黃志敏 陸良喜 江旖旎 劉曉羽 張知英 吳金玉

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧 530023）；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（南寧 530001）

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）已經(jīng)成為日益嚴(yán)重的公共健康問題，到2040 年預(yù)計(jì)CKD 將成為全球第五大最常見的死亡疾病［1］。心血管疾病被認(rèn)為是慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）患者的主要并發(fā)癥和死亡原因。血管改變特別是動脈粥樣硬化和血管鈣化（vascular calcification，VC）是CKD相關(guān)心血管疾病死亡率的重要影響因素［2］。有研究［3］認(rèn)為VC 主要出現(xiàn)在腎臟病的終末期或透析患者中，然而最近的動物模型證實(shí)VC 可以出現(xiàn)在腎臟病更早的階段，可能在CKD 2 期就已出現(xiàn)VC，并且CKD 3 期以上患者VC 發(fā)病率較非CKD 患者高4 倍以上［4］。因此，尋找延緩CRF 血管鈣化的藥物對預(yù)防和降低CRF 心血管事件尤為重要。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)編碼Sortilin 蛋白的Sort1 基因位于染色體1p13.3 位點(diǎn)，是血脂異常和冠狀動脈粥樣硬化的致病基因［5］，氨甲酰化Sortilin 可能是CKD 血管鈣化的危險(xiǎn)因素［6］。Sort1 介導(dǎo)免疫細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，可能與Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）TLR3、TLR4、TLR7、TLR9 信號通路相關(guān)［7］。腎臟替代治療是西醫(yī)的優(yōu)勢，中醫(yī)藥治療CRF 的優(yōu)勢在于延緩早、中期疾病進(jìn)展。本研究以Sortilin 為切入點(diǎn)，基于Sortilin 與TLRs 的生物學(xué)功能探討三七對CRF 血管鈣化的影響，闡明三七抗CRF 血管鈣化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)。

1.2 時間及地點(diǎn) 于2022 年1 - 6 月在廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 材料

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 12 周齡清潔級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量（210 ± 39） g，共36只。采購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號是：SCXK（湘）2019-0014。本研究實(shí)驗(yàn)方案已通過實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn)（編號：DW20221221-242）。在廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，保持室溫18 ～ 25 ℃，分籠飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，把SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、三七低劑量組、三七中劑量組、三七高劑量組、骨化三醇組，每組6 只。動物實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守倫理道德標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)藥物、主要儀器和試劑 腺嘌呤（A8330，25 g，廠家：Solarbio），三七單味配方顆粒（江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司），骨化三醇膠丸（上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20150011）。

光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS，BX43），透射電子顯微鏡（HITACHI，HT7800/HT7700），酶標(biāo)儀（BIOTEK，Elx800），核酸蛋白定量儀（美國丹諾爾，DS-11），電泳儀（北京六一公司，DYCZ-24DN型）。茜素紅S染色液（北京索萊寶科技有限公司，G1452），RUNX2 抗體（武漢三鷹，20700-1-ap），BMP2 抗體（affinity，AF5163），SM22α（affinity，AF9266），TLR7抗體（武漢三鷹，17232-1-AP），TLR9 抗體（Affinity，DF2970），Sortilin 抗體（武漢三鷹，12369-1-AP），山羊抗兔的二抗（北京中杉，ZB2301），山羊抗鼠的二抗（北京中杉，ZB2305），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（伊萊瑞特，E-EL-R0015c），IFN-γ（聯(lián)科生物，EK380），IL-17A（伊萊瑞特，E-EL-R0566c），IL-10（伊萊瑞特，E-EL-R0016c）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 CRF 血管鈣化模型制備［8］加適當(dāng)蒸餾水將腺嘌呤制成混懸液，實(shí)驗(yàn)第1 ～ 4 周，除正常組外每日定時給予2.5%腺嘌呤混懸液［250 mg/（kg·d）］灌胃，同時聯(lián)合使用1.8%高磷飼料喂養(yǎng)；第5 ～ 8周隔日予腺嘌呤灌胃。正常組普通飼料喂養(yǎng)。HE染色可見模型組大鼠腎小球變性，腎小管擴(kuò)張、萎縮、變形，腎小管內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維明顯增生，腎小管及腎間質(zhì)可見大片腺嘌呤結(jié)晶。提示模型成功。

