張菊云，陳綿雄，華炳紅，蒙緒標(biāo)

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，海南?？?570208）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，其患病率逐年上升，嚴(yán)重影響人類生命和健康，也是終末期腎病的重要因素［1］，臨床上表現(xiàn)為持續(xù)存在白蛋白尿和腎小球濾過率進行性下降［2］。腎小球是由內(nèi)皮細胞、足細胞和系膜細胞組成的緊密毛細血管簇［3］，其中在DN 中腎小球內(nèi)皮細胞表現(xiàn)為細胞增殖增加、內(nèi)皮完整性破壞、血管生成不成熟和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化增加等［4-5］。有研究表明，腎小球內(nèi)皮細胞增殖和血管生成在DN 早期促進腎小球肥大。此外，一些抗血管生成藥物可改善腎小球肥大和高濾過以及DN 早期的白蛋白尿排泄，提示腎小球血管生成可能是DN 早期病理事件的原因［6-7］，因此抑制腎小球內(nèi)皮細胞血管生成將可能成為治療DN的有效途徑。

石斛（Dendrobii Caulis）是中醫(yī)常用的滋補藥材，用于益胃生津、潤肺補腎和改善視力等［8］。毛蘭素（erianin）是石斛中主要存在的聯(lián)芐基化合物，可抑制癌細胞侵襲、遷移和血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。研究表明，毛蘭素可通過抑制活性氧/絲裂原活化蛋白激酶/NF-κB（reactive oxygen species/mitogen-activated protein kinases/NF-κB，ROS/MAPK/NF-κB）信號通路來阻止高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞功能障礙［10］，腎小管上皮細胞和腎小球內(nèi)皮細胞均為構(gòu)成腎單位的重要細胞類型，但毛蘭素對DN中腎小球內(nèi)皮細胞血管生成的影響尚未闡明。

slit 同源蛋白2（slit homolog 2 protein，Slit2）主要表達于血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，通過與不同的軸突導(dǎo)向受體蛋白（roundabout homolog，Robo）受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。Robo1 是Robo 家族成員之一［11-12］。研究報道，抑制Robo1 表達可通過抑制腎小球內(nèi)皮細胞血管內(nèi)皮生長因子表達而抑制血管生成，其可能是抑制早期DN 異常血管生成的有效靶點［13］。Slit2/Robo1 信號通路參與血管新生的調(diào)控，該通路激活可促進腎小球血管形成和腎單位發(fā)育［14］，促進早期DN 腎小球血管新生［15］。因此提示，抑制Slit2/Robo1 信號通路可能減輕DN 模型大鼠腎小球內(nèi)皮細胞血管生成。本研究制備DN模型大鼠，研究毛蘭素對DN 模型大鼠腎小球內(nèi)皮細胞血管生成的影響以及Slit2/Robo1 信號通路的作用，為DN 治療提供新靶點，并為毛蘭素作為DN的候選治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

毛蘭素（批號：HY-N0517），美國MCE 公司，用0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（批號：S0130），美國Sigma公司；尿蛋白定量試劑盒（批號：C035-2-1），南京建成生物工程研究所；過碘酸雪夫氏（periodic acidsciff，PAS）染色試劑盒（批號：C0142S）和RIPA 裂解液（批號：R0010），北京索萊寶科技公司；小鼠抗人血小板內(nèi)皮細胞黏附分子31（platelet endothelial cell adhesion molecule-31，CD31）抗體（批號：3528S）、兔抗人Slit2 單克隆抗體（批號：47600S）、兔抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（批號：5174S）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔lgG 抗體（批號：7074S）和HRP 標(biāo)記的馬抗小鼠lgG 抗體（批號：7076S），美國CST公司；兔抗人Robo1多克隆抗體（批號：ab7279），英國Abcam 公司；小鼠抗人足細胞標(biāo)志蛋白（podocalyxin，PCX）抗體（批號：39-3800），美國Thermo Fisher 公司。Catalyst One?全自動生化分析儀，美國IDEXX 公司；DM2500 熒光顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。

1.2 動物、模型制備和分組

55 只雄性SPF 級SD 大鼠，體重180～200 g，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司桐鄉(xiāng)分公司，動物許可證號：SCXK（浙）2021-0006。大鼠飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，濕度50%～70%，并在12 h/12 h光暗循環(huán)的房間中自由攝食飲水。本研究經(jīng)海口市人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：2021034。

