王 威, 夏 輝, 周 程, 劉楊從, 戴 斌△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,武漢市第一醫(yī)院 1肝膽外科 2藥學(xué)部,武漢 430022

肝癌是全球癌癥致死的第三大原因,每年導(dǎo)致約83萬人死亡[1]。手術(shù)切除對(duì)早期肝癌有效,化療是延長(zhǎng)中晚期肝癌患者生存期的重要手段,但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移頻繁,預(yù)后并不理想。紫杉醇是新型抗微管藥物,其通過抑制細(xì)胞有絲分裂在卵巢癌、乳腺癌中療效顯著,但其對(duì)肝癌有效性一般,這主要與肝癌對(duì)紫杉醇耐藥有關(guān)[2-3]。探討肝癌轉(zhuǎn)移和紫杉醇抗性的潛在機(jī)制對(duì)增加紫杉醇敏感性、抑制肝癌進(jìn)展具有重要價(jià)值。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)不具備編碼蛋白質(zhì)能力,其通過轉(zhuǎn)錄激活、吸附miRNA、結(jié)合蛋白、或編碼小肽等多種方式調(diào)控細(xì)胞功能[4]。lncRNA表達(dá)失調(diào)已被證實(shí)與肝癌細(xì)胞的持續(xù)增殖、凋亡抵抗、血管形成、化療耐藥、異常侵襲有關(guān)[5]。結(jié)直腸癌中LINC00115表達(dá)上調(diào),并通過促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、抑制凋亡促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展[6]。LINC00115通過靶向miR-200s促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新和致瘤性[7]。但LINC00115在肝癌中的生物學(xué)作用未見報(bào)道。miR-874-3p是一種肝癌抑制因子,miR-874-3p下調(diào)與腫瘤細(xì)胞分化較差、分期較晚和患者預(yù)后較差有關(guān)[8]。miR-874-3p能夠抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和紫杉醇耐藥[9]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示miR-874-3p是LINC00115的潛在靶點(diǎn),據(jù)此本研究探討LINC00115靶向miR-874-3p在肝癌中的作用。本研究通過檢測(cè)LINC00115、miR-874-3p在肝癌組織、細(xì)胞系中的表達(dá)情況,分析其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為和紫杉醇敏感性的影響,揭示LINC00115對(duì)miR-874-3p的靶向調(diào)控作用,旨在為肝癌治療提供潛在可用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織和細(xì)胞系

在2019年1月至2019年12月收集被診斷為肝癌且在武漢市第一醫(yī)院接受手術(shù)治療的43例肝癌患者(男29例,女14例,年齡48～71歲,平均年齡56歲)的肝癌組織和匹配癌旁組織(非癌組織)。排除術(shù)前接受抗腫瘤治療患者、既往癌癥史者以及未簽署書面知情同意書的患者。所有樣品在使用前均保存在液氮中。所有程序均符合《赫爾辛基宣言》指導(dǎo)原則。

肝癌細(xì)胞系MHCC-97H、Hep3B、SK-HEP-1以及人肝永生化細(xì)胞THLE-3購自美國(guó)ATCC公司。

1.2 主要試劑

RNeasy Plus Mini試劑盒購自北京天根生化公司;PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq購自大連TaKaRa公司;重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、si-RNA、miRNA模擬物、anti-miRNA、pcDNA購自蘇州迅捷生物公司;紫杉醇(純度99.9%)購自上海研生生化試劑有限公司;CCK-8溶液、放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)緩沖液購自上海碧云天生物公司;多藥耐藥蛋白1(MRP1)兔多抗(pro_39022)購自北京世聯(lián)博研生物公司;羊抗兔IgG二抗(ab205718)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)兔多抗(ab97779)、MMP9兔多抗(ab38898)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)兔多抗(ab16039)購自上海艾博抗公司。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)LINC00115和miR-874-3p表達(dá)

