唐 悅,葛曉明,單 廷

江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院普外科,江蘇無錫 214000

胃癌為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,多發(fā)于40歲以上中老年人群。胃癌的治療手段主要根據(jù)病情發(fā)展階段而定,手術(shù)和藥物相結(jié)合的治療方式能明顯提高早期胃癌患者生存率。轉(zhuǎn)移期胃癌一般使用抗菌藥物和細(xì)胞毒性化合物(如5-氟尿嘧啶)等化療藥物進(jìn)行治療,但由于化療藥物的耐藥性和胃癌的易復(fù)發(fā)性,不能明顯延長胃癌患者生存期。因此,尋找診斷和治療胃癌的有效手段具有重要意義[1-2]。阿奇霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物,廣泛應(yīng)用于治療細(xì)菌感染和炎癥,具有療效快、作用強(qiáng)及不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[3]。近年的研究發(fā)現(xiàn),阿奇霉素具有抗菌和抗腫瘤作用:不僅可通過阻斷病原菌的轉(zhuǎn)肽過程治療急性胃炎,還可通過促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡,達(dá)到治療肺癌的目的[4]。但關(guān)于阿奇霉素調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能和影響胃癌惡性進(jìn)程的相關(guān)報(bào)道較少。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路普遍存在于細(xì)胞中,在調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程中起重要作用[5]。有研究顯示,黨參多糖通過抑制NF-κB信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和抑制增殖[6]。另有研究顯示,阿奇霉素通過抑制NF-κB通路活性對哮喘患者具有一定治療作用[7]。本研究探討阿奇霉素對人胃癌細(xì)胞(AGS細(xì)胞)上清液中炎癥因子水平及增殖和凋亡的影響,分析NF-κB信號通路在其中的調(diào)控作用,旨在為胃癌的治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 AGS細(xì)胞購于上海致備生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑 使用的主要儀器包括CO2培養(yǎng)箱(深圳市瑞沃德生物科技有限公司,型號:D180),倒置熒光顯微鏡(上海無陌光學(xué)儀器有限公司,型號:WMS-1033),酶標(biāo)儀(美國Billerica公司,型號:Multiskan Ascent),凝膠成像系統(tǒng)(廣州科適特科學(xué)儀器有限公司,型號:GD-1000),低溫高速離心機(jī)(山東博科醫(yī)用材料有限公司,型號:TGL-16M)等。使用的主要試劑包括阿奇霉素、5-氟尿嘧啶[8](上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%),NF-κB通路抑制劑BAY11-7082[9]、激活劑Prostratin[10](美國MCE公司,純度≥98%),4%多聚甲醛、3%牛血清白蛋白溶液(BSA,上海源葉生物科技有限公司),TritonX-100(北京北京伊塔生物科技有限公司),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8,上海炎煕生物有限公司),胎牛血清(FBS)、F12K培養(yǎng)基(美國Gibco公司),5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),Hoechst33258染色試劑盒(北京蘭博利德有限公司),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海初態(tài)生物有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒(英國Abcam公司),鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、NF-κB p65、磷酸化(p)-NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白(IκBα)、p-IκBα、β-actin一抗、山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(英國Abcam公司)。

1.3方法

1.3.1AGS細(xì)胞培養(yǎng) AGS細(xì)胞接種于F12K培養(yǎng)基(含10% FBS)中培養(yǎng)(37 ℃,5%CO2),70%～80%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),換液間隔天數(shù):2～3 d,傳代(密度達(dá)80%)后用于研究(對數(shù)期細(xì)胞)。

1.3.2分組與干預(yù) 將AGS細(xì)胞(密度:2×105個(gè)/mL)分為對照組和不同水平阿奇霉素組。對照組不進(jìn)行干預(yù),不同水平阿奇霉素組分別加12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL阿奇霉素,干預(yù)24 h。用CCK-8檢測細(xì)胞活力,篩選最適水平用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組:對照組、阿奇霉素組、陽性藥物組、抑制劑組和激活劑組。阿奇霉素組:加入50.0 μg/mL阿奇霉素;陽性藥物組:加入50.0 μg/mL 5-氟尿嘧啶;抑制劑組:在50.0 μg/mL阿奇霉素的基礎(chǔ)上加入1.0 μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY11-7082;激活劑組:在50.0 μg/mL阿奇霉素基礎(chǔ)上加入1.0 μmol/L NF-κB通路激活劑Prostratin。每組設(shè)3次重復(fù),置培養(yǎng)箱,37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3.3CCK-8測定AGS細(xì)胞活力 取24 h細(xì)胞,參照CCK-8說明書進(jìn)行操作,反應(yīng)完成后檢測各孔吸光度(A)值(450 nm處),計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力為各水平阿奇霉素組A值與對照組A值的百分比。

