李潔梅, 伍 莉, 李娟華, 覃 寧, 馮寶瑩, 彭 陽, 李 涵△

廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 1衛(wèi)生化學(xué)教研室 3環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室,南寧 530021 2廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院,廣西兒科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,南寧 530028

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一種嚴(yán)重威脅母嬰健康的妊娠期疾病[1]。2018年的一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示我國GDM患病率為14.8%[2],而2020年的一項(xiàng)研究顯示在全面二孩政策實(shí)施后GDM患病率上升至21%[3]。GDM發(fā)病率居高不下,目前已有研究表明微量元素穩(wěn)態(tài)失衡可能是引起GDM的重要危險(xiǎn)因素[4]。動物研究發(fā)現(xiàn),微量元素如硒(Se)、鋅(Zn)、鉻(Cr)可調(diào)節(jié)機(jī)體的胰島素敏感性,在維持血糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[4]。也有許多流行病學(xué)研究報(bào)道了微量元素如鋅、銅(Cu)、錳(Mn)與GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[5-7],但研究結(jié)果尚不一致。另外,目前對于孕婦體內(nèi)其他微量元素水平如釩(V)、鉬(Mo)和鈷(Co)與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間研究有限。

關(guān)于GDM的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,有研究表明GDM的發(fā)生可能是體內(nèi)多條代謝通路復(fù)雜相互作用的結(jié)果,代謝物可直接或間接地參與調(diào)控胰島素敏感性[8]。有研究發(fā)現(xiàn)血清膽汁酸代謝異常先于2型糖尿病的發(fā)生[9],且膽汁酸代謝和信號通路的改變與肥胖和2型糖尿病相關(guān)[9-10]。也有流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),妊娠期血清總膽汁酸(TBA)、脫氧膽酸(DCA)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA)濃度升高與GDM風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[11-13]。此外,毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)某些微量元素,如鉻暴露可干擾膽固醇代謝,包括初級膽汁酸和與微生物相關(guān)的次級膽汁酸代謝[14]。然而,微量元素是否通過影響母體膽汁酸代謝進(jìn)而導(dǎo)致GDM,目前尚不清楚。

因此,本研究基于前瞻性出生隊(duì)列,采用巢式病例-對照研究設(shè)計(jì)分析孕早期血清微量元素水平與GDM的關(guān)聯(lián)及其對母體膽汁酸代謝的影響,并探討膽汁酸在微量元素與GDM之間的中介作用,從而為GDM的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究基于廣西壯族人群出生隊(duì)列研究,選取2015年6月至2019年7月期間在廣西南寧市武鳴區(qū)人民醫(yī)院招募的孕婦,納入標(biāo)準(zhǔn)為:(1)初檢孕周≤12周;(2)預(yù)計(jì)在定點(diǎn)醫(yī)院分娩;(3)同意提供血液樣本。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)未追蹤到妊娠結(jié)局;(2)分娩死胎、出生缺陷兒或多胎妊娠。根據(jù)孕婦在懷孕第24～28周接受的口服葡萄糖耐量測試(OGTT)結(jié)果,參照美國糖尿病協(xié)會2023年最新發(fā)布的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行GDM診斷[1],即當(dāng)滿足或超過以下任何一種血糖值時(shí),可診斷為GDM:空腹血糖≥5.1 mmol/L;服糖后1 h血糖值≥10.0 mmol/L;服糖后2 h血糖值≥8.5 mmol/L。本研究采用巢式病例-對照研究設(shè)計(jì),共納入124例GDM病例,按年齡和孕周(±1)進(jìn)行1∶1個(gè)體匹配,最終共納入248名孕婦。所有研究對象均簽署了知情同意書,本研究已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:20140305-001)。

