魯夢恬，瞿琦，徐磊，張繼云，劉茂童，姜吉鋒，張濤，張學琴*

0 引言

肝癌發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第六位，死亡率高居第二位[1]。盡管肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的治療方案已經(jīng)取得了很大的進步，但其預后仍然較差[2]。細胞角蛋白19（cytokeratin 19, CK19）陽性表達的HCC 具有多種與增殖、侵襲性相關的基因特征（轉化生長因子-β 途徑和上皮-間充質轉化的相關因子上調等），常表現(xiàn)出浸潤樣外觀、低分化、微血管浸潤等病理特征，臨床上常與較高的血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）水平、慢性乙型肝炎、淋巴結轉移相關[3-5]。CK19 陽性HCC 肝切除術及射頻消融術后的預后較差，對經(jīng)動脈化療栓塞術、全身化療也具有治療耐藥性[5-7]。由于其不同分子特征和侵襲性表現(xiàn)，治療方案也需進行調整：CK19 陽性HCC 患者行根治性切除術需擴大切除范圍，且患者術后聯(lián)合索拉非尼療效更佳[5]；TGFbR1 抑制劑、PDGFRα 抑制劑等被視為其特異性靶向藥物[8-9]，目前CK19 的表達狀態(tài)僅能通過活檢或術后病理標本確定，對于不可切除性HCC，通過術前影像學檢查預測其表達可彌補病理穿刺標本的局限性，為臨床治療決策提供重要參考。

釓塞酸二鈉是一種常用的肝細胞特異性對比劑，與傳統(tǒng)的MRI對比劑相比，其增強MRI肝膽期圖像呈現(xiàn)出獨特的信號表現(xiàn)，能更準確地檢測HCC 病灶和評估病灶特征[10]。而2018 版肝臟影像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Liver Imaging Reporting and Data System,LI-RADS）是規(guī)范HCC 影像診斷的綜合評估系統(tǒng)，對影像征象提供標準定義，可根據(jù)征象判斷腫瘤的良惡性及HCC的可能性[11]。

CHOI 等[12]最早發(fā)現(xiàn)不光滑腫瘤邊緣、動脈期環(huán)狀強化、腫瘤-肝臟表觀擴散系數(shù)比值較低、腫瘤-肝臟肝膽期信號比值較低可以預測HCC 的CK19 表達。HU 等[13]、高知玲等[14]研究認為靶環(huán)樣表現(xiàn)（動脈期環(huán)狀強化、DWI 靶征）和AFP 水平升高與CK19 陽性表達HCC 密切相關；陳玉瑩等[15]的研究則表明DWI 靶征是HCC CK19 表達的獨立預測因素。目前已有的研究結論不盡相同，均缺乏驗證步驟；納入的影像征象均較少且征象大多缺乏統(tǒng)一標準定義；此外，鮮有研究同時評估患者預后情況。本研究采用LI-RADS v2018 的MRI 特征及其他有潛在價值的MRI 征象，對HCC 的CK19 表達進行術前風險預測并探討其預后意義，旨在協(xié)助臨床治療決策的優(yōu)化以及改善患者預后。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2015 年5 月至2021 年6 月在本院行根治性肝切除術的HCC患者資料。納入標準：（1）手術病理確認為HCC；（2）具有完整的臨床、病理資料；（3）術前2周內行釓塞酸二鈉增強MRI檢查；（4）病灶直徑≤10 cm。排除標準：（1）術前接受過介入治療、靶向或免疫治療等其他抗腫瘤治療；（2）有肝外原發(fā)惡性腫瘤病史；（3）有大血管癌栓或遠處轉移；（4）圖像不完整或質量不佳；（5）復發(fā)狀態(tài)不明確；（6）隨訪時間＜1年且無復發(fā)?；颊吲R床病理資料包括：性別、年齡、乙肝病史、AFP 水平、總膽紅素、國際標準化比值（international normalized ratio, INR）、Edmondson-Steiner分級及微血管侵犯（ microvascular invasion, MVI）。所有患者肝切除術后每3～6 個月復查一次，包括超聲、CT 或MRI 增強檢查以及AFP 水平檢查，隨訪時間范圍為1～78 個月。無復發(fā)生存期（recurrence-free survival, RFS）指從手術日期到首次復發(fā)或末次隨訪（若未觀察到復發(fā)）的間隔時間。早期復發(fā)定義為患者術后1 年內復發(fā)，晚期復發(fā)定義為患者術后1 年后復發(fā)[16]。220 例患者中共103 例復發(fā)，其中51 例為早期復發(fā)，52例為晚期復發(fā)。

