劉文光, 劉思佟, 張薇薇, 莊桂銀, 謝思雨, 田 雪, 李曉珊, 谷 強(qiáng)△

新疆維吾爾自治區(qū)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1兒科 2產(chǎn)科,石河子 832000 3新疆維吾爾自治區(qū)石河子市人民醫(yī)院產(chǎn)科,石河子 832000

新生兒缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一種嚴(yán)重的兒童肺動(dòng)脈高壓,其發(fā)病率和死亡率都很高。HPH的主要病理改變?yōu)榉窝苷{(diào)節(jié)功能障礙,其中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial vascular smooth muscle cells,PASMCs)增殖引起的肺小血管非典型收縮和重構(gòu),導(dǎo)致右心室肥厚甚至衰竭[1]。目前HPH的治療策略包括一氧化氮吸入以及西地那非、米力農(nóng)和前列環(huán)素等肺血管擴(kuò)張藥物的使用,但以上治療存在一定的不良反應(yīng),且一旦疾病發(fā)展為肺血管重構(gòu)和右心室肥厚,治療的有效性就會(huì)降低,導(dǎo)致死亡率升高[2]。因此,制定有效的預(yù)防新生兒HPH疾病進(jìn)展的策略至關(guān)重要?；⒄溶?polydatin,PD)是從虎杖根中提取的天然二苯乙烯類化合物,具有抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)等多種藥理活性,對肺、肝、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用[3]。已有研究發(fā)現(xiàn),PD能夠改善野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓損傷,抑制肺內(nèi)皮功能障礙和肺血管重構(gòu)[4]。研究表明,Hippo通路與肺血管重構(gòu)關(guān)系密切,Yes相關(guān)蛋白1(YAP1)和PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共刺激因子信號(hào)通路(TAZ)是Hippo通路的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,Hippo-YAP1/TAZ軸能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡來控制器官大小[5]。此外,YAP1/TAZ在肺動(dòng)脈高壓(PH)模型及缺氧人PASMCs中表達(dá)異常上調(diào),表明YAP1/TAZ參與PH進(jìn)展[6]。但PD對HPH新生大鼠的保護(hù)作用及對肺血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究對此進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar新生大鼠70只,日齡7～10 d,購自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK新2003-0001,20～30 g,所有大鼠均飼養(yǎng)于12 h明暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中,自由進(jìn)食和飲水。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 PD購自深圳海思安生物技術(shù)有限公司;Hippo通路抑制劑XMU-MP-1購自美國MCE公司;蘇木精-伊紅(HE)染色液購自上海源葉生物科技有限公司;膠原酶購自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司;DMEM培養(yǎng)液購自武漢賽奧斯生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司;EdU試劑購自艾美捷科技有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、辣根過氧化物(HRP)結(jié)合的二抗購自南京諾唯贊生物科技公司;一抗YAP1、TAZ、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和β-actin(英國Abcam公司)。常壓低氧艙(貴州風(fēng)雷氧艙有限公司);CO2培養(yǎng)箱購自廣州科適特科學(xué)儀器有限公司;顯微鏡購自德國徠卡公司;流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組 將新生大鼠隨機(jī)分為6組:對照組、模型組、PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組、PD高劑量+Hippo通路抑制劑(XMU-MP-1)組,每組10只。除對照組飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下的室內(nèi)空氣中外,其余各組大鼠飼養(yǎng)于常壓低氧艙中,氧濃度(10.0±0.5)%,溫度25～27℃,濕度50%～70%,缺氧8 h/d持續(xù)2周,自由飲水和進(jìn)食[7]。從缺氧第1天開始,PD低、中、高劑量組新生大鼠參照文獻(xiàn)[8]中的方法分別在缺氧前10 min,隔日腹腔注射PD 5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg,連續(xù)4周;PD高劑量+XMU-MP-1組在缺氧前10 min,腹腔隔日注射PD 20 mg/kg和XMU-MP-1 1 mg/kg[9],連續(xù)4周;對照組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 右心室收縮壓(RVSP)和右心室肥厚指數(shù)(RVHI)檢測 缺氧4周后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,將微導(dǎo)管通過靜脈切開術(shù)引入右頸外靜脈,插入各組大鼠心臟右心室(right ventricular,RV),采用BE-EH4生物信號(hào)系統(tǒng)測量RVSP數(shù)據(jù)。

