蔡 文, 季維雪, 肖 蘭, 江飛云△, 陳文剛, 陶云松

華東師范大學(xué)附屬蕪湖醫(yī)院(蕪湖市第二人民醫(yī)院) 1婦科 4藥劑科,蕪湖 241001 2中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,合肥 230022 3皖南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科,蕪湖 241001

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最致命的惡性腫瘤,在全球女性腫瘤相關(guān)死亡率中居首[1]。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中存在多種miRNA表達(dá)異常,其中miR-214作為重要分子樞紐之一參與腫瘤網(wǎng)絡(luò)調(diào)控[2]。miR-214經(jīng)由Dicer酶環(huán)狀前體剪切后分為miR-214-3p以及miR-214-5p,多數(shù)情況下miR-214-3p在腫瘤中表達(dá)下調(diào),發(fā)揮抑癌基因作用。卵巢癌是預(yù)后最差的婦科惡性腫瘤,因其極易發(fā)生化療耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,晚期患者5年生存率僅為30%,臨床治療失敗往往歸因于腫瘤細(xì)胞多藥耐藥,研究發(fā)現(xiàn)miR-214-3p作為腫瘤抑癌基因可能參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥[3-4]。最新研究表明,腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性自噬與腫瘤細(xì)胞增殖及耐藥等密切相關(guān)[5-6]。而在多項(xiàng)來(lái)自體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中,我們看到應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs)做預(yù)處理后,可通過(guò)抑制腫瘤耐藥細(xì)胞保護(hù)性自噬,從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性提高[7-8]。

本研究擬從組織水平檢測(cè)miR-214-3p和自噬蛋白p62表達(dá)并分析兩者關(guān)系,細(xì)胞水平探討奧美拉唑(omeprazole,OME)對(duì)miR-214-3p介導(dǎo)自噬的抑制及對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞順鉑(DDP)敏感性的影響,為質(zhì)子泵抑制劑應(yīng)用于腫瘤化療提供進(jìn)一步的基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及細(xì)胞株

人卵巢癌順鉑敏感株OV2008和順鉑耐藥細(xì)胞株C13K為本實(shí)驗(yàn)室收集保存。所用順鉑均購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司;艾司奧美拉唑注射液由阿斯利康制藥公司購(gòu)得;SYBR Green Master Mix由TaKaRa公司購(gòu)得;反轉(zhuǎn)錄試劑盒由TaKaRa公司購(gòu)得;p-gp抗體由英國(guó)Santa Cruz公司購(gòu)得;p62及LC3-B抗體由美國(guó)Cell Signal公司購(gòu)得;CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司;蛋白酶k由上海翊圣生物科技有限公司購(gòu)得;U6引物由上海吉瑪公司購(gòu)得;miR-214-3p莖環(huán)引物由上海吉瑪公司購(gòu)得,MDR1引物則由上海生工公司合成提供,相關(guān)序列見(jiàn)表1。

表1 miR-214-3p、MDR1及U6引物序列Table 1 miR-214-3p,MDR1 and U6 primer sequences

1.2 患者資料

選取2015年1月至2018年12月期間在華東師范大學(xué)附屬蕪湖醫(yī)院(蕪湖市第二人民醫(yī)院)行手術(shù)治療的43例上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)患者的病理標(biāo)本(每例患者術(shù)前均未接受相關(guān)治療)?；颊吣挲g(50.27±6.36)歲,術(shù)后均接受化療。按照卵巢癌FIGO的分期標(biāo)準(zhǔn)行手術(shù)病理分期,43例患者中Ⅰ～Ⅱ期12例,Ⅲ～Ⅳ期31例。所有標(biāo)本收集均獲得患者知情并簽訂知情同意書(shū),并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),43例患者均術(shù)后持續(xù)跟蹤調(diào)查患者情況,根據(jù)患者的無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS),將患者分類(lèi)為鉑敏感組(PFS≥12個(gè)月)和鉑相對(duì)耐藥組(包括鉑部分敏感:12個(gè)月>PFS>6個(gè)月;鉑耐藥組:PFS≤6個(gè)月)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)分組 在5% CO2濃度、飽和濕度及37 ℃培養(yǎng)條件下,用含10%小牛血清1640培養(yǎng)液,將C13K和OV2008細(xì)胞孵育培養(yǎng);設(shè)空白對(duì)照組、順鉑組及順鉑+大劑量OME(150 μmol/L)預(yù)處理組(順鉑+OME組),OME(150 μmol/L)預(yù)處理時(shí)間為24 h,之后順鉑再行處理24 h。