大鼠適應(yīng)性飼喂7 d 后，隨機分為正常對照組10 只和模型組45 只。模型組每天飼喂高糖高脂飼料（由10%豬油、10%蔗糖、5%蛋白粉、1%膽固醇和10%普通飼料組成）持續(xù)56 d（8周），正常對照組飼喂正常飼料。8周后，模型大鼠禁食12 h，ip給予由枸櫞酸緩沖液稀釋的1%STZ注射液（35 mg·kg-1），正常對照組ip 給予等體積枸櫞酸緩沖液。7 d 后測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）和24 h尿蛋白，F(xiàn)PG≥16.7 mmol·L-1且24 h 尿蛋白＞20 mg，視為DN 大鼠模型制備成功［16］。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1（ig，持續(xù)8 周）［17］，每組10 只。正常對照組和模型組每日ig 給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，持續(xù)8周。

1.3 樣本制備

給藥8 周后，留取大鼠24 h 尿液，1000×g離心5 min 取上清，用于尿蛋白檢測。大鼠尾靜脈采血，4 ℃，1500×g離心10 min 獲得血清，置于-80 ℃冰箱備用。采血結(jié)束后，處死大鼠，取腎。一部分腎組織用4%多聚甲醛固定；另一部分暫存于-80 ℃，用于Western 印跡實驗。

1.4 尿蛋白定量試劑盒檢測大鼠24 h尿蛋白水平

取1.3 制備的24 h 尿液上清，按照尿蛋白定量試劑盒說明操作，檢測24 h尿蛋白。

1.5 全自動生化分析儀檢測大鼠血清FPG 和血肌酐（serum creatinine，Scr）水平

取1.3 制備的血清樣本，全自動生化分析儀測定各組大鼠血清FPG和Scr水平。

1.6 PAS染色觀察大鼠腎組織病理變化

取1.3制備的經(jīng)4%多聚甲醛固定的腎組織，固定48 h 后依次進行脫水、包埋、制備4 μm 厚切片。根據(jù)PAS 染色試劑盒說明將切片進行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化。

1.7 免疫熒光法檢測大鼠腎組織CD31 和PCX 蛋白表達

取1.6 制備的石蠟切片，進行抗原修復(fù)，放入3%雙氧水溶液，血清封閉，加入一抗（1∶800）（抗CD31 或抗PCX 抗體），4 ℃過夜孵育，加入HRP 標(biāo)記二抗（1∶4000），37 ℃孵育1 h，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，復(fù)染，封片，熒光顯微鏡下觀察和拍照。紅色表示CD31表達，綠色表示PCX 表達。每組選3 張切片使用Image J軟件分析熒光強度，用熒光強度表示CD31和PCX蛋白相對表達水平。

1.8 Western印跡法檢測大鼠腎組織Slit2和Robo1蛋白表達

取1.3 中暫存于-70 ℃的腎組織，剪成小碎塊加入RIPA 裂解液，提取蛋白，BCA 法定量蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳封閉2 h，一抗（Slit2，1∶1000；Robo1，1∶1000；GAPDH，1∶1000）4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗（1∶1000）1 h，ECL 曝光。用Image Lab?軟件分析蛋白條帶積分吸光度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，用Graphpad Prism7.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠血清FPG 和Scr水平及尿液中24 h尿蛋白水平的影響

表1 結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠FPG、Scr和24 h尿蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+毛蘭素10，20和40 mg·kg-1組大鼠FPG、Scr和24 h尿蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of erianin on fasting plasma glucose（FPG），serum creatinine（Scr）and 24 h urine protein levels in urine of diabetic nephropathy（DN）model rats

2.2 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織病理變化的影響

圖1 結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常；模型組可見許多新生腎小球毛細血管，并出現(xiàn)腎小球肥大和系膜面積擴張；模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠新增腎小球毛細血管、腎小球肥大和系膜面積擴張現(xiàn)象減輕。

Fig.1 Effect of erianin on pathological changes in renal tissue of DN model rats（HE staining，×400）. See Tab.1 for the rat treatment. Black arrows show neoplastic glomerular capillaries while red ones show glomerular hypertrophy and expansion of the tethered membrane area.