本研究遵守《赫爾辛基宣言》，經(jīng)過南通市第三人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準，并免除受試者知情同意，批準文號：EK2021017。

1.2 病理學標準

所有患者的HCC切片由2名均具有15年病理診斷經(jīng)驗的病理科副主任醫(yī)師評估，使用單克隆抗體對標本行CK19 免疫組化染色，在400 倍光鏡下觀察5 個獨立視野，CK19 陽性定義為瘤內≥5%的區(qū)域有中等-明顯程度的細胞染色[17]。

1.3 檢查方法

使用3.0 T MRI 掃描儀（Achieva 3.0 T，飛利浦醫(yī)療公司）、16 通道腹部相控陣線圈進行掃描。平掃序列包括：軸位T1WI 同相位和反相位序列、軸位和冠狀位T2WI 脂肪抑制序列、b 值為0、800 s/mm2的軸位擴散加權成像序列（diffusion-weighted imaging,DWI）。以0.025 mmol/kg 的劑量、1.0 mL/s 的速率靜脈注射對比劑釓塞酸二鈉。采用T1高分辨力各向同性容積激發(fā)序列在注射對比劑前及注射后第20～25 s、60 s、3 min、20 min 采集軸位平掃、動脈期（arterial phase, AP）、門靜脈期（portal phase, PP）、移行期（transitional phase, TP）、軸位及冠狀位肝膽期（hepatobiliary phase, HBP）圖像。各序列掃描參數(shù)如下：（1）T1WI序列，TR 100 ms，TE 2.3 ms，層厚5 mm，翻轉角10°，矩陣240×140，F(xiàn)OV 380 mm×330 mm；（2）T2WI 抑脂序列，TR 2 000 ms，TE 70 ms，層厚7 mm，翻轉角90°，矩陣240×140，F(xiàn)OV 360 mm×300 mm；（3）DWI 序列，TR 3 200 ms，TE 55 ms，層厚7 mm，翻轉角90°，矩陣240×140，F(xiàn)OV 375 mm×305 mm，以b 值=800 s/mm2的圖像重建表觀擴散系數(shù)圖。

1.4 圖像分析

由具有10 年與15 年工作經(jīng)驗的兩名放射科副主任醫(yī)師在對病理結果不知情的情況下閱片并達成一致意見，若有分歧則咨詢第三位具有20 年腹部影像診斷經(jīng)驗的主任醫(yī)師意見。當患者病灶數(shù)目≥2時，選擇最大者進行評估及測量。

根據(jù)LI-RADS v2018[18]對病灶進行評價。（1）HCC 主要征象包括：動脈期明顯強化、非周邊廓清、包膜強化、大??；（2）惡性腫瘤的輔助征象包括：結中結、馬賽克征、瘤內脂肪、瘤內出血、輕中度T2 高信號、暈狀強化；（3）LR-M（可能或確定的非HCC 惡性腫瘤）類征象包括：環(huán)形動脈期高強化、靶樣擴散受限、中央延遲強化、移行期靶征、肝膽期靶征。

