龔振翔, 侯紅艷, 巴 黎, 李澤慧, 彭思銳, 張 旻△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科 2檢驗科,武漢 430030

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種以上、下運動神經(jīng)元(motor neurons,MNs)同時受累為特征的致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,臨床表現(xiàn)為進展性加重的全身肌肉無力和萎縮,確診患者通常在3～5年內(nèi)死于嚴重的肺部感染和呼吸衰竭[1]。研究發(fā)現(xiàn),線粒體功能障礙、谷氨酸興奮毒性、外周免疫系統(tǒng)(peripheral immune system,PIS)和中樞免疫系統(tǒng)(central immune system,CIS)異常等均參與了ALS的神經(jīng)元死亡過程。但目前ALS的發(fā)病機制仍未完全明確,因此在治療上仍面臨藥物種類少、效果差的難題。近年來ALS已被證實是一種非神經(jīng)元自主性疾病,膠質(zhì)細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)內(nèi)浸潤的外周免疫細胞[2-7]在MNs的變性中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,促炎的神經(jīng)免疫微環(huán)境參與了ALS發(fā)生發(fā)展的全過程[8-9]。最新的研究證據(jù)顯示CIS與PIS之間的“免疫串擾”會加速MNs的變性過程,PIS異常與疾病進展的關(guān)聯(lián)已成為ALS領(lǐng)域的研究熱點。但多數(shù)研究只關(guān)注了ALS患者與健康對照之間外周血淋巴細胞的區(qū)別,僅有少量研究探討了外周血淋巴細胞與ALS疾病進展的關(guān)系,且并未對淋巴細胞亞群進行精細的免疫分型。針對亞洲人群,尤其是中國ALS患者外周血淋巴細胞亞群的研究尤為缺乏。本研究對133名來自華中地區(qū)的ALS患者進行外周血淋巴細胞亞群的詳細檢測,分析了其與疾病進展的關(guān)系,為進一步闡明ALS患者的PIS異常奠定基礎(chǔ),同時也為尋找延緩ALS疾病進展的治療靶點提供思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究納入了2020年1月至2023年5月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的133名來自華中地區(qū)(河南省、湖北省、湖南省)的ALS患者。項目獲得華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(批準號:TJ-IRB20201219),所有參與者均簽署了知情同意書。具體納入標準如下:①年齡≥18歲,根據(jù)修訂版El Escorial標準[10]診斷為可能、很可能和確診的ALS;②肝腎功能正常。排除標準為:①合并其他神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、免疫系統(tǒng)疾病或血液病;②存在急性感染或慢性傳染性疾病活動狀態(tài)的證據(jù),如可檢出乙肝DNA拷貝,人類獲得性免疫缺陷病毒攜帶等。

1.2 臨床資料收集

收集ALS患者年齡、身高、體重、病程、既往病史等資料。使用修訂版肌萎縮側(cè)索硬化功能評分(Revised ALS Functional Rating Scale,ALSFRS-R)對患者進行運動功能評估(滿分為48分,分數(shù)越低代表運動功能越差)[11],計算得到疾病進展率=(48分-入院時ALSFRS-R得分)/病程月數(shù)。根據(jù)既往文獻,將疾病進展率>0.5者判定為快進展組,疾病進展率≤0.5者判定為慢進展組[12]。同時,根據(jù)國王臨床分期(King’s ALS clinical staging)系統(tǒng),將ALS患者分為一期至四期4個臨床階段,從一期至四期受損的運動功能域依次增多[13]。