2.3 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中CD31表達的影響

圖2結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠CD31 在腎小球內(nèi)皮中表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠CD31在腎小球內(nèi)皮中表達減少（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中CD31和PCX共表達的影響

圖3 結(jié)果顯示，正常對照組CD31 染色管狀區(qū)域和相鄰的PCX 染色程度相當(dāng)；模型組大鼠存在非管狀CD31 染色，缺少相鄰PCX 染色，以及部分CD31 管狀區(qū)域染色也缺乏相鄰的PCX 染色；模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠CD31 管狀區(qū)域染色與PCX足細胞區(qū)域染色基本相鄰。

Fig.3 Effect of erianin on CD31 and podocalyxin（PCX）co-expression in renal tissue of DN model rats（×1000）.See Tab.1 for the rat treatment.Cells stained red were CD31 positive and cells stained green were PCX positive.

2.5 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織Slit2 和Robo1蛋白表達的影響

圖4結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織Slit2和Robo1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠腎組織Slit2 和Robo1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of erianin on expressions of slit homolog 2 protein（Slit2）and roundabout homolog1（Robo1）proteins in renal tissue of DN model rats by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，DN 模型大鼠出現(xiàn)早期DN 的特征性變化，如多食多尿、白蛋白尿排泄增加和腎小球肥大；毛蘭素可顯著抑制DN 模型大鼠FPG、Scr 和24 h 尿蛋白水平，減輕腎小球肥大和系膜面積擴張，表明毛蘭素在DN 中具有腎保護作用。免疫熒光染色結(jié)果顯示，DN 模型大鼠腎小球內(nèi)皮CD31 顯著增加，毛蘭素可下調(diào)CD31 表達。內(nèi)皮細胞CD31 染色和足細胞PCX 染色的雙重標(biāo)記結(jié)果顯示，DN 模型大鼠存在非管狀CD31 染色，缺少相鄰PCX 染色，一些CD31 管狀區(qū)域也缺乏相鄰的PCX 染色，這2 種類型的腎小球血管在結(jié)構(gòu)上顯示出腎小球血管發(fā)育不成熟；毛蘭素可顯著改善該現(xiàn)象，表現(xiàn)為大多數(shù)CD31 內(nèi)皮區(qū)域染色與PCX 足細胞區(qū)域染色相鄰，提示毛蘭素可抑制DN 模型大鼠腎小球內(nèi)皮細胞血管生成，減少不成熟血管的生成，從而減少蛋白尿產(chǎn)生。

研究報道，Slit2/Robo1信號通路在血管生成中發(fā)揮作用［18］。Slit2 通過Robo1 和Robo2 介導(dǎo)促進內(nèi)皮細胞遷移，在小鼠出生后視網(wǎng)膜和眼部新生血管疾病模型中有選擇地促進血管生成，推測抑制Slit2 可能用于抑制眼部新生血管疾病患者的血管生成［19］。另有研究報道，Slit2/Robo1信號通路參與暴露于糖尿病樣環(huán)境的腎小球內(nèi)皮細胞的血管生成［10］，從而推測毛蘭素可能通過抑制Slit2/Robo1信號通路而抑制腎小球內(nèi)皮細胞血管生成。本研究結(jié)果表明，DN 模型大鼠腎組織中Slit2 和Robo1蛋白表達顯著升高，毛蘭素顯著降低DN 模型大鼠腎組織中Slit2和Robo1蛋白表達，提示毛蘭素可能通過抑制Slit2/Robo1 信號通路從而抑制DN 模型大鼠腎小球內(nèi)皮細胞血管生成。

綜上所述，本研究表明，DN 早期出現(xiàn)過度的腎小球內(nèi)皮細胞增殖和血管生成，這種現(xiàn)象導(dǎo)致新形成的腎小球毛細血管可能是有缺陷的未成熟血管，結(jié)構(gòu)缺陷導(dǎo)致這些血管的通透性增加，并可能導(dǎo)致白蛋白尿。毛蘭素可能通過抑制Slit2/Robo1 信號通路而抑制DN 模型大鼠腎小球內(nèi)皮細胞血管生成，推測毛蘭素對DN 腎小球內(nèi)皮細胞增殖和新生血管形成有治療作用。但本研究尚存在不足之處，僅探究信號通路中Slit2 和Robo1 蛋白表達，未進一步檢測該通路上下游相關(guān)蛋白表達。后續(xù)將通過檢測該通路上下游蛋白表達，并增加功能實驗進一步研究Slit2/Robo1信號通路在毛蘭素抑制腎小球內(nèi)皮細胞血管生成中的作用，以闡明毛蘭素的作用機制。