何 婷, 陳 軍, 龐 牧, 楊 昊, 張俊志

1深圳市中醫(yī)院,廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部,深圳 518033 2深圳市人民醫(yī)院(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)麻醉科,深圳 518020

心肌纖維化是指在各種致病因素,如長期心臟超負(fù)荷、炎癥、缺血缺氧等作用下,心肌組織中成纖維細(xì)胞過度活化增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積,造成心臟結(jié)構(gòu)重塑,順應(yīng)性下降,從而引起心臟收縮舒張功能減退、心律失常等,最終導(dǎo)致不可逆性心力衰竭,甚至猝死[1-3]。心肌纖維化是高血壓心臟病、缺血性心肌病等心血管疾病的主要病理特征和主要死亡原因之一,嚴(yán)重威脅著人類生命健康[3-4]。因此,尋求有效的抑制或逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化藥物具有重要意義。

近年來大量研究表明,多種信號通路參與并調(diào)控壓力超負(fù)荷心肌纖維化的發(fā)生及發(fā)展,其中TGF-β超家族是目前研究最廣泛的致纖維化生長因子,在各種刺激因子作用下,多種細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)可合成、分泌TGF-β1[5-6]。TGF-β1作為促纖維化細(xì)胞因子在心肌重塑過程中起著重要調(diào)節(jié)作用,其可通過與受體結(jié)合,激活Smads蛋白,并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到核內(nèi),促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[6-7]。TGF-β1/Smads信號通路被認(rèn)為可能是纖維化潛在的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin 1,SIRT1)是廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的NAD+依賴的去乙?；?大量研究已證實(shí),SIRT1在心臟中高表達(dá),其具有廣泛的心血管和神經(jīng)保護(hù)作用[8-9],近年來備受關(guān)注。有研究報道姜黃素通過激活SIRT1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌纖維化[10],外源性硫化氫可通過上調(diào)SIRT1延緩心肌早衰抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化[11],SIRT1被白藜蘆醇激活后還可通過TGF-β1信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化[12]。但SIRT1對壓力超負(fù)荷引起心肌纖維化的保護(hù)作用研究甚少,且SIRT1是否通過作用于TGF-β1/Smads通路而發(fā)揮抗壓力超負(fù)荷型心肌纖維化作用,目前尚未明確。

本研究利用腹主動脈部分縮窄增加壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心肌纖維化,觀察SIRT1激活劑SRT1720對其的影響,同時體外培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細(xì)胞觀察SRT1720對AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及膠原合成的影響,并從TGF-β1/Smads作用靶點(diǎn)探討其可能的作用機(jī)制,有望為壓力超負(fù)荷心肌纖維化的治療提供一種新的思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和材料

健康雄性SPF級SD(Sprague-Dawley)大鼠,體重(200±20)g,由廣東省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供,本研究相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)得到深圳市中醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn),所有動物操作均遵守動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定(No.2022-289)。

1.2 壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型制備及分組

大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后(0.3 mL/100 g體重),皮膚備皮消毒沿腹正中線縱行切開皮膚及肌層,在腎動脈分支水平上方分離腹主動脈,用4號注射器針頭緊貼腹主動脈,平行放置,并將二者一起結(jié)扎,然后抽出注射器針頭,即可部分縮窄腹主動脈制備壓力超負(fù)荷模型。假手術(shù)組動物無腹主動脈縮窄,其余步驟均與模型組相同。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組(Sham組,n=8),壓力超負(fù)荷模型組(Model組,n=8),SRT1720干預(yù)組[SRT1720組,n=8,灌胃給予SRT1720 20 mg/(kg·d),純度>99%,購自美國Sigma公司]。

1.3 心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

出生1～3 d的健康SD乳鼠數(shù)只,快速取出心室置于預(yù)冷的PBS中,洗滌3次。將心臟剪成約1 mm3大小組織塊,加入0.08%胰蛋白酶開始消化,約4 min后吸取上清液到含10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM/F12培養(yǎng)液(Corning公司)中終止消化,如此反復(fù)消化8～9次,至只剩膠原為止。后將消化所得細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,分離出首先貼壁的成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[13]。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,以每孔3×103個細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液過夜饑餓處理。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為4組:正常對照組(Control,n=6)、1 μmol/L AngⅡ單獨(dú)干預(yù)組(AngⅡ,n=6,純度> 99%,購自美國Sigma公司)、1 μmol/L AngⅡ加5 μmol/L SRT1720干預(yù)組(AngⅡ+SRT1720,n=6),各組干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入MTT溶液10 μL(濃度5 mg/mL),繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去上清,每孔再加入DMSO溶液10 μL,當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)紫色顆粒結(jié)晶并充分溶解后,檢測吸光度A490nm值。