1.2 方法

1.2.1 孕婦基本信息采集 在孕婦進(jìn)行首次產(chǎn)檢時(shí),由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員對其進(jìn)行面對面的問卷調(diào)查。問卷的具體內(nèi)容包括:孕婦基本情況(年齡、職業(yè)、民族、身高體重等情況);生活方式(妊娠期間飲酒和吸煙、被動吸煙等);通過查詢病歷系統(tǒng)收集孕婦的疾病史、血糖值、孕周等信息。孕婦在孕周≤12周進(jìn)行產(chǎn)前檢查時(shí),采集孕婦空腹靜脈血5 mL,離心提取血清,置于凍存管中,放置于-80℃冰箱冷凍保存。

相關(guān)定義:孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為孕前體重(kg)/身高的平方(m2)。工作情況:指孕婦是否處于就業(yè)狀態(tài)。飲酒:指孕婦在妊娠期間是否有飲酒行為。吸煙:指孕婦在妊娠期間是否有吸煙行為。被動吸煙:指孕婦在過去3個(gè)月身邊是否有人吸煙,次數(shù)在每周1次及以上。鍛煉習(xí)慣:指孕婦平時(shí)是否有每周至少1次,每次至少30 min的規(guī)律運(yùn)動。

1.2.2 血清微量元素濃度檢測 本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS,PerkinElmer NexION 350X)分析血清中的微量元素濃度。首先,在4℃下解凍血清樣本,加入HNO3,再吸取100 μL樣本至15 mL離心管中稀釋,超聲30 min后靜置,置于室溫平衡溫度,等待上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)過程中,每20個(gè)樣品穿插血清質(zhì)控和血清平行樣,微量元素V、Cr、Mn、Co、Cu、Zn、Se和Mo的標(biāo)準(zhǔn)曲線均有較好的線性關(guān)系,決定系數(shù)(R2)均在0.999以上,加標(biāo)回收率在80%～120%之間,變異度小于3%。

1.2.3 血清膽汁酸分析 本研究使用超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS,Thermo Fisher Scientific,USA)測定孕婦血清中膽汁酸水平。首先取100 μL血清樣品于EP管中,加入400 μL提取液,渦旋混勻;然后超聲15 min,-40℃靜置1 h后離心15 min;最后取上清液至LC進(jìn)樣瓶中,上機(jī)檢測。色譜條件,液相色譜A相為乙酸銨水溶液,B相為乙腈。質(zhì)譜條件,采用平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。所測的31種膽汁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線均有較好的線性關(guān)系,回歸系數(shù)均在0.9958以上,平均回收率在82.4%～105.8%之間,標(biāo)準(zhǔn)相對偏差(RSD)均小于8.3%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用中介效應(yīng)分析孕早期血清膽汁酸是否在血清微量元素濃度與GDM的關(guān)聯(lián)中發(fā)揮潛在作用。中介分析是使用R包“mediation”執(zhí)行的,設(shè)置Bootstrap樣本量為5000,當(dāng)Bootstrap 95%CI不包含0且P<0.05時(shí),則中介效應(yīng)顯著。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 26.0版本和R 4.2.2版本進(jìn)行,以P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本特征

本研究248名孕婦的平均年齡(31.9±4.6)歲,壯族占總?cè)巳旱?4.7%。與對照組相比,病例組的孕婦有較高的孕前BMI,有較低的就業(yè)率和飲酒率(均P<0.05);不同組在產(chǎn)次、被動吸煙、鍛煉習(xí)慣、糖尿病家族史和高血壓家族史方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),詳見表1。

表1 研究對象基本特征或n(%)]Table 1 Baseline characteristics of study subjects 或n(%)]

2.2 孕早期血清微量元素濃度和膽汁酸水平

所檢測的248例孕婦血清中Cr的檢出率為69.0%,其余元素的檢出率均為100%。經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)GDM病例組中血清V濃度較對照組高,而Cr、Mn、Zn、Se、Mo濃度低于對照組(均P<0.05),詳見圖1A。另外,相比于對照組,病例組的?；悄懰?TCA)、甘氨熊去氧膽酸-3-硫酸(GUDCA-3S)、甘氨脫氧膽酸-3-硫酸(GDCA-3S)、?；敲撗跄懰?3-硫酸(TDCA-3S)、甘氨鵝脫氧膽酸-3-O-β-葡糖醛酸(GCDCA-3Gln)、甘氨去氧膽酸-3-O-β-葡糖苷酸(GDCA-3Gln)水平較高(均P<0.05),其余膽汁酸在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見圖1B。