1.3.4ELISA測定AGS細(xì)胞上清液中的炎癥因子水平 取各組細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說明書測定細(xì)胞上清液中的炎癥因子[白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)]水平。

1.3.5EdU法測定AGS細(xì)胞的增殖率 取培養(yǎng)24 h的細(xì)胞,具體步驟參照EdU說明書操作處理,處理完成后裝片、拍照(熒光顯微鏡)、處理圖片(Image-J 1.8.0軟件)。紅色細(xì)胞占藍(lán)色細(xì)胞的百分比即為增殖率。

1.3.6Hoechst33258法測定AGS細(xì)胞凋亡率 用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次(5分/次),固定(0.5 mL,4%多聚甲醛)10 min。PBS清洗3次(5分/次),染色(Hoechst33258染色液,5 mg/L)10 min,PBS清洗3次(5分/次),封固后觀察(熒光顯微鏡),拍照(隨機(jī)3個(gè)視野),計(jì)算凋亡率(Image-J軟件)。正常細(xì)胞:細(xì)胞核為淡藍(lán)色,形態(tài)清晰;凋亡細(xì)胞:細(xì)胞核染色不均,亮藍(lán)色,熒光較強(qiáng)。凋亡率為凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.3.7蛋白免疫印跡(WB)法檢測AGS細(xì)胞中PCNA、Caspase-3和NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平 收集處理后的細(xì)胞,在冰上裂解并收集上清液。提取蛋白進(jìn)行定量,上樣后進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白,后經(jīng)聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)印電泳、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膜顯色。在凝膠成像系統(tǒng)上采集蛋白條帶并用系統(tǒng)配備的分析軟件進(jìn)行蛋白灰度值(G)分析。以β-actin為內(nèi)參,蛋白表達(dá)水平為目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的比值。p-NF-κB p65/NF-κB p65為p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平與NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的比值,p-IκBα/IκBα為p-IκBα蛋白表達(dá)水平與IκBα蛋白表達(dá)水平的比值。

2 結(jié) 果

2.1阿奇霉素對AGS細(xì)胞活力的影響 對照組,以及12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL阿奇霉素組的細(xì)胞活力分別為(100.63±5.72)%、(92.93±2.02)%、(88.80±4.04)%、(69.43±4.85)%、(70.94±3.97)%。不同水平(12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL)阿奇霉素組較對照組AGS細(xì)胞活力降低,但在12.5 μg/mL時(shí)的細(xì)胞活力比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而在25.0、50.0、100.0 μg/mL的細(xì)胞活力比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中AGS細(xì)胞活力在50.0 μg/mL的阿奇霉素處理后的抑制效果最好,所以選擇50.0 μg/mL阿奇霉素作為最適水平用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2各組AGS細(xì)胞上清液中的炎癥因子水平比較 與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組細(xì)胞上清液中的IL-1β水平下降(P<0.05),IL-10水平上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組IL-1β水平下降(P<0.05),IL-10水平上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,激活劑組AGS細(xì)胞IL-1β水平上升(P<0.05),IL-10水平下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組AGS細(xì)胞炎癥因子水平比較

2.3各組AGS細(xì)胞增殖能力比較 對照組、阿奇霉素組、陽性藥物組、抑制劑組、激活劑組的AGS細(xì)胞增殖率分別為(32.75±2.32)%、(16.78±0.75)%、(16.05±0.36)%、(7.82±1.43)%、(30.20±2.18)%。結(jié)果顯示,與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組AGS細(xì)胞增殖率下降(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組AGS細(xì)胞增殖率下降(P<0.05),激活劑組AGS細(xì)胞增殖率上升(P<0.05)。見圖1。

圖1 EdU法檢測AGS細(xì)胞增殖能力(×20)

2.4各組AGS細(xì)胞凋亡能力比較 對照組、阿奇霉素組、陽性藥物組、抑制劑組、激活劑組的AGS細(xì)胞凋亡率分別為(3.62±0.15)%、(10.58±0.65)%、(11.37±0.97)%、(23.16±1.72)%、(5.05±0.52)%。對照組:細(xì)胞大小均勻、形態(tài)清晰、彌散均勻,細(xì)胞核呈淡藍(lán)色;其他各實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞核呈亮藍(lán)色、染色不均、體積濃縮/變小,熒光較強(qiáng)。量化后發(fā)現(xiàn),與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組AGS細(xì)胞凋亡率上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組AGS細(xì)胞凋亡顯著上升(P<0.05),而激活劑組AGS細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05)。見圖2。

圖2 Hoechst 33258染色法測定AGS細(xì)胞凋亡情況(×20)