1.4.2 給藥干預(yù) 造模當(dāng)天開始，采用水溶液灌胃方式給藥，正常組和模型組大鼠每天灌胃等體積的0.9%生理鹽水；大鼠中藥給藥劑量根據(jù)人-大鼠體表面積（1∶6.25）換算，同時給予成人藥量的1、2、4 倍劑量：即分別以含生藥0.45、0.9、1.8 g/kg三七顆粒水沖劑給三七低、中、高劑量組灌胃。骨化三醇組大鼠（參考陳奇主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》體表面積等效劑量換算比率按人常用量0.25 μg/d，大鼠劑量0.25 μg × 0.018 = 0.004 5 μg，200 g 體質(zhì)量大鼠的劑量為0.004 5 μg，0.004 5 μg/0.2 kg=0.022 μg/kg，溶于生理鹽水）每天給予骨化三醇膠丸水溶液灌胃。各組大鼠按1 mL/100 g 體質(zhì)量灌胃，每天1 次，連續(xù)8 周。

1.5 主要觀察指標(biāo)

1.5.1 主動脈鈣鹽茜素紅染色 剝離胸主動脈，固定組織，石蠟包埋，切片脫蠟至水洗，蒸餾水洗數(shù)次；加入茜素紅S 染液染色5 ～ 10 min；蒸餾水沖洗；脫水透明，中性樹膠封片固定。顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況。

1.5.2 透射電鏡觀察主動脈鈣化 4%多聚甲醛灌注，取材4 ℃固定液固定2 h，4 ℃下PBS 漂洗3 次，每次30 min。樣品梯度脫水后，加入丙酮，對樣品滲透、包埋、固化處理。修片樣品厚度60 ～80 nm，用2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色，在電鏡下觀察。

1.5.3 生化學(xué)指標(biāo)檢測 紫外比色法檢測血清鈣（Ca）、磷（P）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平。

1.5.4 Western blot 法檢測主動脈Sortilin、TLR7、TLR9、RUNX2、BMP2、SM22α蛋白表達(dá) 取50 mg主動脈組織于液氮中剪碎研磨成細(xì)粉末狀，分裝于離心管中，加入500 μL 的RIPA 裂解液，提取總蛋白。按操作步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Sortilin（1∶2 000）、TLR7（1∶1 000）、TLR9（1∶1 000）、RUNX2（1∶1 000）、BMP2（1∶800）、SM22α（1∶1 500）免疫檢測，成像儀中曝光、拍照。蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.5.5 ELISA 法檢測大鼠血清IFN-γ，IL-6，IL-10和IL-17A 水平 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書測定血清中IFN-γ，IL-6，IL-10 和IL-17A 濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件做統(tǒng)計(jì)分析，服從正態(tài)分布并且方差齊計(jì)量資料以±s表示，不服從正態(tài)分布或者方差不齊計(jì)量資料以［M（Q）］表示。服從正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差分析，事后檢驗(yàn)采用LSD-t；不服從正態(tài)分布或方差不齊的，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)所選用36 只SD雄性大鼠，在實(shí)驗(yàn)過程中無脫失，全部納入統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 各組大鼠主動脈鈣鹽沉積茜素紅染色結(jié)果分析 正常組大鼠主動脈未見紅色鈣化點(diǎn)，模型組可見大面積紅色鈣鹽沉積，與模型組相比，三七低、中、高劑量組和骨化三醇組鈣鹽沉積減少，其中三七中、高劑量組、骨化三醇組明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈鈣鹽茜素紅染色結(jié)果（標(biāo)尺100 μm）Fig.1 Aortic calcium salt by stained with alizarin red of rats in each group （scale 100 μm）

