廖 川,梁麗娜,黃少宇,馬夢霞,李雪斌 綜述,韋貴將△ 審校

1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心/廣西高校高發(fā)病臨床分子診斷研究重點實驗室/百色市高發(fā)病臨床分子診斷與研發(fā)重點實驗室,廣西百色 533000;2.廣西壯族自治區(qū)田東縣人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,廣西百色 533000;3.右江民族醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院,廣西百色 533000;4.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科,廣西百色 533000

病原微生物是指能夠引起人和動物疾病的微小生物,對人類健康具有極大的威脅。臨床上很多常見疾病都是病原微生物感染導致的,如各種病毒性肝炎、結核病、新型冠狀病毒感染等,這類疾病通常都具有一定的傳染性,有的甚至可以造成世界范圍的大流行。因此,臨床迫切需要一種能夠準確、高效、快速、簡便地識別相關病原體的檢測方法。

隨著分子生物學研究的不斷深入,核酸擴增技術在診斷領域的應用越來越廣泛。其中最具代表性的是聚合酶鏈反應(PCR),它能在短時間內對靶標完成指數(shù)級擴增,且具有較高的靈敏度和特異度[1],因此很多病原微生物檢測都將其作為診斷的參考標準。然而,PCR需要經(jīng)歷變溫過程,對設備和操作者要求較高,從而導致其在欠發(fā)達地區(qū)和現(xiàn)場實施檢測上的應用受到一定的限制。而等溫擴增技術的出現(xiàn)就很好地解決了這一問題,該技術在恒定溫度下即可完成擴增反應,擺脫了對高精密熱循環(huán)儀的依賴,有望取代PCR在診斷領域的地位。環(huán)介導等溫擴增(LAMP)是由日本榮研株式會社NOTOMI等[2]于2000年研發(fā),是一種較為成熟的等溫擴增法,具有高效、快速、靈敏度高、特異性度強等優(yōu)點,因此被應用于醫(yī)學領域中細菌、病毒、寄生蟲的檢測[3-4]。

1 LAMP的反應原理與特點

1.1LAMP的反應原理 LAMP的擴增過程可以分為兩個階段,即起始階段和擴增循環(huán)階段[2],擴增完成后可與多種技術相結合實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的檢測,不同的技術有不同的檢測原理,如試紙條法、熒光法等,本文主要講述LAMP的擴增原理。在擴增的過程中需要引物的參與,和其他擴增方法不同的是,LAMP需要設計2對引物,即內部引物(FIP/BIP)和外部引物(F3/B3),通過這兩對引物對靶基因的6個不同區(qū)域(F1-F1c、F2-F2c、F3-F3c、B1-B1c、B2-B2c、B3-B3c)特異性識別,因此LAMP具有極強的特異性。

在起始階段,當溫度達到60～65 ℃時,雙鏈DNA處于解旋與結合的不穩(wěn)態(tài),其中上游內部引物FIP中的F2序列區(qū)段首先與模板目標區(qū)段的單鏈DNA中的F2c結合,在Bst DNA聚合酶的作用下自F2的3′末端延伸啟動鏈置換DNA合成。外引物F3則與模板F3c結合并延伸,置換出由FIP鏈接的互補單鏈DNA,此單鏈的F1c與F1區(qū)段為互補結構,可通過自我堿基配對形成環(huán)狀結構。以上述步驟中合成的5′端以莖環(huán)狀結構的單聯(lián)DNA為模板,下游內部引物BIP的B2序列區(qū)段與單鏈DNA模板的B2c結合,在Bst DNA聚合酶的作用下啟動鏈置換反應,自B2的3′末端開始延伸合成DNA。外引物B3則與模板B3c結合并延伸,置換出由BIP鏈接的互補單鏈DNA,此單鏈的F1與F1c區(qū)段互補,B1c與B1區(qū)段互補,形成啞鈴狀結構的單鏈DNA。啞鈴狀結構以3′末端的F1區(qū)段為起點,以自身為模板進行DNA合成。由此,啞鈴狀結構轉變?yōu)榍o環(huán)狀結構,LAMP擴增進入循環(huán)階段。循環(huán)階段以起始階段形成的單鏈DNA為模板,在內部引物與Bst DNA聚合酶的作用下,反復進行延伸和鏈置換反應,最終產(chǎn)生大量具有多個靶標反向重復序列的莖環(huán)DNA結構[2]。

