關(guān) 森, 王慧淼, 汪冬梅, 胡 杰△

河北省承德市中心醫(yī)院 1麻醉科 2檢驗科 3內(nèi)分泌科,承德 067000

作為阿片類藥物,嗎啡(morphine,Mor)被廣泛用于臨床急慢性疼痛的治療[1-2]。然而長期使用嗎啡導(dǎo)致藥物耐受性,其鎮(zhèn)痛效果減弱,加重患者治療不適感[3]。在慢性嗎啡耐受大鼠模型的脊髓組織中,神經(jīng)小膠質(zhì)細胞活化,促炎因子水平升高[4]。降低促炎因子水平或抑制膠質(zhì)細胞活化可減輕嗎啡耐受癥狀[5-6]?？吕锢?corilagin,Cor),一種提取自中草藥的水溶性逆沒食子酸鞣質(zhì),可抑制輻射誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化,發(fā)揮抗炎作用,減少促炎性介質(zhì)生成[7-8]。本文旨在探索柯里拉京對慢性嗎啡耐受的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料

30只SPF級雄性SD大鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司;鹽酸嗎啡注射液購自沈陽第一制藥廠;柯里拉京購自成都儀睿生物科技有限公司;ELISA試劑購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。Iba-1、ERK和JNK抗體購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司,p-ERK、p-JNK、p-p38和p38抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2 動物實驗和分組

將SPF級雄性SD大鼠(8～9周,體重200～280 g)置于標(biāo)準(zhǔn)實驗室中飼養(yǎng),室溫(22±1)℃,自由進食。將大鼠隨機分為對照(Control,n=6)組、柯里拉京(Cor,n=6)組,嗎啡(Mor,n=6)組,嗎啡+低柯里拉京(Mor+Cor 10 mg/kg,n=6)組和嗎啡+高柯里拉京(Mor+Cor 20 mg/kg,n=6)組。對照組大鼠注射等體積生理鹽水?？吕锢┙M大鼠腹腔注射20 mg/kg的柯里拉京和生理鹽水。嗎啡組大鼠皮下注射嗎啡10 mg/kg和生理鹽水,以建立慢性嗎啡鎮(zhèn)痛大鼠耐受模型。大鼠在注射嗎啡14 d后形成較為穩(wěn)定的機械痛敏,標(biāo)志慢性嗎啡耐受模型建立成功[9]。嗎啡+低柯里拉京(10 mg/kg)組和嗎啡+高柯里拉京(20 mg/kg)組的大鼠在嗎啡給藥30 min前分別腹腔注射10 mg/kg和20 mg/kg柯里拉京,連續(xù)給藥14 d[10]。動物飼養(yǎng)過程符合國際實驗動物評估和認(rèn)證協(xié)會的動物福利指南,動物研究方案獲得了我院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 水浴甩尾法 將大鼠固定,取其尾部末端1/3放入(50±0.2)℃水浴鍋中,記錄大鼠尾部從入水到開始甩尾的時間(tail flick latency,TFL)。每只大鼠測3次,測試間隔5 min,取其平均值為基礎(chǔ)甩尾潛伏期(baseline latency,BL)。為防止?fàn)C傷,若小鼠15 s未甩尾,則TFL記為15 s。大鼠最大鎮(zhèn)痛效能計算公式如下:最大效應(yīng)百分?jǐn)?shù)(maximal possible effect,MPE)=(TFL-BL)/(15-BL)×100%。分別于第1、3、5、7、9 d測定各組大鼠甩尾潛伏期。

1.3.2 免疫熒光法 經(jīng)過藥物處理14 d后,用50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠,在冰上迅速分離出脊髓的腰膨大節(jié)段。將組織切片(30 μm)用4%多聚甲醛固定15 min,用Triton X-100透化切片15 min。然后用10%正常山羊血清封閉1 h。經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,將切片與一抗Iba-1在4℃下孵育過夜,而后與二抗室溫孵育1 h。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚溶液染色5 min。最后,使用共聚焦激光掃描熒光顯微鏡對切片進行觀察,軟件FV10-AW測量免疫活性染色的吸光度,計算陽性細胞率。

1.3.3 蛋白免疫印跡實驗 使用RIPA(radio immunoprecipitation assay)緩沖液裂解脊髓組織,BCA(bicinchoninic acid)試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。15 μg蛋白樣品進行電泳分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上,將膜室溫封閉2 h,與Iba-1、p-ERK、p-JNK、p-p38、ERK、JNK、p38一抗在4℃下孵育過夜,次日將膜與二抗室溫孵育2 h。加入增強型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)底物發(fā)光試劑,用dyssey紅外成像系統(tǒng)檢查印跡,以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 按說明書操作,用ELISA試劑盒檢測脊髓組織中炎癥因子IL-6,TNF-α和IL-1β的表達。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 利用Trizol試劑提取總的RNA。按照說明書,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA。借助SYBR Green進行PCR反應(yīng)。擴增條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共40個循環(huán)。引物序列如下:IL-6,正向:5′-AGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′,反向:5′-AGTCTCCT-CTCCGGACTTGT-3′;TNF-α,正向:5′-AACACACGAGACGCTGAAGT-3′,反向:5′-TCCAGTGAGTTCCGAAAGCC-3′;IL-1β,正向:5′-GAG-TCTGCACAGTTCCCCAA-3′,反向:5′-ATGTCCCGACCATTGCTGTT-3′;GAPDH,正向:5′-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3′,反向:5′-GA-TGGTGATGGGTTTCCCGT-3′?；虻南鄬Ρ磉_量由2-ΔΔCt法計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 柯里拉京增加對嗎啡耐受大鼠的鎮(zhèn)痛作用