2.3 各組大鼠主動脈鈣化及平滑肌線粒體超微結(jié)構(gòu)透射電鏡結(jié)果 如圖2 所示，正常組主動脈平滑肌線粒體形態(tài)大小正常。模型組基質(zhì)中有大量的鈣化結(jié)晶。三七低、中劑量組和骨化三醇組線粒體結(jié)構(gòu)受損。三七低劑量組間質(zhì)中存在大量鈣結(jié)晶。三七高劑量組線粒體結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)現(xiàn)鈣化。

圖2 各組大鼠主動脈透射電鏡超微結(jié)構(gòu)變化（標(biāo)尺1μm）Fig.2 Ultrastructural changes of aorta under transmission electron microscope of rats in each group（scale 1μm）

2.4 各組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果比較 與正常組比較，模型組大鼠血清BUN、Cr、P、TG、TC 含量明顯升高（P＜ 0.01），Ca 含量明顯降低（P＜ 0.01）。與模型組比較，三七中、高劑量組和骨化三醇組大鼠血清BUN、Cr、P、TG、TC含量明顯降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），Ca 含量明顯升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01），并且三七高劑量組和骨化三醇組效果更顯著。見表1。

表1 各組大鼠血清BUN、Cr、Ca、P、TG 和TC 含量水平的比較Tab.1 Comparison of serum BUN，Cr，Ca，P，TG，and TC levels of rats in each group n = 6，±s，M（Q）

表1 各組大鼠血清BUN、Cr、Ca、P、TG 和TC 含量水平的比較Tab.1 Comparison of serum BUN，Cr，Ca，P，TG，and TC levels of rats in each group n = 6，±s，M（Q）

注：與正常組比較，ΔP ＜ 0.05，ΔΔP ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

分組正常組模型組三七低劑量組三七中劑量組三七高劑量組骨化三醇組F/χ2值P值TC(mmol/L)1.66（0.21）3.60（0.82）ΔΔ 3.32（0.71）ΔΔ 2.81（0.53）ΔΔ▲▲2.03（0.27）ΔΔ▲▲2.26（0.34）ΔΔ▲▲27.99＜ 0.05 BUN（mmol/L）4.46（1.17）29.09（8.19）ΔΔ 23.49（7.91）ΔΔ 16.02（3.85）ΔΔ▲▲9.92（2.60）ΔΔ▲▲14.17（2.71）ΔΔ▲▲29.31＜ 0.05 Cr（μmol/L）41.85 ± 8.51 165.75 ± 32.41ΔΔ 141.06 ± 20.75ΔΔ▲113.85 ± 19.08ΔΔ▲▲68.32 ± 20.70Δ▲▲97.83 ± 16.68ΔΔ▲▲28.67＜ 0.05 Ca（mmol/L）2.54 ± 0.38 1.56 ± 0.31ΔΔ 1.72 ± 0.23ΔΔ 1.94 ± 0.25ΔΔ▲2.29 ± 0.37▲▲2.01 ± 0.27ΔΔ▲8.18＜ 0.05 P（mmol/L）2.03（0.30）6.13（1.99）ΔΔ 5.01（1.05）ΔΔ 3.95（0.53）ΔΔ▲▲2.92（0.85）ΔΔ▲▲3.75（0.60）ΔΔ▲▲28.19＜ 0.05 TG(mmol/L)0.48（0.07）1.46（0.48）ΔΔ 1.29（0.29）ΔΔ 0.99（0.15）ΔΔ▲0.78（0.22）ΔΔ▲▲0.84（0.14）ΔΔ▲▲27.61＜ 0.05