用RNeasy Plus Mini試劑盒分離總RNA,用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR。LINC00115和miR-874-3p表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計(jì)算。LINC00115引物上游5′-TGGCTTGTCTT-CCATCGTCC-3′,下游5′-GCACGAGGGTTGTT-ACAGGA-3′;β-actin引物上游5′-GGGAAATCG-TGCGTGACATTAAG-3′,下游5′-GTCAGGCA-GCTCGTAGCTCT-3′;U6引物上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′;miR-874-3p引物上游5′-GAAC-TCCACTGTAGCAGAGATGGT-3′,下游5′-CAT-TTTTTCCACTCCTCTTCTCTC-3′。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

MHCC-97H、Hep3B、SK-HEP-1以及THLE-3細(xì)胞接種在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液,放入37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。將MHCC-97H細(xì)胞接種到6孔板,細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔,用脂質(zhì)體3000將40 nmol/L的寡核苷酸或0.4 μg質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染50%匯合的細(xì)胞,分為對(duì)照(NC)組、si-NC組、si-LINC00115組、miR-NC組、miR-874-3p組、pcDNA組、pcDNA-LINC00115組、anti-miR-NC+si-LINC00115組、anti-miR-874-3p+si-LINC00115組,通過qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞中LINC00115或miR-874-3p表達(dá),隨后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力和對(duì)紫杉醇的IC50值

細(xì)胞活力測(cè)定:將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種到96孔板,并在37°C培養(yǎng)箱孵育48 h,更換為含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)液。通過酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

IC50值測(cè)定:將轉(zhuǎn)染細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種到96孔板,分別用不同濃度(1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)的紫杉醇處理細(xì)胞48 h,更換為含10% CCK-8溶液的培養(yǎng)液。通過酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度(A)值,繪制量效曲線,計(jì)算IC50值。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

用不含F(xiàn)BS培養(yǎng)液將轉(zhuǎn)染細(xì)胞懸浮并稀釋至1×105個(gè)/mL的密度,取200 μL加入帶有(用于侵襲)或不帶有(用于遷移)基質(zhì)膠的Transwell上室。將小室置于24孔板,加入600 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。37℃孵育24 h后,擦去上室內(nèi)細(xì)胞,分別用4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)隨機(jī)5個(gè)視野細(xì)胞總數(shù),取均值表示侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞,加入RIPA緩沖液提取總蛋白。制備分離膠和濃縮膠,將樣品以每道30 μg添加到凝膠孔中。在80 V(濃縮膠)、120 V(分離膠)進(jìn)行電泳直到溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠邊緣。將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,隨后用5%脫脂奶粉封閉2 h,然后與一抗4℃孵育12 h。用PBS洗膜后,將膜與二抗在室溫下孵育2 h。將增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影劑A和B以等體積混合并滴加到PVDF膜進(jìn)行曝光和成像。Image J軟件測(cè)定MRP1、MMP2和MMP9條帶及β-actin條帶的灰度值。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將包含野生型(WT)或突變型(MUT)miR-874-3p結(jié)合位點(diǎn)的LINC00115片段分別克隆到pGL4熒光素酶報(bào)告載體,構(gòu)建重組載體WT-LINC00115、MUT-LINC00115。將以上重組載體分別與miR-874-3p模擬物或miR-NC分別轉(zhuǎn)染到MHCC97H細(xì)胞中,在轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)定細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中LINC00115和miR-874-3p表達(dá)情況

肝癌組織中LINC00115表達(dá)水平顯著高于癌旁組織[(2.94±0.31)vs.(1.00±0.13),P<0.05],miR-874-3p表達(dá)水平顯著低于癌旁組織[(0.46±0.06)vs.(1.00±0.14),P<0.05]。

2.2 肝癌細(xì)胞系中miR-874-3p和LINC00115的表達(dá)情況

與人肝永生化細(xì)胞THLE-3比較,肝癌細(xì)胞系(MHCC97H、Hep3B、SK-HEP-1)中LINC00115表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05),miR-874-3p表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05),見表1。