其他MRI 定性特征：瘤內壞死或囊變（腫瘤內長T2信號且無強化的區(qū)域）[19]，肝膽期瘤周低信號（腫瘤周邊的不規(guī)則低信號區(qū)域）[20]，不光滑腫瘤邊緣（腫瘤邊緣結節(jié)狀突起伸入肝實質或邊界不清晰）[21]。定量特征：腫瘤-肝實質相對增強比（the relative enhancement ratio, RER）[22]。在平掃和增強動脈期、肝膽期圖像上選取腫瘤最大層面手工勾畫感興趣區(qū)（region of interest, ROI），避開血管、壞死等區(qū)域，測量腫瘤和鄰近肝實質的信號（signal intensity, SI），RER=（增強SI腫瘤/增強SI肝實質）/（平掃SI腫瘤/平掃SI肝實質）。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 22.0、Medcalc15.0 及R 軟件進行統(tǒng)計分析。分別比較訓練集、驗證集資料的組間差異，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）描述并采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位（上下四分位數(shù)）M（P25，P75）描述并采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料組間差異的比較采用卡方檢驗或Fisher 精確檢驗。將訓練集存在組間差異的臨床資料、影像特征納入單因素logistic 回歸分析，并將P＜0.1的變量進一步納入多因素logistic回歸分析。根據(jù)多因素分析結果構建列線圖并繪制校準曲線，使用Hosmer-Lemeshow 檢驗校準曲線擬合度，繪制臨床決策曲線評估預測模型的臨床適用性。計算所有患者的列線圖評分，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線評估預測評分的診斷效能，計算曲線下面積（area under the curve,AUC）、敏感度、特異度、準確度、陽性預測值及陰性預測值。當約登指數(shù)最大時取評分截斷值將患者分為高、低風險亞組。采用Kaplan-Meier 生存曲線及l(fā)og-rank 檢驗比較CK19 表達陽性、陰性組患者的總體無復發(fā)生存率；并比較模型預測高、低風險組患者的總體、早期及晚期無復發(fā)生存率。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

共納入HCC 患者病例220 例，其中男156 例，女64 例，年齡（58.6±9.1）歲。按7∶3 的比例隨機分為訓練集和驗證集，訓練集包括CK19 陽性組43 例、CK19 陰性組111 例，驗證集包括CK19 陽性組16 例、CK19 陰性組50 例。訓練集與驗證集HCC 患者的臨床病理資料如表1所示，組間比較顯示訓練集隊列的男性患者更少（P=0.008），其余資料差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。

表1 HCC患者的臨床病理資料的比較Tab.1 Comparison of clinical and pathological data of HCC patients

2.2 臨床影像資料

訓練集、驗證集CK19 陽性組與CK19 陰性組HCC 患者的臨床影像資料如表2所示。在訓練集中，CK19陽性組患者AFP水平更高，LR-M 分類、動脈期明顯強化、暈狀強化、環(huán)形動脈期高強化、靶樣擴散受限、瘤內壞死或囊變、不光滑腫瘤邊緣比例更高，肝膽期RER更低（P均＜0.05）；在驗證集中，CK19陽性組患者的LR-M 分類、動脈期明顯強化、環(huán)形動脈期高強化、靶樣擴散受限、不光滑腫瘤邊緣比例更高（P均＜0.05）。

表2 CK19陽性組與CK19陰性組HCC患者的臨床影像資料比較Tab.2 Comparison of clinical and imaging features between CK19-positive and CK19-negative HCC patients

2.3 訓練集單因素與多因素logistic回歸分析

單因素logistic 回歸分析結果顯示，動脈期明顯強化、暈狀強化、環(huán)形動脈期高強化、靶樣擴散受限、瘤內壞死或囊變、不光滑腫瘤邊緣、肝膽期RER 與CK19 陽性表達HCC 之間存在潛在相關性（P均＜0.05）。上述變量共同納入多因素logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)：暈狀強化（OR=3.432，95%CI：1.029～11.447；P=0.045）、環(huán)形動脈期高強化（OR=32.073，95%CI：1.874～549.040；P=0.017）、靶樣擴散受限（OR=12.941，95%CI：2.068～80.988；P=0.006）、不光滑腫瘤邊緣（OR=4.590，95%CI：1.359～15.505；P=0.014）及肝膽期RER（OR=0.014，95%CI：0.001～0.549；P=0.023）為CK19 陽性表達HCC 的獨立預測因素（表3）。典型病例的影像、病理表現(xiàn)見圖1。

表3 訓練集CK19陽性表達HCC的單因素及多因素logistic回歸分析Tab.3 Univariate and multivariate logistic regression analysis of CK19-positive expression in HCC in the training set