測量結(jié)束后,將大鼠安樂死,打開胸腔后分離右心室、左心室(left ventricle,LV)和室間隔(ventricular septum,VS),分別稱量其干重。計(jì)算RVHI即RV重量與LV和室間隔重量的比值=RV/(LV+VS)。解剖出左肺,置于液氮中保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 肺組織病理學(xué)觀察 取各組大鼠右肺組織,固定在10%甲醛溶液中,制備成4 μm厚的石蠟切片,進(jìn)行HE染色,觀察血管重構(gòu)和纖維化情況。采用Image Pro Plus圖像分析軟件計(jì)算肺動(dòng)脈管壁厚度(wall thickness)占總厚度的百分比(WT%)和管壁面積(wall area)占總面積的百分比(WA%)。

1.2.4 Western blot檢測肺組織蛋白表達(dá) 取各組大鼠左肺組織,在冰上用放射性免疫共沉淀裂解液裂解提取總蛋白,蛋白定量后,在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離每個(gè)樣品的等量蛋白,然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉膜,并與一抗YAP1(1∶1000)、MST1(1∶1000)、TAZ(1∶1000)和β-actin在4℃孵育過夜,后將膜與HRP結(jié)合的二抗孵育。用化學(xué)發(fā)光試劑對免疫反應(yīng)條帶進(jìn)行可視化。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 PASMCs細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取正常新生大鼠用45 mg/kg的戊巴比妥鈉腹膜內(nèi)麻醉,在顯微鏡下解剖肺內(nèi)動(dòng)脈,剝離外膜和內(nèi)皮后,組織切塊用0.2%膠原酶在37°C消化2 h,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。加入含20 %胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液,在培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)中培養(yǎng)。取第2～5代PASMCs用于實(shí)驗(yàn)。用特異性α-SMA抗體對提取的PASMCs細(xì)胞進(jìn)行鑒定并確定其純度。

1.3.2 細(xì)胞分組 將處于對數(shù)生長期的PASMCs分為NC組、低氧(Hypoxia)組、PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組、PD高劑量+XMU-MP-1組。其中NC組細(xì)胞在常氧(37℃,21% O2,5% CO2)條件下的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng);Hypoxia組細(xì)胞在缺氧(37℃,3% O2,5% CO2)條件下的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng);PD低、中、高劑量組分別用0.5、1、2 mmol/L的PD處理后,在缺氧(37℃,3% O2,5% CO2)條件下的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng);PD高劑量+XMU-MP-1組用2 mmol/L的PD和1 μmol/L的XMU-MP-1[10]處理后,在缺氧(37℃,3% O2,5% CO2)條件下的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞增殖測定 CCK-8檢測:將各組PASMCs培養(yǎng)48 h后,以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中,將10 μL CCK-8溶液加入到每個(gè)孔中,并將96孔板在37°C下再孵育1 h,在450 nm處測量吸光度(A)值。

EdU檢測:按照EdU試劑盒說明書,各組細(xì)胞加入100 μL/孔稀釋的EdU溶液,在CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,多聚甲醛固定、透化、洗滌后,加入100 μL的Hoechst 33342染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色,使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.4 細(xì)胞凋亡測定 將各組PASMCs接種于96孔板中,加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI避光孵育15 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.3.5 Western blot檢測PASMCs蛋白表達(dá) 將各組PASMCs裂解后提取總蛋白,其余步驟與1.2.4相同,按照步驟檢測PASMCs中YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PD對各組大鼠RVSP和RVHI的影響

與對照組相比,模型組大鼠RVSP、RVHI顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,PD低、中、高劑量組大鼠RVSP、RVHI顯著降低,且PD各組間差異有劑量依賴性(均P<0.05);與PD高劑量組相比,PD高劑量+XMU-MP-1組大鼠RVSP、RVHI顯著升高(均P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠RVSP和RVHI比較Table 1 Comparison of RVSP and RVHI of rats in

2.2 PD對各組大鼠肺組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示,對照組大鼠肺動(dòng)脈管壁完整光滑,細(xì)胞分布整齊致密,管壁薄而均勻,肌層無增厚;模型組大鼠肺動(dòng)脈管壁明顯增厚,管腔變窄,細(xì)胞排列方式紊亂;PD低、中、高劑量組肺動(dòng)脈增厚減少,管腔變大,細(xì)胞排列整齊,且隨PD劑量增加作用效果更明顯;PD高劑量+XMU-MP-1組肺動(dòng)脈管壁增厚,管腔變窄,見圖1。與對照組相比,模型組大鼠WT%、WA%顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,PD低、中、高劑量組大鼠WT%、WA%顯著降低,且PD各組間有劑量依賴性(均P<0.05);與PD高劑量組相比,PD高劑量+XMU-MP-1組大鼠WT%、WA%顯著升高(均P<0.05),見表2。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色圖(×400)Fig.1 HE staining of lung tissue of rats in each group(×400)

