施 媛, 李明霞, 高 珊, 付 葵, 彭 堅

武漢市第三醫(yī)院麻醉科,武漢 430070

膿毒癥相關性腦病(sepsis associated encephalopathy,SAE)是一種由膿毒癥引起的彌漫性腦疾病[1]。SAE患者的死亡率極高,但SAE的發(fā)病機制仍不清楚[2]。研究認為,血腦脊液屏障損傷、腦血管功能障礙、氧化應激、炎癥損傷、線粒體功能障礙等與SAE的發(fā)病機制密切相關,其中炎癥損傷是目前證據(jù)最為確鑿的假說之一,因此研究如何有效抑制SAE中的炎癥反應對于SAE病情的緩解和治療至關重要[3]。

膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)是一種腦腸肽,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中學習和記憶等多種生物功能的調(diào)節(jié)[4]。CCK有多種亞型,其中八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)是具有CCK完全功能的最小活性片段,被證實參與多種動物模型中炎癥反應的調(diào)節(jié),提示CCK-8可能參與SAE中炎癥反應的調(diào)節(jié)[5-6]。研究表明,谷氨酸(glutamate,Glu)作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在神經(jīng)元信息傳遞中發(fā)揮重要作用,Glu過度積累會引發(fā)Glu興奮性毒性反應,引起神經(jīng)元損傷[7]。通過谷氨酸轉運體(glutamate transporter,GLT)對細胞外Glu進行重攝取是改變細胞外Glu濃度的主要途徑,其中GLT-1是眾多轉運體亞型的一種,可通過轉運多余Glu來保護神經(jīng)元[8]。綜上,本研究假設CCK-8能夠抑制炎癥反應,促進GLT-1的表達,降低細胞外Glu的濃度,發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。為驗證此假設,本研究用不同濃度的CCK-8處理Glu誘導的星形膠質(zhì)細胞,明確CCK-8對GLT-1表達和Glu水平的影響,為SAE的診斷和治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CCK-8購自源葉生物(S80567),L-谷氨酸購自阿拉丁公司(G103978),DMEM/F12培養(yǎng)液購自Hyclone公司(SH30023.01),DMSO購自Sigma公司(D2650),MTT購自Solarbio公司(M1025),凋亡檢測試劑盒購自BD公司(556547),Glu測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(A074-1-1),小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒、兔抗Caspase-3、Bcl-2、GLT-1、GLAST、GAPDH和HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢Bioswamp公司(MU30030、PAB33236、PAB30041、PAB30235、PAB32626、PAB36269、SAB43714),SYBR染料購自美國KAPA Biosystems公司,逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng)

小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的體外原代培養(yǎng)參考Mccarihy法并加以改進[9]。取新生1～3 d的C57BL/6小鼠,消毒、開顱、剔除血管及腦膜分離出海馬,用預冷的含2%雙抗的PBS沖洗3遍,海馬組織剪成直徑2 mm左右的碎塊,胰酶消化至無明顯組織塊,離心,加入DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化,制成單細胞懸液,差速貼壁40 min,按106個/mL密度以含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液接種。將接種細胞置于37 ℃,5% CO2的孵箱中培養(yǎng)7～9 d,待細胞融合度達到70%～80%時,將培養(yǎng)瓶置于恒溫(37℃)旋轉搖床上以240 r/min的轉速搖18 h后,進行傳代培養(yǎng)即得純化的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞。

1.3 不同濃度CCK-8對小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的毒性檢測

將小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞接種于96孔板,每孔3×105個細胞,過夜培養(yǎng)使細胞貼壁,分別用0.1、0.5和1.0 μmol/L的CCK-8處理細胞,培養(yǎng)30 min[10],每組設置3個復孔,并設置空白對照組,處理完成后加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),培養(yǎng)4 h后去上清,加入150 μL DMSO溶解液,搖床振蕩10 min,酶標儀檢測490nm處的吸光值(A490nm)。

1.4 細胞分組及處理

將細胞分成5組:對照組、Glu組、Glu+0.1 μmol/L CCK-8組、Glu+0.5 μmol/L CCK-8組、Glu+1.0 μmol/L CCK-8組。對照組不作處理;Glu組用1 mmol/L的Glu作用10 s;其余組先用CCK-8預處理30 min,再加入1 mmol/L的Glu作用10 s[11]。處理完成后以MTT法檢測細胞增殖能力。