2.4 列線圖構建及模型驗證

基于logistic 回歸分析構建預測CK19 陽性表達HCC 的列線圖（圖2）并對各變量賦分，暈狀強化=23 分，環(huán)形動脈期高強化=50 分，靶樣擴散受限=57 分，不光滑腫瘤邊緣=26 分，肝膽期RER=-91 分×數(shù)值，各變量的分值總和即為每位患者的預測評分。當約登指數(shù)最大時，ROC 曲線分析得出的預測模型各項指標如表4所示，提示模型診斷效能較高。預測模型在訓練集、驗證集的AUC分別為0.884（95%CI：0.823～0.930）、0.748（95%CI：0.625～0.846），顯示模型的區(qū)分度較高；訓練集、驗證集的校準曲線（圖3）均顯示模型預測概率與實際概率之間一致性較好，Hosmer-Lemeshow 檢驗顯示擬合度較高；訓練集、驗證集的決策曲線（圖4）均顯示預測模型有較好的臨床適用性。

圖2 預測角蛋白19 陽性表達肝細胞癌（HCC）的列線圖。RER：腫瘤-肝實質相對增強比。Fig.2 Nomogram for predicting cytokeratin 19 positive expression in hepatocellular carcinoma (HCC).RER: the relative enhancement ratio.

表4 預測模型對CK19陽性HCC的診斷效能Tab.4 Diagnostic efficiency of predictive models for CK19-positive HCC

2.5 總隊列生存分析

CK19 表達陽性、陰性組患者的中位生存期分別為27.1（95%CI：23.1～31.1）個月、49.7（95%CI：37.7～61.6）個月；模型預測高、低風險組患者的中位生存期分別為26.1（95%CI：20.0～32.2）個月、52.1（95%CI：35.8～68.3）個月。Kaplan-Meier 生存曲線及l(fā)og-rank檢驗結果顯示：CK19 陽性組患者的總無復發(fā)生存率顯著差于CK19 陰性組（P=0.019）（圖5A），高風險組患者的總無復發(fā)生存率顯著差于低風險組（P=0.010）（圖5B）；高風險組患者的早期、晚期無復發(fā)生存率均顯著差于低風險組（P=0.035，P=0.017）（圖5C、5D）。

圖5 Kaplan-Meier生存曲線分別比較CK19陽性與陰性組的總體無復發(fā)生存率（5A），高風險與低風險組的總體（5B）、早期（5C）及晚期（5D）無復發(fā)生存率。Fig.5 Kaplan-Meier survival curves comparing overall recurrence-free survival rates between the CK19-positive and negative groups (5A), as well as overall (5B),early (5C) and late(5D) recurrence-free survival rates between high-risk and low-risk groups.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)暈狀強化、環(huán)形動脈期高強化、靶樣擴散受限、不光滑腫瘤邊緣、肝膽期RER 較低是HCC CK19表達的獨立預測因素，并根據(jù)列線圖對因素的危險程度量化賦分、對HCC 的CK19 表達風險進行分層。我們首次將LI-RADS v2018 及其他常用MRI 征象同時納入研究構建預測模型，并且討論了模型的預后價值，模型在驗證集的ROC 曲線下面積（0.748）、校準曲線及決策曲線分析結果體現(xiàn)了其在臨床上具有一定普適性和推廣性，有助于臨床制訂更合理的治療決策及改善患者預后。

3.1 LI-RADS及其他MRI特征分析

本研究發(fā)現(xiàn)暈狀強化是HCC CK19 表達的獨立預測因素。暈狀強化屬于LI-RADS 中支持惡性腫瘤的輔助征象，其生物學基礎是腫瘤細胞增殖阻塞病灶內的肝靜脈，導致血液流入腫瘤周圍的竇狀動脈或門靜脈，從而瘤周肝實質在動脈晚期或者門靜脈期強化[23]。既往有研究得出暈狀強化是預測HCC CK19 陽性表達的關鍵因素[24]，這與本研究的發(fā)現(xiàn)一致。此外，暈狀強化還被證實與HCC低分化、MVI密切相關[25-26]，提示該征象對于預測HCC的侵襲性方面具有重要價值，而CK19 陽性表達HCC 往往被歸為一種侵襲性表型。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)形動脈期高強化、靶樣擴散受限是HCC CK19 表達的獨立預測因素，這與先前研究結論一致[13-14,27]。動脈期環(huán)狀強化、靶樣擴散受限屬于LR-M 類靶樣征象，常見于膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）、混合型肝細胞-膽管細胞癌（combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma, cHCC-CC）及 不 典 型HCC[28]。這兩個征象可能是病灶邊緣腫瘤細胞豐富、中央纖維成分較多所致[29]，類似于ICC和cHCC-CC的病理學特征[30]。CK19表達易促進纖維間質增生[4]，預示HCC 有膽管細胞表型分化傾向，因此該類HCC 的組織學特征可介于典型HCC 與ICC 之間[15]，從而在影像學上表現(xiàn)為靶樣征象。在本研究中，訓練集CK19 陽性表達HCC 表現(xiàn)為LR-M 的發(fā)生率遠高于CK19 陰性表達HCC，這可能也是由于CK19 陽性表達HCC 的病理組織學特點所致，靶樣征象的出現(xiàn)使病灶更容易被判定為LR-M類。