2.5 各組大鼠BMP2、RUNX2、SM22α、Sortilin、TLR7、TLR9 蛋白表達(dá)結(jié)果分析 與正常組比較，模型組大鼠主動脈組織BMP2、RUNX2、Sortilin、TLR7、TLR9 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜ 0.01），SM22α蛋白表達(dá)顯著下降（P＜ 0.01）。與模型組相比，三七低、中、高劑量組和骨化三醇組BMP2、RUNX2、Sortilin、TLR7、TLR9蛋白表達(dá)下降顯著（P＜ 0.01），SM22α 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。詳見表2，圖3、4。

表2 各組大鼠主動脈BMP2、RUNX2、SM22α、Sortilin、TLR7 和TLR9 蛋白的表達(dá)Tab.2 Expression of BMP2，RUNX2，SM22α，Sortilin，TLR7 and TLR9 protein in aorta of rats in each group n = 6， ± s，M（Q）

表2 各組大鼠主動脈BMP2、RUNX2、SM22α、Sortilin、TLR7 和TLR9 蛋白的表達(dá)Tab.2 Expression of BMP2，RUNX2，SM22α，Sortilin，TLR7 and TLR9 protein in aorta of rats in each group n = 6， ± s，M（Q）

注：與正常組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

分組正常組模型組三七低劑量組三七中劑量組三七高劑量組骨化三醇組F值P值TLR9 0.18（0.04）0.71（0.21）ΔΔ 0.54（0.09）ΔΔ▲▲0.37（0.06）ΔΔ▲▲0.27（0.08）Δ▲▲0.23（0.07）▲▲31.95＜ 0.05 BMP2 0.31 ± 0.11 1.14 ± 0.05ΔΔ 0.83 ± 0.09ΔΔ▲▲0.62 ± 0.13ΔΔ▲▲0.61 ± 0.06ΔΔ▲▲0.49 ± 0.08ΔΔ▲▲59.52＜ 0.05 RUNX2 0.40 ± 0.05 1.14 ± 0.07ΔΔ 0.91 ± 0.05ΔΔ▲▲0.81 ± 0.08ΔΔ▲▲0.58 ± 0.06ΔΔ▲▲0.62 ± 0.03ΔΔ▲▲119.94＜ 0.05 SM22α 0.88 ± 0.04 0.28 ± 0.07ΔΔ 0.36 ± 0.05ΔΔ▲0.56 ± 0.05ΔΔ▲▲0.73 ± 0.04ΔΔ▲▲0.76 ± 0.03ΔΔ▲▲132.51＜ 0.05 Sortilin 0.42（0.06）1.01（0.03）ΔΔ 0.84（0.10）ΔΔ▲▲0.76（0.13）ΔΔ▲▲0.56（0.04）ΔΔ▲▲0.49（0.06）Δ▲▲32.42＜ 0.05 TLR7 0.32 ± 0.04 0.96 ± 0.07ΔΔ 0.72 ± 0.08ΔΔ▲▲0.66 ± 0.06ΔΔ▲▲0.47 ± 0.06ΔΔ▲▲0.50 ± 0.04ΔΔ▲▲79.40＜ 0.05

圖3 各組大鼠主動脈BMP2、RUNX2、SM22α 蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of BMP2，RUNX2，SM22αprotein in aorta of rats in each group

圖4 各組大鼠主動脈Sortilin、TLR7、TLR9 蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of Sortilin，TLR7 and TLR9 protein in aorta of rats in each group

2.6 各組大鼠血清相關(guān)炎癥因子水平分析 與正常組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A 含量明顯升高（P＜ 0.01）。與模型組比較，三七中、高劑量組和骨化三醇組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A 含量明顯降低（P＜ 0.01），并且三七高劑量組和骨化三醇組降低更顯著。見表3。

表3 各組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10 和IL-17A 水平的比較Tab.3 Comparison of serum IFN-γ，IL-6，IL-10 and IL-17A levels of rats in each group n = 6，±s，pg/mL