A:自然對數(shù)(Ln)轉(zhuǎn)換后血清微量元素濃度;B:自然對數(shù)(Ln)轉(zhuǎn)換后血清膽汁酸濃度;與對照組比較,*P<0.05 **P<0.01

2.3 孕早期血清微量元素濃度與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

校正了孕婦年齡、孕前BMI、產(chǎn)次、飲酒、工作情況、孕期被動吸煙和糖尿病家族史因素后,可觀察到血清V濃度與GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān),而血清Cr、Mn、Zn、Se、Mo濃度與GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05),詳見表2。BKMR模型結(jié)果顯示,GDM風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)先降后升趨勢,與所有微量元素濃度都處于中位數(shù)時(shí)相比,當(dāng)所有微量元素濃度處于第70和75百分位數(shù)時(shí),GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,詳見圖2。

校正了孕婦年齡、孕前BMI、飲酒、被動吸煙、產(chǎn)次、工作情況和糖尿病家族史因素

表2 孕早期血清微量元素濃度與GDM的關(guān)系Table 2 Association between serum trace element concentrations in the first trimester and GDM

血清V和Mo的后驗(yàn)包含概率(PIPs)各為1.00和0.99,表明此兩種微量元素在多種微量元素混合暴露的整體效應(yīng)中占據(jù)主導(dǎo)位置,與GDM關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。

2.4 GDM與血清膽汁酸代謝物的關(guān)系

在OPLS-DA模型中,VIP>1的膽汁酸代謝物具有成為生物標(biāo)志物的潛力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有12種膽汁酸代謝物VIP>1,詳見表3。進(jìn)一步使用條件Logistic回歸分析孕早期血清12種膽汁酸生物標(biāo)志物水平及5種不同類型膽汁酸總和[即總膽汁酸(TBA)、總初級膽汁酸(TPBA)、總次級膽汁酸(TSBA)、總游離型膽汁酸(UnconBA)和總結(jié)合型膽汁酸(ConBA)]與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)。校正孕婦年齡、孕前BMI、產(chǎn)次、飲酒、工作情況、被動吸煙和糖尿病家族史因素后,TCA、甘氨鵝去氧膽酸硫酸(GCDCA-3S)、GCDCA-3Gln、GUDCA-3S、TDCA-3S與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)(均P<0.05),鵝脫氧膽酸(CDCA)與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。詳見圖3。

OR:比值比;CI:置信區(qū)間。模型校正了孕婦年齡、孕前BMI、飲酒、被動吸煙、產(chǎn)次、工作情況和糖尿病家族史;*P<0.05

表3 OPLS-DA模型差異膽汁酸代謝物篩選結(jié)果Table 3 Results of differential bile acid metabolite screening by OPLS-DA model

2.5 孕早期血清微量元素濃度與膽汁酸水平的關(guān)系

采用多重線性回歸進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清V與?；切苊撗跄懰?TUDCA)、GCDCA-3S和GCDCA-3Gln水平呈正相關(guān),與TCA和石膽酸(LCA)水平呈負(fù)相關(guān);血清Cr與TUDCA、TCA、GCDCA-3S、TBA和ConBA水平呈負(fù)相關(guān);血清Mn與TDCA-3S和TCA水平呈正相關(guān);血清Co與LCA水平呈正相關(guān),與TUDCA水平呈顯著負(fù)相關(guān);血清Cu與TDCA-3S和TCA水平呈正相關(guān),與CDCA、GUDCA和Uncon BA水平呈顯著負(fù)相關(guān);血清Zn與熊去氧膽酸硫酸(UDCA-3S)呈正相關(guān),與GCDCA-3S和GCDCA-3Gln呈負(fù)相關(guān);血清Se與牛磺石膽酸(TLCA)和LCA水平呈正相關(guān),與TUDCA、GCDCA-3S和TCA水平呈負(fù)相關(guān);血清Mo與GUDCA呈正相關(guān)(均P<0.05)。詳見圖4。