表1 肝癌細(xì)胞系中miR-874-3p和LINC00115的表達(dá)情況Table 1 Expression of miR-874-3p and LINC00115 in liver cancer cell

2.3 下調(diào)LINC00115表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲以及紫杉醇敏感性的影響

與si-NC組比較,si-LINC00115組MHCC97H細(xì)胞LINC00115表達(dá)水平、A值、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、對(duì)紫杉醇IC50值以及MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平顯著降低(均P<0.05),見圖1和表2。

圖1 Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9、MRP1蛋白表達(dá)Fig.1 The protein expressions of MMP2,MMP9 and MRP1 detected by Western blotting

表2 下調(diào)LINC00115表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲以及紫杉醇敏感性的影響Table 2 Effects of downregulation of LINC00115 on proliferation,migration,invasion and paclitaxel sensitivity of liver cancer cell

2.4 上調(diào)miR-874-3p表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲以及紫杉醇敏感性的影響

與miR-NC組比較,miR-874-3p組MHCC97H細(xì)胞miR-874-3p表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),A值、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、對(duì)紫杉醇IC50值以及MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平顯著降低(均P<0.01),見圖2和表3。

圖2 Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9、MRP1蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression of MMP2,MMP9 and MRP1 detected by Western blotting

表3 上調(diào)miR-874-3p表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲以及紫杉醇敏感性的影響Table 3 Effects of upregulation of miR-874-3p on proliferation,migration,invasion and paclitaxel sensitivity of liver cancer cell

2.5 LINC00115靶向調(diào)控miR-874-3p表達(dá)

LncBase Predicted V.2預(yù)測(cè)到miR-874-3p與LINC00115序列存在互補(bǔ)位點(diǎn),見圖3。miR-874-3p模擬物和WT-LINC00115共轉(zhuǎn)染與miR-NC和WT-LINC00115共轉(zhuǎn)染比較細(xì)胞活力顯著降低[(0.47±0.04)vs.(1.00±0.11),P<0.05];miR-874-3p模擬物和MUT-LINC00115共轉(zhuǎn)染與miR-NC和MUT-LINC00115共轉(zhuǎn)染比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.02±0.11)vs.(1.00±0.10),P=0.692]。pcDNA-LINC00115組MHCC97H細(xì)胞LINC00115表達(dá)水平顯著高于pcDNA組[(2.48±0.21)vs.(1.00±0.08),P<0.05],miR-874-3p表達(dá)水平顯著低于pcDNA組[(0.48±0.04)vs.(1.00±0.10),P<0.05];si-LINC00115組MHCC97H細(xì)胞LINC-00115表達(dá)水平顯著低于si-NC組[(0.43±0.04)vs.(1.01±0.12),P<0.05],miR-874-3p表達(dá)水平顯著高于si-NC組[(1.96±0.17)vs.(0.99±0.10),P<0.05]。

圖3 LncBase Predicted V.2對(duì)LINC00115和miR-874-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖Fig.3 The combination of LINC00115 and miR-874-3p predicted by LncBase Predicted V.2

2.6 下調(diào)miR-874-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00115低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲以及紫杉醇敏感性的影響

與anti-miR-NC+si-LINC00115組比較,anti-miR-874-3p+si-LINC00115組MHCC97H細(xì)胞miR-874-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),A值、遷移數(shù)、侵襲數(shù)、對(duì)紫杉醇IC50值以及MRP1、MMP2和MMP9蛋白水平顯著升高(均P<0.01),見圖4和表4。

1:anti-miR-NC+si-LINC00115;2:anti-miR-874-3p+si-LINC00115

表4 下調(diào)miR-874-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00115低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖、遷移、侵襲以及紫杉醇敏感性的影響Table 4 Downregulation of miR-874-3p can reverse the effects of low LINC00115 expression on proliferation,migration,invasion and paclitaxel sensitivity of MHCC97H