本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤邊緣不光滑是HCC CK19 表達的獨立預測因素，這一結論與CHOI 等發(fā)現(xiàn)一致[12]。腫瘤邊緣不光滑反映了腫瘤的病理生長模式，包括局灶性結節(jié)突起型、多結節(jié)突起型或浸潤型，還可能提示包膜破裂或腫瘤細胞浸潤到肝實質中，代表腫瘤細胞的侵襲能力[31]。既往研究數(shù)據(jù)表明，CK19 陽性表達HCC 的大體病理更多表現(xiàn)為多結節(jié)突起融合、浸潤樣生長外觀，這也解釋了不光滑腫瘤邊緣在CK19 陽性表達HCC 出現(xiàn)更頻繁的組織學基礎[32]。本研究發(fā)現(xiàn)肝膽期RER 降低是HCC CK19 表達的獨立預測因素。正常肝實質在HBP表現(xiàn)為高信號是由于有機陰離子轉運多肽（OATP1B3）促進肝細胞對釓塞酸二鈉的攝取，而腫瘤細胞中OATP1B3 表達減少導致其在HBP 表現(xiàn)為低信號[33]。筆者認為，CK19 陽性表達HCC 的侵襲性生物行為可能使腫瘤細胞中OATP1B3 的表達進一步下調，細胞攝取功能不足造成腫瘤HBP信號更低，從而導致肝膽期RER減低。

3.2 預后評估

本研究發(fā)現(xiàn)，模型預測高低風險分組的總體復發(fā)、早期及晚期復發(fā)均存在顯著差異，提示HCC CK19表達的風險預測模型有助于評估HCC術后復發(fā)。先前研究已指出CK19陽性表達是HCC術后復發(fā)、轉移的危險因素[34-35]，本研究中CK19表達陽性組與模型預測高風險組患者的中位生存期相似，這一結果也提示預測模型與病理在評估預后方面具有相似作用。既往研究表明，不光滑腫瘤邊緣、暈狀強化與HCC術后侵襲、復發(fā)密切相關[36-37]。MOON等[38]發(fā)現(xiàn)，LR-M類靶樣征象（包括靶樣擴散受限、環(huán)形動脈期高強化）高度提示HCC患者預后不良。這與本研究結論類似，以上4個影像特征聯(lián)合肝膽期RER構建的CK19風險預測模型在評估HCC術后復發(fā)方面具有一定價值。

3.3 不足與展望

本研究具有以下局限性：首先，本研究為單中心回顧性研究，后續(xù)需進行進一步的多中心前瞻性研究以完善預測模型的構建與驗證；其次，本研究僅納入手術切除后的患者，可能存在一定選擇偏倚；最后，納入病例多有乙肝病毒感染病史，后期研究將納入更多其他肝病背景的HCC患者。

4 結論

綜上所述，基于LI-RADS v2018 及其他MRI 征象構建的預測模型可對HCC 的CK19 表達風險進行量化分層，將HCC 患者分為CK19 表達高風險和低風險人群，并可評估HCC患者術后復發(fā)，為臨床精準治療提供有效參考。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：張學琴設計本研究的方案，對稿件重要的智力內容進行了修改，獲得南通市科技計劃項目基金資助；魯夢恬起草和撰寫稿件，獲取、分析及解釋本研究的數(shù)據(jù)；瞿琦、徐磊、張繼云、劉茂童、姜吉鋒、張濤獲取、分析或解釋本研究的數(shù)據(jù)，對稿件重要的智力內容進行了修改；徐磊獲得南通市衛(wèi)生健康委科研課題基金資助；全體作者都同意發(fā)表最后的修改稿，同意對本研究的所有方面負責，確保本研究的準確性和誠信。