1.2LAMP的特點 LAMP不需要進行高溫變性,整個過程在60～65 ℃反應60 min即可完成。與其他核酸擴增法相比,LAMP具有更高的特異性和抗干擾性,因為它是通過2對引物特異性識別靶基因上的6個不同區(qū)域來啟動反應。此外,LAMP的靈敏度也很高,能夠在短時間內擴增出1×107～1×1010數(shù)量級的產(chǎn)物,比常規(guī)PCR高100倍左右[5],有報道指出LAMP最低可檢測10個基因拷貝或更低的檢測限[6]。而且LAMP對設備要求不高,一般的水浴鍋即可滿足需求。因此,LAMP具有高效、靈敏度高、特異性強、簡便等優(yōu)點。當然,LAMP也有其不足之處:首先,LAMP反應需要2對引物參與,因此對引物設計要求較高,如果引物設計不合理,就可能產(chǎn)生非特異性擴增片段影響結果的正確性。其次,由于LAMP的靈敏度很高,在反應過程中易產(chǎn)生氣溶膠污染,導致假陽性結果。最后,由于LAMP的擴增產(chǎn)物是長短不一且含有大量莖環(huán)結構的DNA雙鏈,因此很難對其擴增產(chǎn)物進行定量分析。

2 LAMP技術在病原微生物臨床檢測中的應用

目前,臨床上對于病原微生物感染的診斷方法主要有培養(yǎng)法、血清學方法及PCR。但這些方法都有其不足之處:培養(yǎng)法耗時較長;血清學方法特異度不高,易產(chǎn)生假陽性結果;PCR對設備和實驗環(huán)境要求較高。而LAMP因其具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點,有望取代傳統(tǒng)技術在病原微生物檢測中的地位。

2.1LAMP技術在新型冠狀病毒檢測中的應用 新型冠狀病毒感染者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽,嚴重者會休克甚至死亡。雖然目前已經(jīng)上市了大量的疫苗,但對新型冠狀病毒快速、準確、高效地診斷仍然是疫情防控的關鍵。實時反轉錄PCR因具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點,被視為診斷新型冠狀病毒感染的金標準[7],但它耗時較長,而且對設備和操作人員的要求也較高,因此在資源匱乏地區(qū)和現(xiàn)場實時檢測新型冠狀病毒的應用方面受到一定的限制。LAMP作為一種恒溫擴增法,不僅操作簡便,而且其靈敏度不低于反轉錄PCR[8],因此LAMP可以作為反轉錄PCR的替代方法以彌補其不足之處。目前,已經(jīng)有大量基于LAMP的試劑盒被用于新型冠狀病毒的檢測,Eiken公司開發(fā)的LoopampTM新型冠狀病毒檢測試劑盒基于N基因和RdRp基因設計,通過測量反應體系濁度確定檢測結果。為了評估LoopampTM新型冠狀病毒檢測試劑盒的有效性,YAN等[9]用該試劑盒檢測新型冠狀病毒,并使用LA-200濁度計對擴增產(chǎn)物進行實時檢測,結果表明該反應能夠在35 min內檢測到水平為10 copy/μL的RNA。HUANG等[4]針對新型冠狀病毒的ORF1ab、S、N基因,將比色法與LAMP結合用于檢測新型冠狀病毒,該方法僅需30 min即可完成檢測,通過肉眼判讀結果,無須精密儀器,且靈敏度可達80 copy/μL。此外,LAMP還可以和熒光檢測[10]、微流控[11]等技術結合用于檢測新型冠狀病毒。這些方法的建立為新型冠狀病毒快速、準確、高效地檢測提供了新的思路,也為疫情防控做出了重大貢獻。

