鄭璐璐 ，王 敏 ，武玉玉 ，劉開鑫 ，崔茂盛

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300380；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

雙酚A（BPA）是環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物（EDCs）之一，在食品包裝、個(gè)人護(hù)理用品、收銀機(jī)收據(jù)和醫(yī)療設(shè)備中隨處可見，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面影響。BPA作為一種弱外源性雌激素，能夠結(jié)合經(jīng)典的核雌激素受體ERα和ERβ并激活它們，這種激活會(huì)干擾正常的激素信號(hào)傳導(dǎo)，影響卵巢功能和卵泡發(fā)育，從而導(dǎo)致月經(jīng)周期不穩(wěn)定和生殖問題。BPA還會(huì)干擾子宮內(nèi)膜的正常發(fā)育和增殖，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥和胚胎著床等問題，對(duì)雌性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性影響。到目前為止，BPA已經(jīng)在水生環(huán)境、污水、自來水、土壤、灰塵和空氣中被檢測(cè)到，對(duì)人類和動(dòng)物都構(gòu)成了威脅。

褪黑素（M T）是一種吲哚胺，主要由松果體分泌和合成，褪黑素及其代謝物除了能發(fā)揮影響生物節(jié)律、減少炎癥狀態(tài)等多重作用外，還具有間接抗氧化劑和強(qiáng)大的自由基直接清除劑的功能。褪黑素可以維持卵母細(xì)胞的促氧化-抗氧化平衡，從而保護(hù)雌性配子免受氧化損傷，調(diào)節(jié)健康的卵泡生成。褪黑素存在于卵泡液中，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）刺激顆粒細(xì)胞增殖。許多體外研究在培養(yǎng)基中添加褪黑素，以便促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育。有研究者認(rèn)為，MT作為一種抗氧化因子在豬胚胎體外培養(yǎng)中不可或缺。實(shí)驗(yàn)表明，MT能夠緩解BPA誘導(dǎo)的超氧化物對(duì)細(xì)胞的損傷。

國內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展顯示，雖然研究者在MT緩解BPA對(duì)生物機(jī)體或細(xì)胞損傷方面做了一些探討，但在豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中，針對(duì)MT對(duì)BPA誘導(dǎo)的豬卵丘細(xì)胞損傷的作用方面研究尚少。本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)確定在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，BPA導(dǎo)致卵丘細(xì)胞氧化和凋亡，降低卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展和連接水平。本研究以正常成熟培養(yǎng)的豬卵丘細(xì)胞為對(duì)照組，設(shè)置BPA組和BPA+MT組，BPA濃度根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往濃度為基礎(chǔ)進(jìn)行選擇，從細(xì)胞形態(tài)、基因等層面深入探討MT對(duì)BPA損傷豬卵丘細(xì)胞發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

洗卵液：HEPES緩沖液中添加0.3%的BSA。成熟培養(yǎng)液：碳酸氫鈉 0.015 g，葡萄糖0.027 5 g，聚乙烯醇0.05 g，丙酮酸鈉0.005 g，慶大霉素0.000 5 g，TCM-199培養(yǎng)基，10%的卵泡液（PFF），1 μg/mL促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH），10 ng/mL表皮生長因子（EGF）。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加75 μmol/L BPA，添加10-7mol/L的MT。

1.2 主要耗材

Medium199購于美國Gibco公司；活性氧檢測(cè)試劑盒、線粒體紅色熒光探針試劑盒、谷胱甘肽試劑盒和丙二醛試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購于美國GeneCopoeia公司；在無特殊說明的情況下，細(xì)胞培養(yǎng)所需其他試劑均購自Sigma公司。

1.3 材料

將屠宰場(chǎng)采集的豬卵巢放入37℃的含有雙抗的生理鹽水中，1～3 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.4 方法