1.5 病理學(xué)檢測

將心肌組織按常規(guī)沖洗、浸蠟、包埋、切片(厚度5 μm)。切片脫蠟至水,采用Masson染色檢測心肌組織膠原蛋白的分布,并計算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF),CVF=膠原面積/總面積,其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟塊切片(5 μm)常規(guī)脫蠟,抗原修復(fù),再經(jīng)3% H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶,滴加50 μL相應(yīng)TGF-β1、p-Smad2/3一抗(抗TGF-β1、p-Smad2/3單克隆抗體購自Abcam公司),4 ℃過夜,PBS沖洗,滴加50 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(購自Abcam公司),37 ℃孵育1 h;PBS沖洗;DAB顯色后蘇木精復(fù)染30～40 s;梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片;鏡檢拍片(顯棕黃色或棕褐色者為陽性表達(dá)),陰性對照組省略一抗。采用Image-pro Plus Version 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,結(jié)果以平均吸光度(A)值表示。

1.7 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)

取心肌組織或成纖維細(xì)胞約100 mg,采用Trizol法提取總RNA(試劑盒購自Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄為cDNA然后純化(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自谷歌生物技術(shù)有限公司);檢索目標(biāo)基因的序列,引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成(表1)。從擴(kuò)增曲線上確定Ct值,以GAPDH為內(nèi)參,構(gòu)建Ct值-拷貝數(shù)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各自檢測Ct值得出樣本中待測基因的相對濃度。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

取大鼠心肌組織,提取蛋白;考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白濃度;取適量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并將其轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜;5%脫脂奶粉封閉。然后將膜依次與相應(yīng)SIRT1、TGF-β1一抗4 ℃孵育過夜(抗SIRT1、TGF-β1單克隆抗體購自Abcam公司),洗膜,二抗室溫孵育120 min(辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗購自Abcam公司)。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),膠片隨后進(jìn)行顯影、定影,繼而對陽性條帶進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SRT1720對壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織纖維化的影響

如圖1A所示,壓力超負(fù)荷大鼠模型心肌間質(zhì)可見藍(lán)染膠原纖維增多,呈條索狀包繞,纖維相互交織,雜亂無章,出現(xiàn)明顯間質(zhì)纖維化,給予SIRT1激活劑SRT1720干預(yù)后藍(lán)染膠原纖維較模型組明顯減少,部分與心肌纖維平行,部分交叉。心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成在壓力超負(fù)荷模型組均明顯增加,給予SRT1720干預(yù)后均顯著降低(圖1B～1D)。

Sham:假手術(shù)組(n=8);Model:壓力超負(fù)荷模型組(n=8);SRT1720:SRT1720干預(yù)組(n=8);A:大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果;B:大鼠心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù);C～D:大鼠心肌組織mRNA表達(dá)情況;**P<0.01

2.2 SRT1720對壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織SIRT1及TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

壓力超負(fù)荷模型組與假手術(shù)組相比,SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著下降,TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加,給予SRT1720干預(yù)后,可升高SIRT1 mRNA及蛋白表達(dá),同時降低TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)(圖2A～2E)。另外,Pearson相關(guān)性分析顯示,SIRT1蛋白表達(dá)與TGF-β1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖2F)。

Sham:假手術(shù)組(n=8);Model:壓力超負(fù)荷模型組(n=8);SRT1720:SRT1720干預(yù)組(n=8);A～B:大鼠心肌組織mRNA表達(dá)情況;C～E:大鼠心肌組織蛋白表達(dá)情況;F:Pearson相關(guān)分析結(jié)果;*P<0.05,**P<0.01

2.3 SRT1720對壓力超負(fù)荷心肌組織TGF-β1/Smads信號通路的影響

壓力超負(fù)荷模型組與假手術(shù)組相比,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3免疫組化染色顯示棕黃色染色組織分布不均,無規(guī)則(圖3A),給予SRT1720后可改善。同時,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白染色的平均吸光度(A值)在壓力超負(fù)荷模型組均明顯增強(qiáng),而在SRT1720干預(yù)組,TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3陽性染色及平均吸光度值顯著降低(均P<0.01,圖3B)。

Sham:假手術(shù)組(n=8);Model:壓力超負(fù)荷模型組(n=8);SRT1720:SRT1720干預(yù)組(n=8);*P<0.05,**P<0.01

2.4 SRT1720對AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖的影響

AngⅡ可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖,給予SIRT1激活劑SRT1720作用24 h后可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(圖4)。

Control:正常對照組(n=6);AngⅡ:AngⅡ單獨(dú)干預(yù)組(n=6);AngⅡ+SRT1720:AngⅡ加SRT1720干預(yù)組(n=6);**P<0.01

2.5 SRT1720對AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

給予AngⅡ刺激后可明顯促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成,與正常對照組相比,AngⅡ干預(yù)組Col1α1和Col3α1合成分別增加至(2.997 ± 0.764)倍(P<0.01vs.Control,圖5 A),(2.387 ± 0.728)倍(P<0.01vs.Control,圖5B)。而給予SRT1720干預(yù)后則可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞膠原合成。