表2 各組大鼠WT%、WA%比較Table 2 Comparison of WT and WA of rats in

2.3 PD對各組大鼠肺組織YAP1/TAZ通路蛋白變化的影響

與對照組相比,模型組大鼠YAP1、MST1、TAZ蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05);與模型組相比,PD低、中、高劑量組大鼠YAP1、MST1、TAZ蛋白表達(dá)顯著降低,且PD各組間有劑量依賴性(均P<0.05);與PD高劑量組相比,PD高劑量+XMU-MP-1組大鼠YAP1、MST1、TAZ蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05),見圖2、表3。

A:對照組;B:模型組;C:PD低劑量組;D:PD中劑量組;E:PD高劑量組;F:PD高劑量+XMU-MP-1組

表3 各組大鼠YAP1/TAZ通路蛋白表達(dá)比較Table 3 Comparison of YAP1/TAZ pathway protein expression of rats in each

2.4 PD對各組大鼠PASMCs細(xì)胞增殖的影響

與NC組相比,Hypoxia組細(xì)胞A450nm值、EdU陽性率顯著升高(均P<0.05);與Hypoxia組相比,PD低、中、高劑量組細(xì)胞A450nm值、EdU陽性率顯著降低,且PD各組間有劑量依賴性(均P<0.05);與PD高劑量組相比,PD高劑量+XMU-MP-1組組細(xì)胞A450nm值、EdU陽性率顯著升高(均P<0.05),見圖3、表4。

圖3 各組PASMCs細(xì)胞增殖情況(×400)Fig.3 Proliferation of PASMCs in each group(×400)

表4 各組細(xì)胞A450nm值、EdU陽性率比較Table 4 The A450nm value and EdU positive rate of each

2.5 PD對各組大鼠PASMCs細(xì)胞凋亡的影響

與NC組[(8.16±0.93)%]相比,Hypoxia組細(xì)胞凋亡率[(4.54±0.85)%]顯著降低(P<0.05);與Hypoxia組相比,PD低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著升高,分別為(5.38±0.66)%、(6.44±0.78)%、(7.85±0.86)%;且PD各組間有劑量依賴性(均P<0.05);與PD高劑量組相比,PD高劑量+XMU-MP-1組細(xì)胞凋亡率[(4.73±0.86)%]顯著降低(P<0.05),見圖4。

圖4 各組PASMCs細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of PASMCs cells in each group

2.6 PD對各組PASMCs細(xì)胞YAP1/TAZ通路和凋亡蛋白的影響

與NC組相比,Hypoxia組細(xì)胞YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高,Bax表達(dá)顯著降低(均P<0.05);與Hypoxia組相比,PD低、中、高劑量組細(xì)胞YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低,Bax表達(dá)顯著升高,且PD各組間有劑量依賴性(均P<0.05);與PD高劑量組相比,PD高劑量+XMU-MP-1組細(xì)胞YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高,Bax表達(dá)顯著降低(均P<0.05),見圖5、表5。

A:NC組;B:Hypoxia組;C:PD低劑量組;D:PD中劑量組;E:PD高劑量組;F:PD高劑量+XMU-MP-1組

表5 各組細(xì)胞YAP1/TAZ通路及凋亡蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of YAP1/TAZ pathway and apoptotic protein expression of cells in each

3 討論

HPH是一種以肺血管收縮和血管重構(gòu)為特征、惡性程度極高的心血管疾病,與成人肺血管相比,新生兒肺血管更容易受到缺氧損傷,具有較高的病死率。此外,新生兒HPH具有長期并發(fā)癥,包括神經(jīng)發(fā)育、認(rèn)知和聽力異常[11]。因此,闡明新生兒HPH發(fā)病的潛在機(jī)制具有必要性和緊迫性。本研究通過建立新生大鼠HPH模型,發(fā)現(xiàn)大鼠肺動(dòng)脈管壁明顯增厚,管腔變窄,RVSP、RVHI、WT%、WA%顯著升高,表明新生大鼠HPH模型構(gòu)建成功,大鼠出現(xiàn)肺血管重構(gòu)和心力衰竭。PD具有顯著的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)特性,還能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡,減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),且毒副作用小,安全性高[12]。研究發(fā)現(xiàn),PD已廣泛用于多種心血管疾病的治療,PD通過促進(jìn)SIRT6介導(dǎo)的自噬來減輕膿毒性心肌病[13];PD還能通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)發(fā)揮對糖尿病心肌損傷大鼠的心臟保護(hù)作用[14]。本研究中PD干預(yù)后,HPH新生大鼠肺動(dòng)脈增厚減少,管腔變大,RVSP、RVHI、WT%、WA%顯著降低,且PD各組間有劑量依賴性,表明PD對HPH新生大鼠心力衰竭和肺血管重構(gòu)有改善作用。

