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        HPLC-MS/MS法測(cè)定調(diào)味粉中5種罌粟堿含量的不確定度評(píng)估

        2024-04-13 11:04:12于曉慧石夢(mèng)璇程鳳麗王曉
        食品工業(yè) 2024年3期
        關(guān)鍵詞:罌粟堿可待因移液器

        于曉慧 ,石夢(mèng)璇,程鳳麗,王曉

        1.山東特檢科技有限公司(濟(jì)南 250000);2.濟(jì)南富美特信息科技有限公司(濟(jì)南 250000)

        含有嗎啡、可待因等20多種生物堿的罌粟殼,國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局已明確禁止在食品中使用[1]。長(zhǎng)期食用,會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生很大的傷害,但是,一些商家為達(dá)到盈利目的,仍不擇手段,在一些調(diào)味粉和調(diào)味料中加入,能夠增加食物的美味,贏得消費(fèi)者的青睞[2]。當(dāng)前檢測(cè)嗎啡、可待因等生物堿含量的方法主要有高效液相法[3-5]、氣相色譜質(zhì)譜法[6-7]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8-11]、薄層色譜法[12]、氣相色譜法。用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因,具有靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,上機(jī)溶液不需要進(jìn)行衍生操作等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)選用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定調(diào)味粉中5種罌粟殼生物堿。

        不確定度的評(píng)定是保證試驗(yàn)分析過(guò)程準(zhǔn)確性和可靠性的重要手段[13-14],試驗(yàn)依據(jù)CNAS-GL006—2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》,建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定調(diào)味粉中的嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量的數(shù)學(xué)模型,分析在含量測(cè)定的整個(gè)過(guò)程中引入不確定度的分量和占比,得到對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果產(chǎn)生較大影響的因素,從而為在實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景中使用此方法的操作過(guò)程提供合理建議,同時(shí)提高調(diào)味粉中的嗎啡、可待因等5種罌粟殼生物堿測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,為評(píng)價(jià)檢驗(yàn)報(bào)告提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        LC-MS/MS 8045三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(島津公司);JA31002型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);BK-180J型超聲波清洗器(山東博科儀器有限公司);UMV-1型多管旋渦混合器(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司);KL04A型離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)。

        乙腈(色譜純,Thermo Fisher);實(shí)驗(yàn)室用水(一級(jí)水,屈臣氏);甲酸(色譜純,Thermo Fisher);調(diào)味粉(超市購(gòu)買(mǎi));5種罌粟殼生物堿標(biāo)準(zhǔn)品、可待因標(biāo)準(zhǔn)品(北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)。

        1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液

        精密移取1 mL嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因混標(biāo)對(duì)照品(其中嗎啡、可待因質(zhì)量濃度25 μg/mL,罌粟堿、那可丁和蒂巴因濃度5 μg/mL)于同一10 mL容量瓶中,加乙腈溶解并定容至刻度,搖勻,作為混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱避光保存,備用。

        1.2.2 同位素內(nèi)標(biāo)工作液(5 μg/mL)

        分別精密吸取嗎啡-D3同位素溶液和可待因-D3同位素對(duì)照品(50 μg/mL)各1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,配制成嗎啡-D3、可待因-D3濃度均為5.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

        精密移取20,40,80,160,400和800 μL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,分別精密加入同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液(5.0 μg/mL)40 μL,用乙腈定容至刻度,得到嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為5,10,20,50,100和200 ng/mL,罌粟堿、那可丁和蒂巴因質(zhì)量濃度為1,2,4,10,20和40 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度20 ng/mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        1.3 供試液的制備

        稱取2 g(精確至0.01 g)超市購(gòu)買(mǎi)的某品牌調(diào)味粉于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中,加入1~3 mL水,渦旋振蕩30 s,用移液管準(zhǔn)確加入15 mL乙腈,密塞,渦旋1 min,超聲處理30 min,取出,加入6 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g無(wú)水醋酸鈉的混合粉末,立即渦旋振蕩2 min,使吸附樣品中的全部水分,以4 000 r/min離心5 min,取上清液,以0.22 μm濾膜過(guò)濾,取濾液適量,進(jìn)樣,待測(cè)定。