Control:正常對照組(n=6);AngⅡ:AngⅡ單獨(dú)干預(yù)組(n=6);AngⅡ+SRT1720:AngⅡ加SRT1720干預(yù)組(n=6);**P<0.01

2.6 SRT1720對AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心臟成纖維細(xì)胞SIRT1及TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

SIRT1 mRNA在AngⅡ干預(yù)組的表達(dá)與正常對照組相比顯著降低,為正常對照組的(0.559 ± 0.113)倍(P<0.01vs.Control,圖6A),TGF-β1 mRNA表達(dá)在AngⅡ干預(yù)組較正常對照組相比顯著增加,為正常對照組的(2.193 ± 0.624)倍(P<0.01vs.Control,圖6B)。給予SRT1720干預(yù)后,可上調(diào)SIRT1 mRNA表達(dá),同時下調(diào)TGF-β1 mRNA表達(dá)(圖6)。

Control:正常對照組(n=6);AngⅡ:AngⅡ單獨(dú)干預(yù)組(n=6);AngⅡ+SRT1720:AngⅡ加SRT1720干預(yù)組(n=6);*P<0.05,**P<0.01

3 討論

隨著我國居民生活水平提高,高血壓、冠心病等心血管疾病患病率急劇升高。近年來,許多學(xué)者認(rèn)為心肌纖維化是決定高血壓病患者的心肌舒張僵硬程度的主要因素,常常是發(fā)生心室重構(gòu)和心力衰竭的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[1,14]。因此在壓力超負(fù)荷型心臟疾病患者治療中,阻斷心肌纖維化已成為臨床治療的關(guān)鍵,闡明其發(fā)生機(jī)制和開發(fā)有效的防治藥物,已成為國內(nèi)外的關(guān)注熱點(diǎn)。

正常心肌組織約2/3由非心肌細(xì)胞構(gòu)成,即細(xì)胞間質(zhì),而細(xì)胞間質(zhì)主要由成纖維細(xì)胞及其合成的膠原所組成[15]。在壓力超負(fù)荷心肌肥厚模型中,一方面,心肌細(xì)胞代償性肥大;另一方面,成纖維細(xì)胞過度活化增殖。以上兩方面因素造成心肌結(jié)構(gòu)重塑及心肌纖維化,導(dǎo)致心臟的收縮舒張功能障礙[16]。因此,抑制壓力超負(fù)荷等病理情況下成纖維細(xì)胞的過度增殖及活化可能是治療或減緩心肌纖維化的有效治療策略。本文復(fù)制了AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細(xì)胞增殖模型,發(fā)現(xiàn)給予AngⅡ刺激后,可出現(xiàn)明顯的成纖維細(xì)胞增殖,同時部分縮窄腹主動脈亦發(fā)生明顯的間質(zhì)纖維化,給予SRT1720激活SIRT1后,可明顯改善成纖維細(xì)胞增殖及壓力負(fù)荷大鼠心肌間質(zhì)纖維化程度。

Ⅰ型和Ⅲ型膠原在合成的膠原中占90%以上,膠原合成增多或降解減少,均可使膠原過多沉積,導(dǎo)致心肌纖維化[15]。本課題組研究結(jié)果顯示:模型組成纖維細(xì)胞及大鼠心肌組織均發(fā)現(xiàn)Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成增加,給予SRT1720干預(yù)后均能顯著抑制其合成。

TGF-β1屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族,據(jù)報道具有多種生物學(xué)效應(yīng)[17]。有文獻(xiàn)報道,TGF-β1過表達(dá)可促進(jìn)心肌肥厚、基質(zhì)沉積、心臟僵硬度增加等,病理性的TGF-β1過表達(dá)與左心室肥厚、血管重構(gòu)等亦密切相關(guān)。TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能成為心肌纖維化治療的一個有意義靶點(diǎn)[18]。TGF-β1可激活多個信號通路,其中Smads是其主要胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,與心肌纖維化和心肌重構(gòu)關(guān)系最為密切[19]。我們的研究結(jié)果顯示:SRT1720可升高成纖維細(xì)胞和在體壓力超負(fù)荷模型組大鼠SIRT1 mRNA及蛋白水平,顯著降低成纖維細(xì)胞和在體壓力超負(fù)荷模型組大鼠TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)水平,同時,SIRT1蛋白表達(dá)與TGF-β1蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。

綜上所述,SRT1720可通過激活SIRT1抑制AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖及壓力超負(fù)荷大鼠纖維化,并減少其膠原蛋白的合成。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),SRT1720還可顯著下調(diào)模型組成纖維細(xì)胞及大鼠心肌組織TGF-β1的表達(dá),且SIRT1蛋白表達(dá)和TGF-β1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),即SIRT1可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號通路改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化,這可能是其發(fā)揮抗心肌纖維化作用的重要機(jī)制。本研究可望為壓力超負(fù)荷心肌纖維化的治療提供新的治療靶點(diǎn)及理論依據(jù)。