3 討論

肝癌是一種侵襲性惡性腫瘤,由于其復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移和化療耐藥頻繁,現(xiàn)在的臨床治療效果總是不盡如人意。目前研究表明lncRNA表達(dá)異常與肝癌發(fā)生有關(guān),其可調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為和化療敏感性,是抑制肝癌進(jìn)展的理想靶點(diǎn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)LINC00115參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移,其高表達(dá)預(yù)示預(yù)后較差[10]。下調(diào)LINC00115通過抑制肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而阻礙癌細(xì)胞遷移和侵襲[11]。本研究檢測(cè)到LINC00115在肝癌組織、細(xì)胞系中表達(dá)增加,下調(diào)LINC00115表達(dá)顯著降低肝癌細(xì)胞活力,減少遷移和侵襲數(shù),同時(shí)伴隨著促轉(zhuǎn)移因子MMP2和MMP9水平降低,表明LINC00115在肝癌中扮演致癌基因角色,下調(diào)LINC00115可能是抑制肝癌細(xì)胞惡性行為的重要策略。腫瘤細(xì)胞通過耐藥對(duì)化療藥物失去反應(yīng)性,這是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,最終導(dǎo)致腫瘤治療失敗。MRP1是藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其廣泛表達(dá)參與多種癌細(xì)胞的化療耐藥性[12-13]。本研究中下調(diào)LINC00115表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的IC50值,降低MRP1蛋白水平,表明下調(diào)LINC00115表達(dá)可提高肝癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。

lncRNA可作為分子海綿與miRNA結(jié)合,導(dǎo)致miRNA靶基因重新激活從而發(fā)揮生物學(xué)功能[14]。據(jù)報(bào)道,LINC00115通過與miR-30a結(jié)合上調(diào)SOX9促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞的干性并抑制凋亡[15]。本研究檢測(cè)到miR-874-3p在肝癌組織、細(xì)胞系中表達(dá)下降,并證實(shí)miR-874-3p是LINC00115的直接靶點(diǎn)。研究表明miR-874-3p表達(dá)水平與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期之間有關(guān)聯(lián),miR-874-3p低表達(dá)是食管鱗癌預(yù)后不良的重要因素[16]。miR-874-3p通過下調(diào)靶基因調(diào)節(jié)劑G蛋白4(RGS4)水平抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[17]。另有研究表明miR-874-3p還可作為TP73-AS1、DANCR、MCF2 L-AS1等lncRNA的下游靶miRNA,介導(dǎo)敲低lncRNA表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、三陰性乳腺癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型的抑制作用[18-20]。本研究證實(shí)上調(diào)miR-874-3p表達(dá)可降低肝癌細(xì)胞活力,下調(diào)MMP2、MMP9、MRP1蛋白表達(dá),抑制細(xì)胞侵襲和遷移,并提高其對(duì)紫杉醇的敏感性。由于上調(diào)miR-874-3p表達(dá)和下調(diào)LINC00115表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的紫杉醇增敏以及抗增殖、抗遷移和抗侵襲效應(yīng)一致,LINC00115靶向負(fù)調(diào)控miR-874-3p表達(dá),這提示肝癌中可能存在LINC00115/miR-874-3p分子軸。下調(diào)miR-874-3p表達(dá)顯著減弱LINC00115低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞活力、遷移、侵襲和紫杉醇敏感性的影響,這表明下調(diào)LINC00115通過促進(jìn)miR-874-3p表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲行為,增加其對(duì)紫杉醇的敏感性。本研究主要局限性是并未對(duì)miR-874-3p下游靶基因進(jìn)行探索,這將是下一步研究的重點(diǎn)。

綜上,肝癌中LINC00115表達(dá)上調(diào),miR-874-3p表達(dá)下調(diào)。下調(diào)LINC00115通過促進(jìn)miR-874-3p表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,并提高其對(duì)紫杉醇的敏感性。因此,靶向抑制LINC00115/miR-874-3p分子軸可能是抑制肝癌進(jìn)展、逆轉(zhuǎn)肝癌紫杉醇耐藥的潛在有效策略。