表3 各組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10 和IL-17A 水平的比較Tab.3 Comparison of serum IFN-γ，IL-6，IL-10 and IL-17A levels of rats in each group n = 6，±s，pg/mL

注：與正常組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01；與模型組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01

組別正常組模型組三七低劑量組三七中劑量組三七高劑量組骨化三醇組F值P值IL-17A 39.99 ± 2.76 85.24 ± 13.05ΔΔ 72.40 ± 7.34ΔΔ▲59.19 ± 7.08ΔΔ▲▲48.16 ± 7.76▲▲55.61 ± 8.51ΔΔ▲▲23.10＜ 0.05 IFN-γ 34.17 ± 10.34 99.67 ± 19.91ΔΔ 90.27 ± 15.39ΔΔ 74.42 ± 11.15ΔΔ▲▲54.16 ± 11.92Δ▲▲62.43 ± 11.31ΔΔ▲▲18.39＜ 0.05 IL-6 80.67 ± 16.07 260.41 ± 57.42ΔΔ 195.63 ± 38.73ΔΔ▲▲163.49 ± 27.88ΔΔ▲▲122.63 ± 21.18Δ▲▲141.43 ± 29.69ΔΔ▲▲19.49＜ 0.05 IL-10 91.58 ± 12.56 170.83 ± 20.93ΔΔ 158.30 ± 16.23ΔΔ 139.14 ± 17.94ΔΔ▲▲103.25 ± 13.56▲▲124.29 ± 10.89ΔΔ▲▲23.12＜ 0.05

3 討論

CKD 發(fā)生VC 的機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與鈣磷代謝紊亂、血管平滑肌表型轉(zhuǎn)化、微炎癥、氧化應(yīng)激、自噬、鈣化促進(jìn)因子與抑制因子失衡等有關(guān)［9］。VC 過程中血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的表型轉(zhuǎn)換主要表現(xiàn)為BMP2和RUNX2等骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，SM22α、α-SMA等VSMC 抑制因子的減少［10-13］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示模型組腎纖維化明顯，鈣磷及血脂代謝紊亂，主動脈大量鈣鹽沉積。模型組主動脈BMP2 和RUNX2 蛋白表達(dá)升高，SM22α 蛋白表達(dá)減少，提示已發(fā)生VSMC 的表型轉(zhuǎn)換，CKD 血管鈣化動物模型建立成功。延緩CKD 血管鈣化進(jìn)程可以降低CKD 心血管事件發(fā)生率［2］，本研究中三七和陽性藥物處理后，降低大鼠主動脈BMP2 和RUNX2蛋白表達(dá)，促進(jìn)SM22α 蛋白表達(dá)，提示三七能延緩CKD 血管鈣化進(jìn)程。

Sortilin 蛋白具有多種生物學(xué)功能，研究發(fā)現(xiàn)Sortilin 蛋白通過調(diào)節(jié)外泌體裝載組織非特異性堿性磷酸酶，加速囊泡內(nèi)鈣鹽沉積，直接促進(jìn)動脈鈣化［14-15］。Sortilin 可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［16］，參與VC 的發(fā)生。與具有相同變異的非糖尿病患者相比，攜帶SORT1 變異的糖尿病患者血漿載脂蛋白、超低密度脂蛋白、TG 和LDL 水平下降幅度更大［17］。Sortilin 與CKD 血管鈣化關(guān)系密切，在CKD患者中研究發(fā)現(xiàn)Sortilin 氨甲?；c冠狀動脈鈣化相關(guān)，與年齡和腎功能無關(guān)；氨甲?；疭ortilin 可能導(dǎo)致CKD 患者心血管并發(fā)癥的升高，是心血管鈣化的危險(xiǎn)因素［6］。本研究中模型組Sortilin 蛋白表達(dá)明顯升高，脂質(zhì)代謝紊亂，三七治療后Sortilin 蛋白表達(dá)下降，脂質(zhì)代謝改善，推測三七可能通過調(diào)節(jié)Sortilin 蛋白的表達(dá)影響脂質(zhì)代謝，與其他學(xué)者的研究結(jié)論相似。