如圖1所示,與對照組相比,嗎啡組的鎮(zhèn)痛作用隨時間推移逐漸降低(均P<0.01)。與嗎啡組相比,柯里拉京給藥后延緩了嗎啡鎮(zhèn)痛作用的消失(均P<0.05)。

與對照組比較,**P<0.01;與嗎啡組比較,#P<0.05 ##P<0.01

2.2 柯里拉京降低嗎啡耐受大鼠的小膠質(zhì)細胞活化

如圖2所示,與對照組比較,嗎啡組Iba-1的陽性細胞率顯著增加,柯里拉京預(yù)處理后,陽性細胞率顯著降低。與對照組相比,嗎啡組Iba-1蛋白表達顯著增加,柯里拉京預(yù)處理后,Iba-1蛋白表達逐步降低。

1:對照組;2:柯里拉京(20 mg/kg)組;3:嗎啡組;4:嗎啡+低柯里拉京(10 mg/kg)組;5:嗎啡+高柯里拉京(20 mg/kg)組;A:免疫熒光檢測Iba-1陽性細胞率;B:蛋白免疫印跡法檢測Iba-1表達;與對照組比較,**P<0.01;與嗎啡組比較,#P<0.05 ##P<0.01

2.3 柯里拉京降低嗎啡耐受大鼠脊髓炎性細胞因子的釋放

如圖3所示,與對照組比較,嗎啡組炎性因子表達顯著增加,柯里拉京預(yù)處理后,炎性因子表達顯著降低。與對照組比較,嗎啡組炎性因子mRNA表達水平顯著上升,柯里拉京預(yù)處理后,炎性因子mRNA表達顯著下調(diào)。

1:對照組;2:柯里拉京(20 mg/kg)組;3:嗎啡組;4:嗎啡+低柯里拉京(10 mg/kg)組;5:嗎啡+高柯里拉京(20 mg/kg)組;A～C:ELISA試劑盒檢測炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β表達;D:qRT-PCR檢測炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達;與對照組比較,**P<0.01;與嗎啡組比較,#P<0.05 ##P<0.01

2.4 柯里拉京抑制嗎啡耐受大鼠脊髓中MAPK信號通路的激活

如圖4所示,與對照組比較,嗎啡組p-ERK、p-JNK和p-p38表達顯著增加,柯里拉京預(yù)處理后,p-ERK、p-JNK和p-p38表達顯著降低(均P<0.01)。

1:對照組;2:柯里拉京(20 mg/kg)組;3:嗎啡組;4:嗎啡+低柯里拉京(10 mg/kg)組;5:嗎啡+高柯里拉京(20 mg/kg)組;免疫蛋白印跡法檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達;與對照組比較,**P<0.01;與嗎啡組比較,##P<0.01

3 討論

嗎啡是臨床上常用的鎮(zhèn)痛藥,提高其鎮(zhèn)痛效果對治療臨床急慢性疼痛性疾病有重大意義。本研究建立大鼠嗎啡耐受模型以探討柯里拉京在嗎啡耐受中的作用及可能機制。

膠質(zhì)細胞活化和促炎因子是嗎啡耐受的主要參與者[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),柯里拉京具有抗炎和抗氧化特性[13]。腹腔注射柯里拉京可產(chǎn)生顯著的抗痛覺特性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)柯里拉京可降低嗎啡耐受性,且高劑量組效果顯著。

小膠質(zhì)細胞活化參與嗎啡耐受是因為其衍生的溶酶體半胱氨酸蛋白酶Cathepsin S是放大痛覺信號的重要介質(zhì)[15]。研究表明,柯里拉京可抑制小膠質(zhì)細胞活性,降低Iba-1表達[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),嗎啡顯著提高大鼠脊髓中陽性細胞率和Iba-1蛋白表達,柯里拉京預(yù)處理后,陽性細胞率和Iba-1蛋白表達降低,表明柯里拉京抑制嗎啡耐受引起的小膠質(zhì)細胞活化。

在嗎啡耐受模型中,TNF-α和IL-1β表達明顯升高[18]。此前已報道,柯里拉京抑制炎性因子的表達[8]。本研究發(fā)現(xiàn),嗎啡組中IL-6、TNF-α和IL-1β表達顯著增加,柯里拉京預(yù)處理后,IL-6、TNF-α和IL-1β表達降低,表明柯里拉京對促炎因子具有抑制作用。

Wang等[19]發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受可激活MAPK信號。眾所周知,MAPK與病理性疼痛密切相關(guān)[20-21]。此外,MAPKs的激活被證實在阿片類藥物誘導(dǎo)中具有潛在作用[22-23]。在嗎啡耐受大鼠模型中,大鼠中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中ERK和JNK信號通路被激活[24]。抑制ERK和JNK信號通路后,嗎啡鎮(zhèn)痛耐受效果明顯降低[25]。米諾環(huán)素通過抑制p38拮抗嗎啡抗痛性耐受[23]?？吕锢┩ㄟ^抑制ERK/JNK MAPK阻斷NF-κB介導(dǎo)的炎癥途徑,以改善對肝臟的毒性[26]。本研究發(fā)現(xiàn),柯里拉京預(yù)處理降低了嗎啡組中p-ERK、p-JNK和p-p38高表達,表明柯里拉京通過抑制MAPK信號通路改善嗎啡耐受。

綜上,柯里拉京抑制嗎啡耐受誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化,炎性因子釋放和MAPK信號通路的激活,提示柯里拉京可能通過抑制MAPK信號通路延緩嗎啡耐受的進展,為其在嗎啡耐受的臨床應(yīng)用中提供新的理論依據(jù)。但是,本研究也存在一些不足,比如,柯里拉京在臨床上對嗎啡耐受進展的影響并未研究,這也將是我們之后研究的重點所在。