校正因素包括孕婦年齡、孕前BMI、飲酒、被動吸煙、產(chǎn)次、工作情況和糖尿病家族史;*P<0.05

2.6 孕早期血清膽汁酸在微量元素濃度與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中的中介作用

孕期血清微量元素濃度和膽汁酸代謝與GDM顯著相關(guān),微量元素可能通過影響膽汁酸代謝從而導(dǎo)致GDM的發(fā)生。通過中介分析發(fā)現(xiàn)GCDCA-3Gln、TCA分別在血清Zn和Se與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)中具有顯著的中介效應(yīng)(均P<0.05),其中介比例分別為16.4%和15.5%;另外,未發(fā)現(xiàn)血清膽汁酸代謝物在血清V、Cr、Mn與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)中存在中介作用。詳見圖5。

校正因素包括孕婦年齡、孕前BMI、飲酒、被動吸煙、產(chǎn)次、工作情況和糖尿病家族史;在中介效應(yīng)圖中,中間為中介效應(yīng)比例,底部為總效應(yīng)(95%CI);*P<0.05

3 討論

本研究探討了孕早期微量元素與GDM之間的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)孕早期血清中Cr、Mn、Zn、Se、Mo水平與孕期GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈顯著負(fù)相關(guān),血清V水平與GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈顯著正相關(guān)。目前已有多項(xiàng)流行病學(xué)研究報(bào)道了孕期微量元素濃度與GDM的相關(guān)性,但結(jié)果不一致。目前Cr與GDM的關(guān)系研究有限,但Cr與糖尿病之間的關(guān)聯(lián)研究較多,且得到較為一致的結(jié)果,即Cr與糖尿病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[15-16]。Mn是人體必需微量元素之一,關(guān)于孕期血Mn水平與GDM的研究有限,且大多數(shù)研究未發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著性關(guān)聯(lián)[17-18]。但一項(xiàng)同濟(jì)母嬰健康隊(duì)列發(fā)現(xiàn)孕早期Mn水平升高與GDM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[6]。在普通人群中,韓國的一項(xiàng)橫斷面研究顯示血Mn水平與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的增加呈負(fù)相關(guān)[19]。中國武漢的一項(xiàng)巢式病例對照研究發(fā)現(xiàn)血漿中Zn、Se水平與GDM風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[5]。美國一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)較低的血漿Mo濃度可能會增加妊娠期糖代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)[20],并且Mo與血糖水平之間呈負(fù)相關(guān)[21]。對于V與GDM的關(guān)聯(lián)研究尚不明確,中國的一項(xiàng)病例對照研究表明血漿V水平與2型糖尿病之間呈正相關(guān)[22];但另一項(xiàng)病例對照研究發(fā)現(xiàn)血漿V與GDM呈負(fù)相關(guān)[23],這種差異可能是由檢測的生物基質(zhì)、研究設(shè)計(jì)、人群特征以及地域等不同導(dǎo)致。

本研究發(fā)現(xiàn)孕早期血清中多種膽汁酸代謝物與GDM之間存在關(guān)聯(lián)。迄今為止,膽汁酸和GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及機(jī)制的研究證據(jù)還比較有限。有研究報(bào)道了膽汁酸和2型糖尿病之間的關(guān)聯(lián)。例如,來自芬蘭的一項(xiàng)糖尿病預(yù)防研究中發(fā)現(xiàn)GCA、TCDCA和GCDCA與2型糖尿病的發(fā)展呈正相關(guān)[24];另一項(xiàng)來自中國成人血清膽汁酸代謝與糖尿病關(guān)聯(lián)的研究發(fā)現(xiàn),TCA、GCDCA、GCDCS與糖尿病發(fā)病呈正相關(guān)[9]。在孕婦人群中,一項(xiàng)橫斷面研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比,GDM組中血清GUDCA、TUDCA顯著升高,并且可能是GDM的潛在生物標(biāo)志物[25]。另外上海一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)孕期8種血漿膽汁酸水平與GDM風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),且大多數(shù)是初級結(jié)合型膽汁酸和次級非結(jié)合型膽汁酸,主要包括CA、TCA、GCA、GCDCA、DCA、LCA、UDCA和TLCA可能與GDM相關(guān)[26]。在本研究也發(fā)現(xiàn)TCA與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與先前研究一致。另外本研究還發(fā)現(xiàn)了CDCA、TDCA-3S、GCDCA-3S、GCDCA-3Gln和GUDCA-3S結(jié)合型膽汁酸與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān),結(jié)合型膽汁酸可能在糖尿病發(fā)展的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9]。