1.3 慢進展組與快進展組ALS患者外周血淋巴細胞亞群分析

使用含肝素鈉的真空采血管于清晨6～7時采集所有患者空腹狀態(tài)下的靜脈血,并在1 h內(nèi)轉(zhuǎn)運至實驗室進行樣本處理。具體流程如下:將50 μL全血與6色混合TBNK抗體(BD Biosciences,662967)在室溫下孵育15 min,加入450 μL FACS裂解液(BD Biosciences,555899)后,用FACS Canto流式細胞儀和FACS Canto臨床軟件對數(shù)據(jù)進行分析,對CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和NK細胞進行分群。再取3份體積為100 μL的全血,分兩組對淋巴細胞亞群進行更為詳細的分類和測定。第一組使用的抗體組合為anti-CD45-PerCP(BD Pharmingen,2D1),anti-CD3-APC-H7(BD Pharmingen,SK7),anti-CD4-V450(BD Pharmingen,RPA-T4),anti-CD8-PE/Cy7(BD Pharmingen,SK1),anti-CD28-PE(BD Pharmingen,L293),以及anti-HLA-DR-APC(BD Pharmingen,L243)。第二組使用的抗體組合為anti-CD45-PerCP(BD Pharmingen,2D1),anti-CD3-APC-H7(BD Pharmingen,SK7),anti-CD4-BV510(BD Pharmingen,SK3),anti-CD45RA-FITC(BD Pharmingen,L48),anti-CD8-PE/Cy7(BD Pharmingen,SK1),anti-CCR7-PE(BD Pharmingen,3D12),anti-CD25-APC(BD Pharmingen,2A3)及anti-CD127-BV421(BD Pharmingen,HIL-7R-M21)。有關(guān)流式細胞術(shù)更為具體的參數(shù)及方法參考既往同濟醫(yī)院檢驗科已發(fā)表的論文[14]。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)型數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。不符合正態(tài)分布的連續(xù)型數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示,組間比較采用曼-惠特尼U檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)表示,組間比較采用卡方檢驗。使用二元Logistic回歸分析外周血淋巴細胞亞群與ALS疾病進展的關(guān)系,結(jié)果表示為OR(95%CI)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義(雙側(cè)檢驗)。

2 結(jié)果

2.1 慢進展組與快進展組ALS患者人口學資料的比較

根據(jù)患者的疾病進展率,69名ALS患者納入快進展組,64名ALS患者納入慢進展組。兩組患者的年齡平均值均為56歲,在性別構(gòu)成、身高和體重上兩組患者間差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。在慢進展組和快進展組臨床特征的比較中,慢進展組患者的平均起病年齡為54歲,快進展組患者的平均起病年齡為55歲(P>0.05),兩組患者球部和肢體起病人數(shù)的構(gòu)成比差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。慢進展組患者ALSFRS-R評分中位數(shù)高于快進展組(44分vs.38分,P<0.01),同時慢進展組患者的病程中位數(shù)長于快進展組(14月vs.8月,P<0.01),見表1。

表1 人口學及臨床特征或M(P25,P75)]Table 1 Demographic and clinical characteristics

2.2 慢進展組與快進展組ALS患者血常規(guī)數(shù)據(jù)的比較

在進行外周血淋巴細胞亞群的分析前,本研究首先對慢進展組患者和快進展組患者的血常規(guī)數(shù)據(jù)進行了比較。兩組患者在紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)、嗜酸性粒細胞計數(shù)、嗜堿性粒細胞計數(shù)和血紅蛋白濃度上差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 慢進展組與快進展組ALS患者血常規(guī)數(shù)據(jù)比較或M(P25,P75)]Table 2 Comparison of blood routine data between ALS patients with slow and fast or M(P25,P75)]

2.3 慢進展組與快進展組ALS患者淋巴細胞亞群數(shù)據(jù)的比較

通過流式細胞術(shù)和流式細胞分析軟件,本研究共對29種外周血淋巴細胞亞群指標進行了統(tǒng)計分析。其中,慢進展組患者總T淋巴細胞(CD3+CD19-)比例顯著低于快進展組患者(P<0.05),慢進展組患者輔助性T細胞比例低于快進展組患者(P<0.05)但其計數(shù)在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。慢進展組患者NK細胞計數(shù)和NK細胞比例均顯著高于快進展組患者(均P<0.05),同時慢進展組患者表達第二信號受體的輔助性T細胞(CD28+Th)占輔助性T細胞的比例顯著高于快進展組(P<0.05)。在其他淋巴細胞亞群的比較中,未發(fā)現(xiàn)慢進展組與快進展組患者存在具有統(tǒng)計學意義的差異。見表3。