1.5 流式檢測細胞凋亡

取各組處理完成的細胞,400×g、4℃離心5 min,棄上清,預冷的PBS洗滌細胞后重懸于200 μL PBS,加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI,混勻后4℃避光孵育30 min,加入300 μL PBS,隨即進行流式檢測。

1.6 生化試劑盒檢測細胞中Glu含量

將各組處理完成的細胞懸液加入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h,按照谷氨酸測試盒說明書檢測小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞中Glu的含量。

1.7 qRT-PCR檢測GLT-1和GLAST mRNA的表達

Trizol法提取各組細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,進行實時熒光定量PCR。擴增體系:SYBR染料10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O定容至總體積20 μL。反應程序:預變性95℃ 3 min,擴增95℃ 5 s,56℃ 10 s,72℃ 25 s,共40個循環(huán)。反應結束后,以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算GLT-1和GLAST mRNA的表達水平。

1.8 Western blot檢測Caspase-3、Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白的表達

提取各組細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,取20 μg蛋白進行10% SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白濕轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉2 h,加入1∶1000稀釋的Caspase-3、Bcl-2、GLT-1、GLAST和GAPDH一抗,4℃孵育過夜,次日加入1∶20000稀釋的二抗,37℃孵育1 h,ECL顯影,曝光,用Image Pro Plus 7.0軟件分析條帶灰度值。

1.9 ELISA檢測細胞上清中TNF-α的水平

收集各組處理完成的細胞上清,采用小鼠TNF-α ELISA試劑盒檢測各組細胞上清中TNF-α的水平,具體操作按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 不同濃度CCK-8對小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞增殖的影響

與對照組相比,0.1、0.5和1.0 μmol/L的CCK-8對小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的增殖均無明顯影響(均P>0.05)。見圖1。

圖1 CCK-8對小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞增殖的影響Fig.1 Effect of CCK-8 on the proliferation of mouse hippocampal astrocytes

2.2 不同濃度CCK-8對Glu誘導的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞增殖的影響

與對照組相比,Glu組細胞增殖能力顯著降低(P<0.01);與Glu組相比,0.1 μmol/L CCK-8干預對細胞增殖能力無顯著影響(P>0.05),而0.5和1.0 μmol/L CCK-8干預均能顯著促進星形膠質(zhì)細胞增殖(P<0.05,P<0.01)。見圖2。

與對照組比較,**P<0.01;與Glu組比較,△P<0.05 △△P<0.01

2.3 不同濃度CCK-8對Glu誘導的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響

與對照組相比,Glu組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01);與Glu組相比,不同濃度的CCK-8干預均能顯著降低細胞凋亡率(均P<0.01)。見圖3。

與對照組比較,**P<0.01;與Glu組比較,△△P<0.01

2.4 不同濃度CCK-8對Glu誘導的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞中Glu含量的影響

與對照組相比,Glu組細胞中Glu含量顯著升高(P<0.01);與Glu組相比,不同濃度的CCK-8干預均能顯著降低細胞中Glu含量(均P<0.01)。見圖4。

與對照組比較,**P<0.01;與Glu組比較,△△P<0.01

2.5 不同濃度CCK-8對Glu誘導的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞中GLT-1和GLAST mRNA表達的影響

與對照組相比,Glu組細胞中GLT-1和GLAST mRNA表達水平顯著降低(均P<0.01);與Glu組相比,0.1 μmol/L CCK-8干預對細胞中GLT-1和GLAST mRNA表達水平無顯著影響(均P>0.05),而0.5和1.0 μmol/L CCK-8干預均能顯著上調(diào)細胞中GLT-1和GLAST mRNA的表達水平(P<0.05,P<0.01)。見圖5。

與對照組比較,**P<0.01;與Glu組比較,△P<0.05 △△P<0.01

2.6 不同濃度CCK-8對Glu誘導的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞中Caspase-3、Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白表達的影響

與對照組相比,Glu組細胞中Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.01),Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白表達水平顯著降低(均P<0.01);與Glu組相比,不同濃度的CCK-8干預均能顯著下調(diào)細胞中Caspase-3蛋白表達水平,并顯著上調(diào)Bcl-2、GLT-1和GLAST蛋白表達水平(均P<0.05)。見圖6。