2.5各組AGS細(xì)胞PCNA和Caspase-3表達(dá)水平比較 與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組AGS細(xì)胞PCNA表達(dá)水平下降(P<0.05),而Caspase-3表達(dá)水平上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組AGS細(xì)胞PCNA表達(dá)水平下降(P<0.05),而Caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05),而激活劑組AGS細(xì)胞PCNA表達(dá)水平上升(P<0.05),Caspase-3表達(dá)水平下降(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 WB法檢測AGS細(xì)胞PCNA和Caspase-3表達(dá)情況

表2 各組AGS細(xì)胞PCNA和Caspase-3表達(dá)水平比較

2.6各組AGS細(xì)胞NF-κB通路蛋白比較 與對照組比較,阿奇霉素組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα下降(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα下降(P<0.05),而激活劑組則與抑制劑組趨勢相反(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 WB法檢測AGS細(xì)胞NF-κB通路蛋白表達(dá)情況

表3 各組AGS細(xì)胞NF-κB通路蛋白比較

3 討 論

胃癌是病死率較高的惡性腫瘤之一,但無特征性臨床癥狀,確診時(shí)患者往往已進(jìn)入胃癌進(jìn)展期,且目前尚無有效的診斷和治療手段。胃癌的發(fā)生是多種因素相互作用的結(jié)果,深入研究胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,尋找治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)[11-12]。阿奇霉素是新近發(fā)現(xiàn)的大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物,早期主要用于治療細(xì)菌感染,可在細(xì)胞中累積并緩慢釋放,相較于其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物,具有更高的局部濃度和更長的半衰期,且不良反應(yīng)少,因此成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。近年來,阿奇霉素在抗腫瘤方面的作用越來越被人們關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn),阿奇霉素能抑制淋巴癌[13]和結(jié)腸癌[14]等腫瘤的惡性進(jìn)程。阿奇霉素通過其抗炎作用對小兒胃炎有一定治療效果[15]。但阿奇霉素對胃癌細(xì)胞的影響尚不清楚?；诖?本研究利用不同水平(12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL)阿奇霉素干預(yù)AGS細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),25.0、50.0、100.0 μg/mL阿奇霉素組AGS細(xì)胞活力明顯低于對照組,其中50.0 μg/mL阿奇霉素組細(xì)胞活力最低,效果最好,因此選擇50.0 μg/mL阿奇霉素為最適水平用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),與既往研究[13]結(jié)果相符,有一定的參考價(jià)值。為了進(jìn)一步研究阿奇霉素對AGS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,本研究探討了阿奇霉素對炎癥細(xì)胞因子、AGS細(xì)胞增殖與凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿奇霉素干預(yù)后,IL-1β水平、AGS細(xì)胞增殖率和增殖標(biāo)志物PCNA表達(dá)水平下降,而IL-10水平、凋亡率和凋亡標(biāo)志物Caspase-3表達(dá)水平上升,提示阿奇霉素可抑制AGS細(xì)胞炎癥,并誘導(dǎo)其凋亡、抑制增殖,有良好的研究及開發(fā)前景。

NF-κB屬于二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族,生理狀態(tài)下以NF-κB和IκBα二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中參與細(xì)胞的炎癥、增殖和凋亡等生物學(xué)過程。其異常激活后,NF-κB和IκBα二聚體在蛋白磷酸化酶的參與下發(fā)生磷酸化,二聚體NF-κB和IκBα解離,NF-κB迅速進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[16]。研究發(fā)現(xiàn),相關(guān)受體結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸激酶2通過下調(diào)p-NF-κB和p-IκBα的表達(dá)水平,抑制NF-κB信號通路活性,減緩裸鼠胃癌的發(fā)展進(jìn)程[17]。另有研究證實(shí)能夠通過NF-κB信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡[18]。趙朝華等[19]報(bào)道顯示,阿奇霉素不僅可以通過抑制NF-κB通路活性改善慢性阻塞性肺模型大鼠肺臟組織形態(tài)和纖維化,還可以通過抑制NF-κB信號通路促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化[20]。但是阿奇霉素是否可通過調(diào)控NF-κB信號通路改變胃癌的發(fā)展進(jìn)程尚不十分明確。因此,本研究分析了各實(shí)驗(yàn)組AGS細(xì)胞NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿奇霉素降低了p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα,說明阿奇霉素能明顯抑制NF-κB信號通路活性。在阿奇霉素的基礎(chǔ)上分別加入BAY11-7082和Prostratin后,BAY11-7082增強(qiáng)了阿奇霉素對AGS細(xì)胞的作用,Prostratin則明顯減弱了阿奇霉素對AGS細(xì)胞的作用。

綜上所述,阿奇霉素通過阻滯NF-κB通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制AGS細(xì)胞炎癥和增殖,并誘導(dǎo)其凋亡。但是本研究僅從細(xì)胞層面研究了阿奇霉素對AGS細(xì)胞的影響,下一步可從體內(nèi)水平研究阿奇霉素對胃癌的作用,為胃癌的相關(guān)治療提供更有利的參考。