1.3.2 CISH法檢測(cè)miR-214-3p水平 組織標(biāo)本采用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋,切片厚度為4μm。經(jīng)脫蠟和水化處理,再用蛋白酶k(10 μL/mL)消化和脫水,用0.2%甘氨酸,4%多聚甲醛去除蛋白質(zhì)后,置于雜交溶液中,60 ℃下預(yù)雜交2 h,然后加入DIG標(biāo)記的miRCURYLNA探針(EXIQON),60 ℃下雜交16 h。洗滌處理后,4 ℃下孵育抗DIG-AP Fab片段(Roche)并過(guò)夜,第2天用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液沖洗,再用堿性磷酸酶顯色液處理直至顯色,再水洗殘液,用乙醇脫水,封片,再用蘇木精復(fù)染,最后采用中性樹(shù)膠封片。

1.3.3 p62蛋白檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法,先將切片進(jìn)行抗原修復(fù),然后給予脫蠟、脫二甲苯、3% H2O2封閉,并給予枸櫞酸修復(fù)液微波修復(fù),4 ℃下,一抗p62(1∶1000)孵育過(guò)夜,第二天復(fù)溫后,37 ℃下抗兔二抗(1∶2000)孵育30 min,PBS沖洗3次,每次5 min,隨后在顯微鏡下加5% DAB顯色。再給予蘇木精復(fù)染、乙醇化、脫水和中性樹(shù)膠封片,并置于室溫風(fēng)干。將切片放在光鏡下觀察,每例均隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野,細(xì)胞質(zhì)中找到棕褐色細(xì)顆粒視為p62蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑IC50以1×104/mL細(xì)胞濃度鋪96孔板,每孔100 μl細(xì)胞懸液,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后去除培養(yǎng)液,用DDP(0～200 μmol/L)培養(yǎng)24 h后。置于新鮮培養(yǎng)液,同時(shí)加入10 μL的CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后在450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔細(xì)胞吸光度值(A)平均值,根據(jù)公式:抑制率(%)=(1—實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%,計(jì)算出細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率,再根據(jù)抑制率計(jì)算CCK-8檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-214-3p、MDR1 mRNA水平 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次,每次均以RNA試劑盒提取細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6為內(nèi)參照,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,在ABI7300反應(yīng)平臺(tái)上進(jìn)行PCR反應(yīng),以2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-214-3p、MDR1相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 免疫印跡法檢測(cè) 取30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上;室溫封閉2 h,用含0.05%吐溫-20的TBS緩沖液(TBST)漂洗10 min,重復(fù)3次;加入相應(yīng)p-gp一抗(1∶800)及p62一抗(1∶1000),4℃下孵育過(guò)夜。TBST再次漂洗3次后加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶10000),37℃下?lián)u床溫育2 h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用圖像處理軟件Image J統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EOC組織中miR-214-3p及p62表達(dá)

結(jié)果顯示,miR-214-3p在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá)低于鉑敏感EOC[(0.67±0.32)vs.(1.53±0.82),(P<0.05)],相反,p62在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá)明顯高于鉑敏感EOC[(3.23±0.48)vs.(0.23±0.12),(P<0.01)],見(jiàn)圖1。

A:miR-214-3p在鉑敏感EOC中表達(dá);B:miR-214-3p在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá);C:p62在鉑敏感EOC中表達(dá);D:p62在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá)

2.2 EOC中miR-214-3p表達(dá)與p62表達(dá)的相關(guān)性分析

原位雜交免疫組化結(jié)果顯示,30例鉑敏感EOC組織中有20例呈miR-214-3p陽(yáng)性,而13例鉑相對(duì)耐藥EOC組織中僅3例為miR-214-3p陽(yáng)性;26例EOC中p62表達(dá)陽(yáng)性,其中6例為鉑敏感EOC,20例為鉑相對(duì)耐藥EOC。miR-214-3p在鉑敏感EOC中表達(dá)較高,而在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá)低;相反,p62在鉑敏感EOC中表達(dá)較低,而在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá)高。Pearson相關(guān)分析顯示miR-214-3p和p62在EOC組織中表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.387,P=0.005),見(jiàn)表2。

表2 EOC組織miR-214-3p與p62蛋白表達(dá)量的關(guān)系Table 2 Relationship between miR-214-3p and p62 protein in EOC tissue

2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑藥物IC50

OV2008和C13K細(xì)胞對(duì)順鉑的IC50分別為(27.82±0.76)μmol/L、(96.18±2.52)μmol/L,OME(150 μmol/L)預(yù)處理后,OV2008及C13K細(xì)胞對(duì)順鉑IC50均有不同程度降低,分別為(18.46±0.63)μmol/L、(30.18±1.07)μmol/L,尤以順鉑耐藥株C13K更為顯著(P<0.01),提示細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性明顯提高。