近年來,有毒理學(xué)研究顯示金屬暴露會引起動物膽汁酸代謝異常,導(dǎo)致體內(nèi)膽汁酸水平改變。例如,一項(xiàng)研究對中華蟾蜍幼蟲進(jìn)行Pb和(或)Cu染毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)總膽汁酸水平、結(jié)合膽汁酸與非結(jié)合膽汁酸的比率以及各接觸組TCA和TCDCA水平發(fā)生改變[27]。另外,也有研究發(fā)現(xiàn)短期重復(fù)接觸Mn會導(dǎo)致雄性大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清膽汁酸水平升高[28]。本研究采用中介分析探討膽汁酸代謝改變在微量元素與GDM中可能的介導(dǎo)作用,發(fā)現(xiàn)孕期血清GCDCA-3Gln和TCA分別介導(dǎo)了血清Zn、Se濃度與GDM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,但對于Zn、Se如何通過影響GCDCA-3Gln和TCA從而導(dǎo)致GDM發(fā)生的潛在機(jī)制尚未清楚。可能原因是膽汁酸是作為葡萄糖和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可通過激活核法尼醇受體(FXR)和G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)來實(shí)現(xiàn)[29]。另外,有研究發(fā)現(xiàn)TCA可通過激活TGR5受體刺激胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和多肽YY(PYY)從而調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[30];而Zn、Se作為重要的微量元素,可通過增加GLP-1R水平對血糖產(chǎn)生調(diào)控作用[31-32]。因此微量元素Zn、Se可能通過影響受體的信號傳導(dǎo)進(jìn)而導(dǎo)致膽汁酸代謝輪廓改變,進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖代謝失調(diào)而引起GDM的發(fā)生,但其潛在機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

本研究優(yōu)勢之一是發(fā)現(xiàn)孕早期血清膽汁酸代謝物GCDCA-3Gln、TCA在微量元素Zn、Se與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的中介作用,并發(fā)現(xiàn)與GDM發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的潛在膽汁酸標(biāo)志物,目前尚未見同類研究。其次,本研究基于前瞻性隊(duì)列研究設(shè)計(jì),篩選出的膽汁酸代謝物具有作為GDM早期診斷生物標(biāo)志物潛力。另外,本研究采用了巢式病例-對照研究設(shè)計(jì),避免了選擇性偏倚的影響。本研究同時(shí)也存在一定局限性:首先本研究中僅采集孕早期血清樣本,缺乏多時(shí)點(diǎn)重復(fù)測量數(shù)據(jù)。其次本研究樣本量較小,且為病例對照研究設(shè)計(jì),對微量元素水平與GDM之間因果關(guān)系的確定存在一定的局限性。最后,盡管我們控制了一些關(guān)鍵的混雜因素,但其他因素如孕婦教育程度及孕期飲食習(xí)慣等,并未被測量。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)孕婦孕早期血清V、Cr、Mn、Zn、Se和Mo多種微量元素濃度與GDM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān),孕婦孕早期血清結(jié)合型膽汁酸代謝物GCDCA-3Gln、TCA可能在微量元素與GDM之間起重要的介導(dǎo)作用。研究結(jié)果為闡明微量元素與GDM的關(guān)系提供了新的流行病學(xué)證據(jù),為探索GDM的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路,同時(shí)篩選出的孕早期膽汁酸代謝物具有作為篩選GDM高風(fēng)險(xiǎn)人群生物標(biāo)志物的潛力。