與對照組比較,**P<0.01;與Glu組比較,△P<0.05 △△P<0.01

2.7 不同濃度CCK-8對Glu誘導的小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞上清中TNF-α水平的影響

與對照組相比,Glu組細胞上清中TNF-α水平顯著升高(P<0.01);與Glu組相比,不同濃度的CCK-8干預均能顯著降低細胞上清中TNF-α水平(均P<0.01)。見圖7。

與對照組比較,**P<0.01;與Glu組比較,△△P<0.01

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的膠質(zhì)細胞,具有支持神經(jīng)元活動和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的關鍵作用[12]。本研究用Glu誘導海馬星形膠質(zhì)細胞損傷,結果顯示,高濃度的Glu能夠抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖,并促進細胞凋亡,與前期研究結果一致[13],而CCK-8干預能夠逆轉Glu對星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的損傷,表明CCK-8對Glu誘導的海馬星形膠質(zhì)細胞具有保護作用。此外本研究還檢測了凋亡相關蛋白Bcl-2和Caspase-3的表達,其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,而Caspase-3是凋亡的關鍵執(zhí)行者[14],結果顯示,過量的Glu能夠上調(diào)星形膠質(zhì)細胞中Caspase-3的表達并下調(diào)Bcl-2的表達,而CCK-8干預能夠逆轉Caspase-3和Bcl-2的表達,這表明CCK-8能夠通過調(diào)控凋亡相關蛋白的表達來抑制星形膠質(zhì)細胞的凋亡。

研究表明,星形膠質(zhì)細胞的基本功能之一是攝取大部分突觸釋放的Glu,防止Glu興奮性毒性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),Glu的清除是由GLT介導的,且這些轉運體主要由星形膠質(zhì)細胞表達[15]。GLT-1和GLAST是GLT的亞型,負責90%以上Glu的攝取,主要分布在星形膠質(zhì)細胞表面,對維持Glu神經(jīng)信號的正常傳遞具有重要作用[16]。多項研究表明,GLT-1和GLAST與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。Ramandi等[17]發(fā)現(xiàn)癲癇急性期大鼠Glu水平升高,且GLT-1的表達下調(diào),而服用藥物后,Glu水平降低,GLT-1的表達上調(diào)。馬宇昕等[18]發(fā)現(xiàn)GLAST在阿爾茲海默病模型小鼠中的表達降低,而藥物干預治療后GLAST的表達上調(diào)。本研究結果顯示,Glu處理能夠抑制GLT-1和GLAST的表達,而CCK-8干預能夠降低Glu水平,并上調(diào)GLT-1和GLAST的表達,與上述研究結果一致,提示CCK-8能夠通過上調(diào)Glu誘導的星形膠質(zhì)細胞中GLT-1和GLAST的表達來降低細胞外Glu的水平,從而緩解細胞損傷。

既往研究證明,膿毒癥并發(fā)癥可誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應,導致臨床預后不良[19]。SAE的發(fā)病機制與神經(jīng)炎癥有著密不可分的聯(lián)系,神經(jīng)炎癥是導致神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞功能障礙和大量凋亡的主要原因[20]。局部和外周炎癥都是由固有的大腦免疫細胞,特別是小膠質(zhì)細胞的激活引起的。激活的小膠質(zhì)細胞可以釋放大量的炎癥介質(zhì),炎癥介質(zhì)釋放后會進一步加重神經(jīng)炎癥[21]。研究表明,炎癥因子TNF-α能夠調(diào)節(jié)GLT-1的表達,在SAE的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[22-23]。Song等[24]研究發(fā)現(xiàn)抑制TNF-α表達能夠保護神經(jīng)元免受Glu誘導的細胞死亡。本研究結果顯示,Glu處理能夠促進星形膠質(zhì)細胞釋放TNF-α。而CCK-8干預后,TNF-α的釋放受到抑制,表明CCK-8能夠通過抑制Glu誘導的星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應,進而可能以此調(diào)控GLT-1的表達。

綜上所述,CCK-8能夠抑制Glu誘導的星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應,促進GLT-1的表達,降低細胞外Glu的濃度,從而抑制細胞凋亡并促進其增殖。