2.4 各組OV2008及C13K細(xì)胞中miR-214-3p及MDR1 mRNA表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR顯示OV2008中miR-214-3p mRNA表達(dá)水平高于C13K,表達(dá)水平為(0.975±0.073)和(0.074±0.015)(P<0.01);C13K中MDR1 mRNA表達(dá)水平高于OV2008,表達(dá)水平為(7.940±1.120)vs.(0.926±0.090)(P<0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-214-3p mRNA在OV2008和C13K細(xì)胞順鉑組及順鉑+OME組分別為(0.121±0.030)、(0.402±0.089)和(0.007±0.001)、(0.024±0.007),與OV2008及C13K空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。OV2008和C13K細(xì)胞順鉑組及OME+順鉑組中MDR1 mRNA分別為(2.090±1.520)、(1.160±0.610)和(27.840±8.160)、(11.520±2.510),與OV2008及SKOV3空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

2.5 各組OV2008及C13K細(xì)胞中p-gp及p62蛋白表達(dá)

順鉑敏感株OV2008中p-gp及p62表達(dá)均較順鉑耐藥株C13K中的水平為低。順鉑作用后,C13K及OV2008細(xì)胞中p-gp及p62蛋白水平均有所上升;OME(150 μmol/L)預(yù)處理后,在相同濃度順鉑作用下,C13K及OV2008細(xì)胞中p-gp及p62蛋白水平均下降,尤以順鉑耐藥株C13K更為顯著(均P<0.05),見(jiàn)圖2。

1:OV2008空白對(duì)照組;2:OV2008順鉑組;3:OV2008順鉑+OME組;4:C13K空白對(duì)照組;5:C13K順鉑組;6:C13K順鉑+OME組

3 討論

改善化療耐藥是臨床上腫瘤患者治療的關(guān)鍵,部分臨床常用非細(xì)胞毒性藥物作為增敏劑,可改善化療藥物療效或逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)化療藥物耐藥性。質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)作為抑酸藥物,主要用于治療酸相關(guān)性疾病。近期有研究發(fā)現(xiàn)PPIs可抑制腫瘤細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性,并影響食管癌中耐藥相關(guān)miRNA表達(dá)[9]。miR-214-3p可通過(guò)抑制自噬增強(qiáng)結(jié)直腸癌的放射敏感性[10]。另有研究則證實(shí)miR-214-3p可通過(guò)抑制自噬增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)三苯氧胺和富爾韋司特的敏感性[11],以上研究結(jié)果均提示miR-214-3p對(duì)自噬有一定調(diào)控作用,而關(guān)于PPI是否通過(guò)抑制miR-214-3p調(diào)控的自噬實(shí)現(xiàn)增敏,國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道,有必要深入研究。

本研究中43例EOC組織中miR-214-3p陽(yáng)性表達(dá)率為53.5%,鉑相對(duì)耐藥EOC中miR-214-3p表達(dá)低于鉑敏感EOC,提示miR-214-3p與卵巢癌鉑耐藥相關(guān),與國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道一致[12-13]。p62蛋白在細(xì)胞自噬過(guò)程中起到分子調(diào)節(jié)器的作用,亦是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白之一[14]。p62高表達(dá)還是卵巢癌進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素[15]。多項(xiàng)研究顯示,鉑耐藥的卵巢上皮癌細(xì)胞內(nèi)p62水平明顯增高[16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)與miR-214-3p表達(dá)相反,p62在鉑敏感EOC中表達(dá)較低,而在鉑相對(duì)耐藥EOC中表達(dá)高,miR-214-3p和p62表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān),miR-214-3p與p62水平與卵巢癌鉑類(lèi)藥物的治療反應(yīng)相關(guān)。

人卵巢癌細(xì)胞株OV2008及C13K經(jīng)DDP處理后,兩株細(xì)胞中p62蛋白較空白對(duì)照組顯著增加,miR-214-3p相對(duì)表達(dá)下降,表明DDP能誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞自噬。OME是第二代PPI,本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)OME預(yù)處理可抑制V-H+-ATP酶表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)pH值降低,逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)外pH梯度,同時(shí)抑制Yes相關(guān)蛋白(YAP)介導(dǎo)的自噬,從而提高人卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感性[7]。本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示OME(150 μmol/L)預(yù)處理可使C13K及OV2008細(xì)胞對(duì)DDP敏感性增加,細(xì)胞中miR-214-3p相對(duì)表達(dá)明顯升高、MDR1在蛋白及mRNA水平表達(dá)降低、p62蛋白表達(dá)下降,與空白對(duì)照組比較差異顯著,進(jìn)一步驗(yàn)證了OME可能是一種潛在的腫瘤耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)劑。

綜上可見(jiàn),miR-214-3p在EOC細(xì)胞中低表達(dá),且與鉑耐藥有關(guān)。OME預(yù)處理可提高人卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性,其機(jī)制可能與抑制miR-214-3p調(diào)控的自噬有關(guān),同時(shí)為PPIs類(lèi)藥物作為高效低毒性的化療增敏劑提供了一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。