2.2LAMP技術在結核分枝桿菌檢測中的應用 結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌。2020年世界衛(wèi)生組織(WHO)報告顯示,我國結核感染人數(shù)位居世界第3位[12]。早期診斷并給予恰當?shù)闹委熓强刂平Y核病傳播的關鍵,因此,臨床迫切需要尋找一種快速、準確、簡單的檢測方法。

LAMP能在60～65 ℃的條件下對結核分枝桿菌進行快速檢測,1 h即可完成試驗[13]。賈楓等[14]通過臨床試驗對比了抗酸染色法、LAMP法和改良羅氏培養(yǎng)法檢測痰標本中結核分枝桿菌的陽性率、靈敏度和特異度。結果表明LAMP法在結核分枝桿菌的診斷中具有快速、靈敏等優(yōu)點。此外,LAMP對于一些罕見的肺外結核病的診斷也具有很高的價值。KHAN等[15]以mpt64和pstS1為靶點,建立了多靶點LAMP檢測骨關節(jié)結核患者結核分枝桿菌的方法,結果表明多靶點LAMP在骨關節(jié)結核總病例中的靈敏度顯著高于多重PCR和GeneXpert。SHARMA等[16]采用IS6110和MPB64靶點對35例臨床疑似胃腸道結核患者的回盲活檢標本和30例非結核對照者的回盲活檢標本進行結核分枝桿菌復合體LAMP檢測。結果表明,LAMP檢測胃腸道結核分枝桿菌的靈敏度明顯高于IS6110 PCR和培養(yǎng)法。此外,在結核病的診斷方面,仍有大量基于LAMP的新技術不斷被開發(fā)出來。如將LAMP技術與基于納米顆粒的側流裝置(LFD)[17]及微流控芯片[18]等技術的聯(lián)合應用。由此可見LAMP在結核病的診斷發(fā)面也有廣闊的前景。

2.3LAMP技術在沙門菌檢測中的應用 沙門菌是全球最主要的食源性致病菌。若誤食含有沙門菌的食物可導致食物中毒,嚴重者會引發(fā)腸胃炎、敗血癥等癥狀,若不及時就醫(yī)甚至會危及生命。因此該菌被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為具有中等乃至嚴重危害的食源性病原菌[19]。

目前臨床上主要通過傳統(tǒng)的實驗室方法在標本中檢測沙門菌。但這些傳統(tǒng)的實驗室方法操作復雜、耗時較長,需要3 d以上才能通過多個分析步驟獲得結果。近年來,隨著核酸檢測技術的不斷發(fā)展與完善,許多基于核酸擴增的技術已經(jīng)被廣泛使用,如PCR、實時PCR等,這些方法均能將檢測時間縮短到3 d以內[20]。其中PCR雖然靈敏度高,但需要配備訓練有素的人員和復雜的熱循環(huán)儀,這使得其難以在設備不足的實驗室和資源匱乏的現(xiàn)場環(huán)境中應用。而LAMP作為一種新型的核酸擴增技術,在病原微生物的檢測方面有其獨特的優(yōu)勢。自2005年LAMP被應用于沙門菌的檢測之后,已經(jīng)開發(fā)出數(shù)十種基于LAMP的沙門菌檢測方法,這給臨床早期診斷沙門菌感染帶來了新的希望。近年來,隨著對LAMP技術的深入研究,大量的商業(yè)試劑盒被用于沙門菌的快速檢測[21]。此外,還有一些基于LAMP的新技術被開發(fā)出來。試紙條作為一種簡單、快速的檢測方法,常與LAMP技術結合用于現(xiàn)場快速檢測,朱傳新等[22]建立了環(huán)介導核酸恒溫擴增結合試紙條(LAMP-LFD)檢測技術用于沙門菌的快速檢測,30 min內即可完成檢測,其靈敏度與PCR相當,為10 copy/μL。DRAZ等[23]將LAMP與酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)聯(lián)合用于檢測沙門菌D型血清型菌株,檢測靈敏度為1×103CFU/mL,比PCR-ELISA的靈敏度高10倍。DRAZ 等[23]將LAMP與表面增強拉曼技術聯(lián)合用于檢測腸炎沙門菌,其靈敏度比常規(guī)PCR高10倍,達到了66 CFU/mL。與PCR相比,LAMP不僅快速、簡單,而且具有高靈敏度、高特異度等優(yōu)點,因此,LAMP技術具有替代傳統(tǒng)方法檢測沙門菌的潛力。