1.4.1 豬卵母細(xì)胞的采集

將豬卵巢在含有雙抗的生理鹽水中清洗3次，用帶有18號(hào)針頭的10 mL一次性注射器抽取卵巢表面直徑2～8 mm的卵泡中的卵子和卵泡液，置于10 mL的錐形離心管中，37℃水浴鍋中靜置10 min后吸走上清液，用洗卵液洗兩次，在體式顯微鏡下挑選卵丘細(xì)胞三層以上胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞。

1.4.2 豬卵母細(xì)胞的培養(yǎng)與分組

對(duì)照組：COCs在成熟培養(yǎng)液中清洗3次后，置于100 uL的成熟培養(yǎng)液滴中，每滴30枚卵母細(xì)胞置于38.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。BPA組：操作方法同對(duì)照組，置于100 μL添加75 μmol/LBPA的成熟液滴中，培養(yǎng)44 h。BPA+MT組：在添加BPA的成熟培養(yǎng)液中預(yù)處理18 h后轉(zhuǎn)入添加10-7mol/L MT的成熟培養(yǎng)液滴中繼續(xù)培養(yǎng)至44 h。

1.4.3 豬卵母細(xì)胞卵丘擴(kuò)展指數(shù)

在CO Cs 體外成熟培養(yǎng)44 h后，用熒光顯微鏡觀察并拍照，對(duì)卵丘擴(kuò)展指數(shù)（Cumulus Expansion Index，CEI）進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：幾乎未擴(kuò)展；1級(jí)：只有外層1～2層卵丘細(xì)胞擴(kuò)展；2級(jí)：外層卵丘細(xì)胞約有一半擴(kuò)展；3級(jí)：卵丘細(xì)胞除放射冠外全部擴(kuò)展；4級(jí)：所有卵丘細(xì)胞呈放射狀擴(kuò)展；卵丘擴(kuò)展指數(shù)CEI計(jì)算公式：CEI =（0級(jí)數(shù)×0＋1級(jí)數(shù)×1＋2級(jí)數(shù)×2＋3級(jí)數(shù)×3＋4級(jí)數(shù)×4）÷總COCs個(gè)數(shù)。如圖1所示。

圖1 豬卵丘細(xì)胞分級(jí)

圖2 MT 對(duì)BPA 暴露的卵丘擴(kuò)展程度的影響

1.4.4 豬卵丘細(xì)胞的采集

將培養(yǎng)成熟的各組卵母細(xì)胞放在裝有透明質(zhì)酸酶的離心管中反復(fù)吹打40次左右去除卵丘細(xì)胞，轉(zhuǎn)入操作液中在顯微鏡下將卵母細(xì)胞撿出放在操作洗盤里。將撿出卵母細(xì)胞后的剩余液體轉(zhuǎn)移到無RNAse的1 mL離心管中，在3 500 rpm離心5 min，棄去上清液，加入PBS吹打清洗，重懸后3 500 rpm離心5 min，棄去上清液，做好標(biāo)記。其他各組卵丘細(xì)胞均按此方法進(jìn)行收集，收集完成后放入-80℃冰箱保存。

1.4.5 豬卵丘細(xì)胞總RNA提取及基因檢測(cè)

每個(gè)組收集1×106個(gè)/mL卵丘細(xì)胞，使用RNeasy Micro Kit（5 0）微量試劑盒提取核糖核酸（R N A），使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用All-inoneTMqPCR Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。待反應(yīng)結(jié)束后將所有Ct值導(dǎo)出，參照內(nèi)參基因，采用 2-△△Ct法計(jì)算出各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 引物設(shè)計(jì)及合成

本研究引物由生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，檢測(cè)基因包括細(xì)胞凋亡相關(guān)基因（Bax、Bcl-2）、氧化應(yīng)激相關(guān)基因（CAT、SOD1）、細(xì)胞連接相關(guān)基因（Cx43、Cx45）、細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因（Ptgs1、Ptgs2、Has2、Tnfaip6）引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用SPSS 26.0單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用LSD、Duncan's檢驗(yàn)法確定組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MT 對(duì)BPA 暴露的卵丘擴(kuò)展程度的影響