VC 以動脈壁內(nèi)鈣和磷酸鹽的積累為特征，CKD 血管鈣化以中膜層為主。持續(xù)的慢性微炎癥狀態(tài)是VC 形成的病理基礎(chǔ)［18］。CKD 血管鈣化大鼠發(fā)生了明顯的炎癥反應(yīng)失衡，其中促炎因子CINC、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TIMP-1、L-selectin 占主導(dǎo)作用［19］。CKD 患者的慢性微炎癥狀態(tài)以TNF-a 和IL-6 水平升高為特征，而IL-6可能促進(jìn)CKD 中血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展［20］，阻斷IL-6 信號通路可明顯減弱尿毒癥誘導(dǎo)的VSMC 成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變和鈣化［21］。研究［6］發(fā)現(xiàn)IL-6 與體外氨基甲?；疭ortilin 的親和力增強(qiáng)，直接作用血管細(xì)胞，促進(jìn)血管鈣化。除與IL-6 結(jié)合外，Sortilin蛋白還被證明可與免疫細(xì)胞中的其他細(xì)胞因子結(jié)合，如IFN-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10 和IL-12［7］。本研究結(jié)果提示CKD 血管鈣化模型存在微炎癥狀態(tài)，多種炎癥因子，如IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A明顯升高，經(jīng)過三七治療后Sortilin 及炎癥因子水平均下降，推測三七可能通過調(diào)節(jié)Sortilin 蛋白的表達(dá)影響炎癥因子水平，與其他學(xué)者的研究結(jié)論相似。

TLRs 是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可識別不同種類的病原體相關(guān)分子模式。TLR9 激活可以刺激血管炎癥反應(yīng)促進(jìn)斑塊形成［22］。在CRF大鼠模型中TLR9 激活后促進(jìn)VSMC 中BMP-2 表達(dá)的增加，促進(jìn)血管鈣化［23］。TLR7 在動脈粥樣硬化斑塊中高表達(dá)，即使是癥狀較輕的患者其動脈粥樣硬化斑塊中TLR7 表達(dá)仍然較高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TLR7 激活后，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞迅速釋放IL-10［24］。另外，TLR7 促進(jìn)IL-6 分泌在載脂蛋白e 缺陷小鼠的動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮作用［25］。本研究結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)TLR9、TLR7 參與了CKD 大鼠血管鈣化進(jìn)程。

本研究中CKD 血管鈣化大鼠主動脈鈣鹽沉積，脂質(zhì)代謝異常，鈣化相關(guān)蛋白BMP2、RUNX2、SM22α 表達(dá)異常，相關(guān)炎癥因子表達(dá)升高，這一結(jié)果與現(xiàn)有研究［26］Sortilin 通過多途徑調(diào)控脂質(zhì)代謝，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管鈣化或動脈粥樣硬化的結(jié)論一致，并且這可能與TLR9、TLR7 信號通路相關(guān)，這一結(jié)論與國外研究［7］結(jié)果一致。三七干預(yù)處理后，可以改善上述指標(biāo)的變化。提示三七是延緩CRF 大鼠血管鈣化的有效藥物。為防治CKD 心血管事件的研究提供思路。本研究不足之處在于TLRs 與Sortilin 的關(guān)系未能進(jìn)一步探究，Sortilin 是VC 的關(guān)鍵蛋白，其在VC 中的作用機(jī)制復(fù)雜，還需進(jìn)一步研究。

【Author contributions】HUANG Zhimin performed the experiments and wrote the article.ZHANG Zhiying，JIANG Yini and LIU Xiaoyu performed the experiments.LU Liangxi revised the article.WU Jinyu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.