表3 慢進展組與快進展組ALS患者淋巴細胞亞群的比較或M(P25,P75)]Table 3 Comparison of lymphocyte subgroups between ALS patients with slow and fast or M(P25,P75)]

2.4 NK細胞計數(shù)與患者疾病進展率的相關(guān)性分析

在控制性別、年齡、身高、體重等混雜因素的前提下,以慢進展組和快進展組外周血淋巴細胞亞群比較中差異具有顯著性意義的淋巴細胞亞群指標(總T淋巴細胞比例、NK細胞計數(shù)以及CD28+Th/Th)作為自變量,以疾病進展分組作為因變量,進行二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示,NK細胞計數(shù)的OR(95%CI)為0.992(0.986,0.997)(P<0.05),CD28+Th/Th的OR(95%CI)為0.895(0.818,0.979)(P<0.05),即NK細胞計數(shù)、CD28+Th細胞與Th細胞的比值升高是ALS疾病進展的保護性因素。見表4。

表4 外周血淋巴細胞亞群與ALS疾病進展的Logistic回歸分析Table 4 Logistic regression analysis of peripheral blood lymphocyte subgroups and ALS progression

3 討論

本研究通過對來自華中地區(qū)的133名ALS患者進行疾病進展評估和外周血淋巴細胞亞群測定,發(fā)現(xiàn)慢進展的ALS患者外周血NK細胞數(shù)量、CD28+Th/Th比值顯著高于快進展的ALS患者,NK細胞數(shù)量和Th細胞表面CD28的高表達是ALS疾病進展的保護性因素。NK細胞是固有免疫系統(tǒng)最重要的組成部分,固有免疫系統(tǒng)異?？赡軈⑴c了ALS的進展過程。

既往有關(guān)ALS外周免疫特征的研究多數(shù)關(guān)注ALS患者與健康對照之間的區(qū)別,只有少數(shù)研究初步探討了外周血淋巴細胞改變和ALS進展的關(guān)系[15]。在一項納入了119名ALS患者的縱向隊列研究中發(fā)現(xiàn)中性粒細胞的增多和Th細胞的減少是ALS疾病進展的危險因素[16]。另一項納入了90名ALS患者的橫斷面研究報導(dǎo)了CD16-單核細胞的減少以及中性粒細胞與CD16-單核細胞比值的降低與ALS的疾病進展有關(guān)[17]。此外,還有兩項臨床研究發(fā)現(xiàn)外周血調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg)數(shù)量的減少與ALS的進展相關(guān),但其中一項使用的病情評估工具并非標準化的ALSFRS-R評分[18],另一項研究則僅納入了33名ALS患者[19]。與既往研究不同,本研究發(fā)現(xiàn)快進展與慢進展ALS患者外周血淋巴細胞最顯著的差異在于慢進展ALS患者的NK細胞數(shù)量更多,并首次發(fā)現(xiàn)Th細胞表面第二信號受體CD28的表達可能是ALS進展的保護性因素。