卵母細(xì)胞成熟后對(duì)不同處理組的COCs在顯微鏡下進(jìn)行拍照，根據(jù)CEI計(jì)算公式統(tǒng)計(jì)卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展指數(shù)。由表2所示，與對(duì)照組相比，BPA組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)顯著降低（P＜0.05），BPA+MT組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)顯著升高（P＜0.05），但仍顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 MT 對(duì)BPA 暴露的卵丘擴(kuò)展程度的影響

2.2 MT 對(duì)BPA 暴露后豬卵丘細(xì)胞CAT 基因表達(dá)的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因CAT、SOD1。結(jié)果由圖3所示，BPA+MT組的CAT基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于BPA組（P＜0.05）。MT+BPA組的SOD1基因表達(dá)水平顯著低于BPA組（P＜0.05），與對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）。

圖3 MT 對(duì)BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞CAT、SOD1 基因的影響

2.3 MT 對(duì)BPA 暴露后豬卵丘細(xì)胞調(diào)亡基因的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞檢測(cè)調(diào)亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2。由圖4可見，對(duì)照組的Bax基因表達(dá)量顯著低于BPA組（P＜0.05），但仍顯著高于BPA+MT組（P＜0.05）。BPA+MT組的Bcl-2基因表達(dá)量顯著高于BPA組（P＜0.05），但與對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，BPA組Bcl-2/Bax顯著降低（P＜0.05），BPA+MT組Bcl-2/Bax與對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05）。

圖4 MT 對(duì)BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞調(diào)亡基因的影響

2.4 MT 對(duì)BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展基因的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因Ptgs1、Ptgs2、Has2、 Tnfaip6。由圖5可見，MT+BPA組Ptgs1的基因表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差異（P＞0.05），都顯著高于BPA組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，BPA+MT組的Ptgs2的基因表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），BPA組Ptgs2的基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05）。BPA+MT組Has2的基因表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于BPA組（P＜0.05）。BPA+MT組Tnfaip6的基因表達(dá)量顯著高于B PA 組（P＜0.05），但與對(duì)照組相比無明顯差異（P＞0.05）。

圖5 MT 對(duì)BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展基因的影響

2.5 MT 對(duì)BPA 暴露的豬卵丘細(xì)胞連接基因的影響

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)44 h后收集卵丘細(xì)胞連接相關(guān)基因Cx43、Cx45。由圖6可見，MT+BPA組的Cx43基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），但仍顯著高于BPA組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，BPA組的Cx45基因表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），MT+BPA組的Cx45基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖6 MT 對(duì)豬卵丘細(xì)胞在BPA中暴露后連接基因的影響

3 討論

卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟過程中起著關(guān)鍵作用。卵丘細(xì)胞介導(dǎo)卵泡微環(huán)境和母體特征來支持卵母細(xì)胞的生長、發(fā)育和獲能。以往的研究表明，人類裸卵細(xì)胞在體外成熟發(fā)育過程中，在減數(shù)分裂復(fù)蘇和減數(shù)分裂進(jìn)行的過程中，維持中期特征的細(xì)胞質(zhì)能力不足，減數(shù)分裂中斷后傾向于自發(fā)激活，核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟之間缺乏協(xié)調(diào)。此外，在一項(xiàng)對(duì)裸牛卵母細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)卵裂率也降低。IVM過程中卵丘細(xì)胞的缺失也會(huì)影響卵母細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致胞質(zhì)成熟不夠理想，從而降低其發(fā)育能力。在本研究中，檢測(cè)了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展情況。結(jié)果表明，BPA組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展指數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低，添加完M T 卵丘擴(kuò)展指數(shù)顯著升高，但仍低于對(duì)照組。其中對(duì)照組的COCs被卵丘多層包裹切擴(kuò)散體積較大，BPA組的COCs擴(kuò)散體積明顯變小，卵丘細(xì)胞包裹層數(shù)少。說明BPA影響了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展，添加10-7M的MT可以促進(jìn)BPA暴露后的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展但無法完全消除損傷。