2.4LAMP技術在金黃色葡萄球菌檢測中的應用 金黃色葡萄球菌是一種常見的機會致病菌,當機體免疫力降低時,它可以遷移到其他組織或器官造成感染,嚴重者甚至出現(xiàn)菌血癥,具有較高的致死率。目前臨床上金黃色葡萄球菌的常規(guī)檢測方法是微生物培養(yǎng)法,這種方法雖然具有較高的靈敏度和準確性,但檢測過程煩瑣、耗時較長[24]。很多患者因此錯過了最佳治療期。因此,開發(fā)一種快速、可靠的檢測方法來檢測金黃色葡萄球菌是臨床上迫切需要的。

近年來,越來越多的分子診斷技術被用于病原微生物的分類鑒定,與培養(yǎng)法相比,分子診斷技術具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點,常見的分子診斷技術有PCR、重組酶聚合酶擴增技術(RPA)、LAMP等。其中PCR在金黃色葡萄球菌的臨床標本檢測中具有較高的準確率[25],然而,由于需要昂貴的設備和熟練的操作人員,PCR在資源匱乏地區(qū)的應用受到一定的限制。LAMP作為一種恒溫擴增法,無須昂貴的設備和復雜的操作步驟。WU等[3]開發(fā)了一種基于LAMP的可視化檢測法,通過使用比色指示劑羥基萘酚藍目視檢測金黃色葡萄球菌,結果表明LAMP的檢測限為每反應8 copy或每反應400 CFU。與常規(guī)PCR相比,LAMP將檢測限降低至1/10。鄒作成等[26]也設計了基于nuc基因的LAMP可視化檢測法,該方法的檢測限可達5.6×101CFU/mL,其靈敏度比常規(guī)PCR高出10 000倍。LIM等[27]以金黃色葡萄球菌的spa和arcC基因為靶標,將LAMP與PCR對比,結果表明二者的特異度、陽性預測值和陰性預測值完全一致,LAMP的檢測限為2.5 ng/μL或1×102CFU/mL,而PCR的檢測限為12.5 ng/μL或1×103CFU/mL。由此可見,在檢測金黃色葡萄球菌方面,與PCR相比,LAMP不僅具有同樣的特異度和準確率,而且檢測時間更短,靈敏度更高。因此LAMP是一種很有前途的快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。

2.5LAMP技術在乙型肝炎病毒(HBV)檢測中的應用 HBV是一種環(huán)狀部分雙鏈DNA病毒,主要通過血液傳播,由于HBV感染早期沒有任何癥狀,且感染者血液內缺乏乙型肝炎表面抗原,HBV-DNA含量較低,因此很難在早期檢測到HBV感染。ELISA和實時定量PCR是目前臨床檢測HBV最常用的方法[28],然而ELISA診斷乙型肝炎的靈敏度非常低[29],實時定量PCR作為ELISA的替代方法,其靈敏度較高,但它對實驗設備和環(huán)境要求也很高[30],在資源不足的情況下很難滿足,因此,需要開發(fā)出一種快速、靈敏、特異、易于使用的HBV檢測方法。

CHEN等[31]通過使用LAMP檢測HBV,該方法可以不用提取DNA直接檢測血液中的HBV,其靈敏度為每反應10 copy,與PCR相當。CHEN等[32]設計了一種LAMP與基于納米顆粒的LFD用于臨床上HBV的檢測,在60 min內即可完成結果的讀取,其靈敏度為每反應7.5 IU。MAITY等[33]同樣將LAMP與LFD結合用于檢測HBV,結果表明HBV-LAMP-LFD法檢測HBV的靈敏度為92%,特異度為100%,檢測限低至500 pg/μL。為了更好地評估LAMP對HBV診斷的準確性,CHEN等[34]通過檢索Embase、Cochrane Library和PubMed數(shù)據(jù)庫中使用LAMP檢測HBV的研究,然后使用QUADAS-2工具提取數(shù)據(jù)并評估文獻質量,分析發(fā)現(xiàn)LAMP檢測HBV的靈敏度和特異度分別為0.91和0.97,陽性似然比、陰性似然比、診斷優(yōu)勢比分別為16.93、0.08和397.57。由此可見,與PCR相比,LAMP是一種簡便、快速、有效的檢測HBV的方法。因此,LAMP可以取代其他方法用于臨床診斷HBV感染。