HPH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與肺動(dòng)脈細(xì)胞增殖、血管重構(gòu)、抗凋亡增加和原位血栓形成有關(guān),其中PASMCs過度增殖和凋亡抵抗是低氧性PASMCs在低氧性肺動(dòng)脈重構(gòu)和HPH中的標(biāo)志性特征。研究發(fā)現(xiàn),通過抑制PASMCs增殖可以保護(hù)小鼠免受缺氧引起的PH[15]。本研究中,缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)的PASMCs的A450nm值、EdU陽性率、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高,凋亡率、Bax表達(dá)顯著降低,表明缺氧促進(jìn)PASMCs增殖,抑制凋亡,進(jìn)而引發(fā)肺動(dòng)脈血管重構(gòu)。PD已被發(fā)現(xiàn)能夠通過增強(qiáng)缺氧人PASMCs中SIRT1的表達(dá)來改善線粒體生物發(fā)生和功能[16]。本研究中PD干預(yù)后,缺氧誘導(dǎo)的PASMCs的A450nm值、EdU陽性率、Bcl-2蛋白表達(dá)降低,凋亡率、Bax表達(dá)升高,且PD各組間有劑量依賴性,表明PD能夠抑制HPH新生大鼠PASMCs增殖,促進(jìn)凋亡,改善肺動(dòng)脈血管重構(gòu)。

Hippo信號(hào)通路是一個(gè)進(jìn)化上保守的通路,YAP1和TAZ是Hippo通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和干細(xì)胞自我更新來控制器官大小[17]。Hippo通路包括MST1/2、LATS1/2以及下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP,MST1磷酸化后促進(jìn)YAP的磷酸化,導(dǎo)致YAP滯留在細(xì)胞質(zhì)中,被蛋白酶體降解。而去磷酸化的YAP位于細(xì)胞核中,與TAZ相互作用,促進(jìn)靶基因表達(dá)[18]。Hippo通路的失調(diào),通過激活YAP和TAZ,導(dǎo)致成體器官不受控制的增殖和抑制凋亡[19]。因此,Hippo/YAP信號(hào)通路是HPH的潛在治療靶點(diǎn)。Zuo等[20]發(fā)現(xiàn),通過下調(diào)LATS1和YAP的表達(dá),抑制PASMCs的增殖和遷移,進(jìn)而改善PH。Acharya等[21]發(fā)現(xiàn),通過抑制YAP1/TAZ的激活,可以改善肺血管增生和PH。此外,Wang等[22]也發(fā)現(xiàn),YAP上調(diào)促進(jìn)Notch3的表達(dá)和激活,最終促進(jìn)PASMCs過度增殖。因此,抑制YAP1/TAZ的激活可能具有抑制HPH大鼠PASMCs增殖的作用。PD已被發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制YAP表達(dá)和核易位來減輕糖尿病腎病中的腎小管間質(zhì)纖維化[23]。本研究中PD處理后,缺氧誘導(dǎo)的肺組織和PASMCs細(xì)胞YAP1、MST1、TAZ蛋白表達(dá)顯著降低,表明PD可能通過抑制YAP1/TAZ通路,抑制PASMCs增殖,改善新生大鼠HPH。而使用Hippo通路抑制劑XMU-MP-1可顯著上調(diào)YAP1、MST1、TAZ蛋白表達(dá),逆轉(zhuǎn)PD對HPH新生大鼠肺血管重塑和PASMCs增殖的改善作用。進(jìn)一步表明PD對HPH新生大鼠PASMCs增殖的抑制作用和對凋亡的促進(jìn)作用是通過抑制YAP1/TAZ通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,PD可能通過抑制YAP1/TAZ信號(hào)通路抑制HPH新生大鼠PASMCs增殖,促進(jìn)凋亡。本研究為新生兒HPH的治療提供了新思路。