即使在極低的暴露水平下，BPA似乎也會(huì)干擾女性和男性的生殖功能。盡管BPA損害內(nèi)分泌功能的途徑多種多樣，但氧化應(yīng)激的改變?nèi)匀皇悄行院团圆挥年P(guān)鍵因素。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過其內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制的保護(hù)能力時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激。ROS活性高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，但可通過氧化生物大分子和細(xì)胞器來穩(wěn)定。SOD1作為超氧化物歧化酶，可以催化超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2，CAT將H2O2分解為氧氣和水，可以通過中和自由基來保護(hù)機(jī)體免受ROS的侵襲。在本研究中，BPA暴露顯著降低卵母細(xì)胞內(nèi)CAT基因的表達(dá)量，SOD1基因表達(dá)量顯著升高。添加MT后，CAT基因表達(dá)量顯著升高但仍顯著低于對(duì)照組。我們研究得出，BPA暴露后卵丘細(xì)胞的抗氧化能力降低，添加MT后抗氧化能力顯著上升。

為了確定BPA暴露后卵丘細(xì)胞凋亡因子的變化，我們檢測(cè)了卵丘細(xì)胞中抗調(diào)亡基因Bcl-2以及促調(diào)亡基因Bax的表達(dá)。結(jié)果表明，BPA暴露降低了抗調(diào)亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)，而顯著提高了促調(diào)亡基因Bax的mRNA表達(dá)，在加入MT后，抗調(diào)亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)顯著上升，回到對(duì)照組水平，促調(diào)亡基因Bax的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低。BPA組的Bcl-2/Bax比例顯著降低，BPA+MT組的Bcl-2/Bax比例顯著升高，結(jié)果表明，BPA能促進(jìn)卵丘凋亡，而MT通過抑制卵丘凋亡來保護(hù)卵丘細(xì)胞的發(fā)育。

以往的研究表明，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生有關(guān)，Has2合成的透明質(zhì)酸包含基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)骨架，Tnfaip6也是ECM的重要組成部分。卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的相互作用是雙向溝通的必要條件，卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的通信是通過縫隙連接進(jìn)行的，縫隙連接也參與卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的分子轉(zhuǎn)移。

在本研究中，檢測(cè)了卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)BPA暴露后卵丘擴(kuò)展基因Ptgs1、Ptgs2、Tnfaip6、Has2的基因表達(dá)水平顯著降低；MT+BPA組Ptgs2基因的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)顯著高于對(duì)照組；顯著升高了Ptgs1、Tnfaip6基因表達(dá)水平，與對(duì)照組相比差異不顯著；Has2基因表達(dá)水平顯著升高，但仍顯著低于對(duì)照組。檢測(cè)卵丘連接相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)BPA暴露后顯著降低卵丘連接基因Cx43和Cx45的轉(zhuǎn)錄水平；添加MT的BPA組，Cx43基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，與對(duì)照組差異不顯著；Cx45基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，同時(shí)顯著高于對(duì)照組；結(jié)果表明，卵丘細(xì)胞連接和擴(kuò)展的基因表達(dá)在BPA暴露后受到了抑制，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的成熟與發(fā)育能力下降。而添加MT后卵丘細(xì)胞連接和擴(kuò)展的基因表達(dá)上調(diào)，表明MT并不僅是通過減緩 BPA對(duì)卵丘細(xì)胞的損傷來促進(jìn)卵丘的連接和擴(kuò)展，而是其本身對(duì)卵丘細(xì)胞連接和擴(kuò)展有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本研究表明，在BPA染毒豬卵丘細(xì)胞體外成熟的過程中，MT不僅提高了卵丘擴(kuò)展基因和卵丘連接基因的表達(dá)從而提高卵丘擴(kuò)展指數(shù)，還提高了卵丘抗氧化基因和抗凋亡基因的表達(dá)，緩解了細(xì)胞的氧化應(yīng)激和調(diào)亡，起到保護(hù)卵丘細(xì)胞的作用。