2.6LAMP技術在華支睪吸蟲檢測中的應用 華支睪吸蟲又稱肝吸蟲,是臨床上常見的一種人類寄生蟲,主要流行于中國、韓國和越南等國家[35]。感染早期無明顯癥狀,隨著病情的發(fā)展,患者會出現(xiàn)腹部不適、黃疸、發(fā)熱、嘔吐和腹瀉等,甚至可能引發(fā)癌變,因此華支睪吸蟲被WHO的國際癌癥研究機構歸類為Ⅰ類生物致癌物[36]。

華支睪吸蟲的準確診斷對于患者的治療極為重要,目前臨床上主要通過涂片鏡檢法和血清學方法來診斷華支睪吸蟲,但鏡檢法陽性率較低,因此輕度感染病例可能會被遺漏;而血清學方法又無法判斷是既往感染還是現(xiàn)在感染[37]。雖然已經(jīng)開發(fā)出了幾種基于PCR的檢測方法,但它們的靈敏度和特異度波動較大[38]。近年來,LAMP也被用于華支睪吸蟲的檢測,RAHMAN等[39]將LAMP用于檢測從韓國的華支睪吸蟲疫區(qū)采集的人糞便樣品,并使用Kato-Katz方法和實時PCR作為參考標準,LAMP測定顯示靈敏度為97.1%(95%CI:90.1%～99.2%),特異度為100.0%(95%CI:92.9%～100.0%)。此外,朱海等[40]以華支睪吸蟲ITS2基因為靶標成功建立了一種可用于檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的LAMP方法,該方法對華支睪吸蟲成蟲DNA的最低檢出限可達到3.33×10-4ng/μL,靈敏度和特異度與PCR法一致,均為100%,相對于PCR,LAMP不僅具有很高的靈敏度和特異度,而且操作更加簡便、反應時間更短。因此,LAMP完全可以替代其他方法用于臨床檢測華支睪吸蟲。

3 總結與展望

3.1LAMP的優(yōu)勢 LAMP是一種新型的恒溫擴增技術,在模板、多條引物及鏈置換酶的參與下,無須溫度循環(huán)即可快速完成擴增過程。與PCR相比,LAMP無須精密的控溫裝置,操作簡便、快捷,更適用于資源條件有限的基層醫(yī)院使用,在病原微生物的現(xiàn)場檢測方面有非常廣闊的前景。

3.2LAMP的不足 近年來,LAMP技術發(fā)展迅速,但仍然面臨著許多困難與挑戰(zhàn):(1)由于LAMP技術靈敏度高,一旦開蓋容易形成氣溶膠污染,加上目前國內大多數(shù)實驗室不能嚴格分區(qū),假陽性問題比較嚴重,因此需要通過設置空白對照確定是否為假陽性,并且在實驗過程中使用實時濁度儀,避免開蓋導致的污染。(2)LAMP與其他恒溫擴增法不同,它需要2對引物參與反應,因此引物設計比較復雜,有些疾病的靶基因可能不適合用LAMP方法檢測。(3)由于LAMP技術發(fā)展時間較短,因此它的集成檢測設備不夠成熟、商品化應用有待加強。

3.3未來展望 隨著LAMP技術的發(fā)展及其與多學科技術的聯(lián)合創(chuàng)新,上述問題都將會得到解決?？傊?LAMP技術作為一種新型核酸擴增檢測技術,在現(xiàn)場快速檢測和基層應用于診斷病原微生物感染的前景較廣闊,但仍需要不斷深入研究。