近年來,固有免疫系統(tǒng),尤其是NK細胞,在ALS的研究中受到越來越多的關(guān)注。NK細胞是一類在固有免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的淋巴細胞,它們能夠識別并摧毀異常的或受到病原體感染的細胞[20],并作為連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的重要橋梁參與了對適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)[21]。在ALS疾病進展的過程中,脊髓內(nèi)異常激活的小膠質(zhì)細胞所導(dǎo)致的高炎癥水平是促使運動神經(jīng)元死亡的重要原因[22-23]。早期的動物研究發(fā)現(xiàn),ALS模型小鼠(SOD1G93A)的脊髓中除了有T細胞的浸潤外,還有NK細胞的浸潤,且脊髓內(nèi)NK細胞的浸潤在疾病的早期最為明顯,提示在ALS病理過程啟動后NK細胞在脊髓免疫微環(huán)境的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用[24]。且最近的研究證據(jù)顯示,病理狀態(tài)下,CNS中浸潤的免疫細胞很大程度上依賴于外周向中樞的趨化和募集。與T細胞類似,NK細胞也具有不同的免疫表型,CD16-CD56brightNK細胞是人體分泌γ-干擾素的主要NK細胞亞群,而CD16+CD56dim細胞則是人體內(nèi)行使細胞毒性和殺傷作用的主要NK細胞亞群[25-26]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn),癥狀前期的SOD1G93A小鼠脊髓中有NKp46+的活化NK細胞浸潤,該亞型的NK細胞高表達顆粒酶B和細胞毒性因子CD69,對運動神經(jīng)元有一定程度的殺傷作用[27]。而在自身免疫性腦脊髓炎小鼠中由外周募集至硬脊膜淋巴管的NK細胞則可以通過分泌γ-干擾素誘導(dǎo)脊髓內(nèi)的星形膠質(zhì)細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,高表達溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1,LAMP1)和促凋亡死亡受體配體(CD253),進而誘導(dǎo)脊髓內(nèi)的細胞毒性T細胞發(fā)生凋亡,以發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、維持脊髓內(nèi)免疫微環(huán)境平衡的作用[28]。本研究中快進展組患者外周血淋巴細胞中NK細胞數(shù)量較低,可能引起由PIS向CIS募集的NK細胞不足,導(dǎo)致CNS中缺乏足夠數(shù)量的NK細胞參與MNs所在的免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)。在既往的臨床研究中,有報道稱慢進展ALS患者外周血中CD16dimCD56brightNK細胞數(shù)量增多[29];ALS患者外周血中NK細胞上NKp30的表達量與ALSFRS-R評分的變化呈負相關(guān)關(guān)系。此前本團隊的一項孟德爾隨機化研究證實,CD16-NK及HLA-DR+NK細胞表面CD56表達量的升高是ALS的保護性因素[30],從另一個側(cè)面印證了本研究的發(fā)現(xiàn)。當然,如果想更為深入地探討NK細胞參與ALS疾病進展的機制,還需要在后續(xù)的研究中對ALS患者外周血和腦脊液中的NK細胞進行更多的表面標志物鑒定。

第二信號受體CD28是T細胞表面的一類共刺激分子,CD28與抗原遞呈細胞表面上的分子結(jié)合,能促進T細胞的存活、增殖以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD28+Th細胞是一種活化的Th細胞亞群,具有下調(diào)高免疫炎癥水平的作用,對于維持體內(nèi)Treg細胞的數(shù)量和正常功能至關(guān)重要[31-32]。臨床研究發(fā)現(xiàn),快速進展的ALS患者外周血中Treg細胞減少,而最新的小規(guī)模臨床隨機對照研究顯示,體外擴增回輸Treg細胞可以減緩ALS患者的進展[33]。因此,CD28分子是未來ALS研究中值得探討的免疫調(diào)節(jié)新靶點。

本研究也存在一定的局限性。首先,本研究為單中心研究,樣本量相對較小,所得結(jié)論有待于更大樣本量的多中心研究進一步驗證;其次,由于ALS患者ALSFRS-R評分的下降是非線性的,根據(jù)入院時ALSFRS-R評分計算的疾病進展率對患者的疾病進展進行分類并不完全準確,未來通過縱向隊列研究,動態(tài)隨訪和收集ALSFRS-R評分隨病程變化的數(shù)據(jù),所得到的結(jié)論將更具科學性。