川優(yōu)普）；SQP Practum612-1CN型電子天平（感量0.000 1 g）和CPA225D電子天平（感量0.000 01 g），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.2 材料與試劑

香蘭素（批號22030581，純度99.90%），甲基香蘭素（批號22030716，純度99.40%），乙基香蘭素（批號220300404，純度99.90%），均購自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷、乙酸乙酯等（色譜純，均購自德國Sigma公司）；分離用色譜柱（XDB C18，規(guī)格50 mm×4.6 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技公司）；0.22 μm有機(jī)濾膜（天津津騰）；實(shí)驗(yàn)室用超純水（優(yōu)普制水機(jī)制備）；試驗(yàn)樣品為2022—2023年食品抽檢大米樣品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取100 mg香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素至檢定合格的100 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解并定容，得到的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度為1.00 mg/mL；吸取上述溶液各1.0 mL混合到100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，得到濃度10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；用空白基質(zhì)溶液配制濃度為5，10，20，50，80和160 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

稱取1 g粉碎并混合均勻的試樣，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水（9∶1，V/V），置于渦旋混合器上振蕩30 s，將離心管進(jìn)行25 min超聲處理，以10 000 r/min離心5 min后，將上層清液通過0.22 μm濾膜過濾至液相小瓶中，待測。同時(shí)，除不加樣品外，同法處理，做空白試驗(yàn)進(jìn)行比對。

1.3.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件的建立

液相色譜條件：XDB C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。質(zhì)譜條件：采用ESI（+）電噴霧離子源；MRM多反應(yīng)監(jiān)測采集數(shù)據(jù)；霧化氣15 psi；霧化氣溫度300 ℃；霧化氣流量7.0 L/min；Sheath Gas 溫度250 ℃；Sheath Gas流速11.0 L/min。

表1 梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1 μL 1 μg/mL的目標(biāo)化合物，分別泵入質(zhì)譜儀進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描確定母離子質(zhì)量數(shù)。以3種香精成分的母離子質(zhì)量數(shù)進(jìn)行選擇離子掃描，通過調(diào)節(jié)碰撞能量，選擇2個(gè)響應(yīng)較高的碎片離子作為子離子，進(jìn)一步在MRM模式下去優(yōu)化檢測參數(shù)，優(yōu)化后的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量見表2，3種香精成分定量離子的MRM圖見圖1，特征離子掃描質(zhì)譜圖見圖2。

圖1 香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素定量離子的MRM圖

圖2 香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素特征離子掃描質(zhì)譜圖

表2 MRM參數(shù)

2.1.2 液相條件的優(yōu)化

試驗(yàn)對比不同濃度甲酸水溶液-乙腈流動(dòng)相體系下3種化合物的梯度洗脫效果。結(jié)果表明，在相同的梯度洗脫條件下，隨著0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%甲酸濃度比例的加大，3種化合物的響應(yīng)值隨之增高，峰型也進(jìn)一步變好。進(jìn)一步比較將乙腈換做甲醇后的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)在0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫的體系下，3種香精成分的響應(yīng)值進(jìn)一步提高，說明離子化效率更好，檢測靈敏度改善明顯。因此，以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

從大米中有效提取出目標(biāo)化合物是準(zhǔn)確測定含量的前提。試驗(yàn)通過對陽性樣本的測定，進(jìn)一步研究比較正己烷、乙腈、乙酸乙酯對3種香精成分的提取效果。測定結(jié)果顯示，正己烷提取效果不達(dá)標(biāo)，說明未完全提取出來。而乙酸乙酯和乙腈的提取效果基本滿足要求，但因提取過程水的加入能提高香蘭素的提取效率，而乙酸乙酯與水不互溶，因此乙腈是比較理想的提取試劑。進(jìn)一步研究不同體積水浸潤后大米中3種香精成分用乙腈提取的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同體積的水對于提取效果影響不大，但顯著影響出峰時(shí)間。當(dāng)選擇加入10 mL乙腈-水（9∶1，V/V）提取樣品時(shí)，3種化合物的保留時(shí)間與對照品基本一致。

2.2.2 提取時(shí)間的選擇

考察以乙腈-水（9∶1，V/V）為提取溶劑，3種化合物在不同超聲處理時(shí)長下的提取效率。檢測結(jié)果顯示，隨著樣品在超聲波里面提取時(shí)間的延長，3種香精成分的提取效率呈逐漸增加趨勢，超聲處理20 min后提取效率變化不大，25 min后基本穩(wěn)定。因此，確定超聲時(shí)間為25 min，以保證目標(biāo)物質(zhì)得到充分的提取。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍

配制5～200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照1.3.3的儀器條件及優(yōu)化過的檢測方法進(jìn)行分析，以目標(biāo)組分的濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。香蘭素的線性方程為f(x)=77.466 090x-0.421 042，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0；甲基香蘭素的線性方程為f(x)=128.379 021x-97.084 251，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5；乙基香蘭素的線性方程為f(x)=147.775 496x-175.943 208，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；結(jié)果表明，3種香精成分在5～200 ng/mL線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)良好。

2.3.2 檢出限與定量限

稱取11份1 g空白基質(zhì)樣品，加入一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加乙腈-水（9∶1，V/V）提取10 mL后測定，檢出限為信噪比rSN≥3時(shí)的濃度，定量限為rSN≥10時(shí)的濃度。計(jì)算得香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的檢出限分別為5，2和3 μg/kg，定量限分別為15，6和9 μg/kg，均低于BJS 201705《食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的測定》規(guī)定的檢出限和定量限。

2.3.3 回收率及精密度

回收率考察及精密度試驗(yàn)通過向空白基質(zhì)樣品中添加目標(biāo)組分進(jìn)行測定，加標(biāo)水平選擇BJS 201705給定的檢出限、定量限及10倍檢出限，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測定6次，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果及精密度見表3。

2.4 樣品測定

GB 2760—2014中規(guī)定大米中不得添加香精成分香蘭素，BJS 201705方法中規(guī)定的3種香蘭素的檢出限為30 μg/kg，定量限為100 μg/kg。采用試驗(yàn)優(yōu)化過的方法對抽檢25個(gè)品種的大米樣品中的3種香精成分進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：25個(gè)樣品均有香蘭素成分的檢出，含量范圍為75.38～270.67 μg/kg，均高于檢出限；甲基香蘭素含量范圍為5.00～27.412 μg/kg，均低于檢出限；乙基香蘭素只有4個(gè)樣本有峰，含量范圍在16.10～22.17 μg/kg之間，均低于檢出限，其余樣本沒有出峰。試驗(yàn)檢測的25批大米中全部檢出香蘭素，其中檢出值大于100 μg/kg的樣本占76%，由于樣品是隨機(jī)購入，且分別來源于甘肅、黑龍江、陜西、江蘇、廣西以及巴基斯坦、泰國等多個(gè)產(chǎn)地，同時(shí)非法添加的可能性不大。因此，考慮內(nèi)源性可能性更大。有研究表明，米糠中含有大量香蘭素及其前體物質(zhì)阿魏酸，阿魏酸的C—C雙鍵結(jié)構(gòu)在氧化后即可成為香蘭素或通過生物轉(zhuǎn)化形成香蘭素[6-7]。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)建立一種液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢測大米中香蘭素類香精成分（包括香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素）含量的方法。該方法快捷高效、靈敏度非常高、重復(fù)性良好，能有效滿足大米中3種香精成分的快速測定。樣品測定結(jié)果顯示大米中內(nèi)源性香蘭素的存在，建議相關(guān)部門及時(shí)調(diào)整相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)限量值及監(jiān)管措施，以免誤判。