        1.4 檢測(cè)方法

        1.4.1 色譜參考條件

        色譜柱Shim-pack GIST C1-AQ HP(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);儀器柱溫40 ℃;流動(dòng)相流速0.30 mL/min;儀器進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相A為0.1%甲酸水,B為乙腈。梯度洗脫條件:0.5~1.5 min,10%~70% B;1.5~3.5 min,70%~95% B;3.5~5.5 min,95% B;5.5~5.6 min,95%~10% B;5.6~8.0 min,10% B。

        1.4.2 質(zhì)譜條件

        離子源為電噴霧離子源;掃描方式為正離子掃描;采集方式MRM;離子源接口電壓+4.5 kV,-3.5 kV;碰撞氣為氬氣;離子傳輸管溫度250 ℃;接口溫度300 ℃;加熱模塊溫度400 ℃。表1為5種罌粟堿物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)。

        表1 化合物的質(zhì)譜參數(shù)

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不確定度分析

        2.1.1 數(shù)學(xué)模型調(diào)味粉中5種化合物含量計(jì)算模型如式(1)所示。

        式中:X為調(diào)味粉樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量,μg/kg;c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品質(zhì)量濃度,ng/mL,V為定容體積,mL;m為取樣量,g;

        2.1.2 識(shí)別和分析不確定度的來(lái)源

        如圖1所示,HPLC-MS/MS法測(cè)定調(diào)味粉中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量引入的不確定度主要包括稱量調(diào)味粉樣品引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度、調(diào)味粉樣品前處理引入的不確定度、樣品重復(fù)性試驗(yàn)、加標(biāo)回收試驗(yàn)、計(jì)算過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來(lái)的不確定度和SHIMADZU LC-MS/MS 8045三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀引入的不確定度。

        圖1 不確定度的來(lái)源分析圖

        2.2 分析不確定度分量評(píng)定

        2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(s)

        2.2.1.1 外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品純度引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(1)

        由嗎啡和可待因的標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)得,兩者擴(kuò)展不確定度為0.05 μg/mL,k=2;罌粟堿、那可丁和蒂巴因的標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)可得兩者擴(kuò)展不確定度為0.01 μg/mL,5種標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為urel(11)=0.05/(25×2)=0.001,urel(11)=0.01/(5×2)=0.001。

        2.2.1.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品純度引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(2)

        根據(jù)嗎啡-D3同位素溶液和可待因-D3同位素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)得,擴(kuò)展不確定度為3 μg/mL,k=2,則urel(21)=3/(50×2)=0.030,由內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

        2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液配制引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(3)

        在5種化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過(guò)程中所用玻璃器具引入的不確定度包含2個(gè)。一是溫度引起不確定度,配制嗎啡和可待因標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí),環(huán)境溫度為25 ℃,JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》檢定A級(jí)玻璃容器的溫度為20 ℃,所以這里考慮的是液體體積膨脹,配制過(guò)程中使用乙腈定容,乙腈的膨脹系數(shù)為0.001 37,按照均勻分布進(jìn)行計(jì)算,溫度引起液體體積變化產(chǎn)生的不確定度為其中V為玻璃器具的規(guī)格。二是玻璃器具區(qū)間半寬a產(chǎn)生的不確定度,按照均勻分布產(chǎn)生的不確定度標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)=u(V)/V,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V)=按照上述評(píng)定方法,在配制標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)配液過(guò)程使用到的A級(jí)玻璃容器有10 mL容量瓶2次和1 mL單線移液管2次,標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(3)結(jié)果為0.025 49,具體計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 器具引入的不確定度

        2.2.1.4 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(4)

        在系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的過(guò)程中用到20~200 μL移液器、100~1 000 μL移液器和10 mL容量瓶。以20~200 μL移液器為例,根據(jù)JJG646—2006《移液器檢定規(guī)程》規(guī)定,使用20~200 μL移液器,移取液體體積20 μL時(shí),最大容量允差為±20×2.0%,按照矩形分布,取K=則20~200 μL移液器(移取體積20 μL)容量允差產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.230 9 μL;已知乙腈的膨脹系數(shù)為0.001 37,實(shí)驗(yàn)室溫度為20±5 ℃,由溫度產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.079 1 μL,則由20~200 μL移液器(20 μL)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.011 55。

        配制該系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過(guò)程中使用6次10 mL容量瓶(A級(jí))、20~200 μL移液器10次和100~1 000 μL移液器2次,經(jīng)計(jì)算系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(4)結(jié)果為0.040 63,計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 移液器不同體積引入的不確定度

        2.2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(s)

        表2和表3顯示配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和系列標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí),所用到的玻璃器和移液器所引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為計(jì)算得到5種化合物由標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果,見(jiàn)表4。

        表3 移液器不同體積引入的不確定度

        表4 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

        2.2.2 樣品前處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(y)

        前處理過(guò)程中帶來(lái)的不確定度主要是由調(diào)味粉樣品的稱量引起的,稱量樣品使用的天平規(guī)格是萬(wàn)分之一,該天平的允許誤差是0.5 mg,按照均勻分布計(jì)算,樣品前處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

        2.2.3 樣品重復(fù)性試驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(f)

        稱取6份同一供空白試品,分別加入64 μL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、60 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液(5 μg/mL),在1.3的前處理?xiàng)l件下進(jìn)行提取供試液,在1.4的檢測(cè)條件下進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)公式計(jì)算,重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度為重復(fù)性試驗(yàn)引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

        表5 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度

        2.2.4 回收率試驗(yàn)引入過(guò)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(r)

        稱取同一本底空白調(diào)味粉試樣6份,分別加入64 μL的罌粟堿混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、60 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液(5 μg/mL),在1.3的前處理?xiàng)l件下進(jìn)行提取供試液,在1.4的檢測(cè)條件下進(jìn)行測(cè)定計(jì)算,得回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr,回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為結(jié)果見(jiàn)表6。

        表6 回收率試驗(yàn)引入的不確定度

        2.2.5 擬合曲線引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(l)

        標(biāo)準(zhǔn)曲線采用最小二乘法擬合,測(cè)定系列標(biāo)準(zhǔn)曲線級(jí)別為6,測(cè)定樣品次數(shù)6次,計(jì)算殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得樣品中含量過(guò)程所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算得5種罌粟殼類生物堿在標(biāo)線擬合過(guò)程中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,見(jiàn)表7。

        表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線合成引入的不確定度

        標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式中:SA為標(biāo)準(zhǔn)溶液殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差;n為標(biāo)點(diǎn)的個(gè)數(shù);p為測(cè)定樣品的次數(shù);c樣為測(cè)量樣品的濃度;為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液平均濃度;b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

        2.2.6 儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(i)

        由島津LC-MS/MS 8045三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀器的校準(zhǔn)證書(shū)可知,urel(i)為2%,按照均勻分布計(jì)算,k=2,得儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為urel(i)=2%/2=0.01。

        2.3 不確定度的合成和擴(kuò)展

        2.3.1 不確定度的合成

        根據(jù)得到的各個(gè)不確定度分量,對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成,公式為經(jīng)計(jì)算得到嗎啡等五種生物堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品不確定度分別為0.058 31,0.063 68,0.053 49,0.071 83和0.079 24。

        2.3.2 不確定度的擴(kuò)展

        取置信區(qū)間為95%(k=2),U=urel(x)×2x,計(jì)算得到調(diào)味粉中5種待測(cè)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度結(jié)果分別為8.96,9.72,1.69,2.27和2.49 μg/kg。

        2.3.3 結(jié)果表示

        通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定調(diào)味粉中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因,測(cè)定結(jié)果分別為76.87±8.96,76.35±9.72,15.77±1.69,15.78±2.27和15.71±2.49 μg/kg。

        3 結(jié)論

        通過(guò)對(duì)HPLC-MS/MS法測(cè)定調(diào)味粉中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因這5種罌粟堿化合物的含量測(cè)定進(jìn)行不確定度評(píng)估。結(jié)果顯示,在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中,比較各個(gè)分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度,影響比較大的是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。在實(shí)際的工作中,要求檢測(cè)人員優(yōu)化移取和定容的具體細(xì)節(jié),并且定期對(duì)試驗(yàn)人員進(jìn)行試驗(yàn)操作和基礎(chǔ)理論培訓(xùn),提高檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。通過(guò)不確定度的研究,可為調(diào)味粉中罌粟堿的檢測(cè)提供參考和借鑒。

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