張春艷, 曹曉璐, 劉 嵩, 黃瑞松, 李姝雅, 王江友

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院制藥工藝研究所,職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室,武漢 430065 2武漢科技大學(xué)附屬武漢亞洲心臟病醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430022 3武漢科技大學(xué)附屬武漢亞心總醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430058

急性心肌梗死是冠心病高病死率的主要原因,其治療主要是通過溶栓、擴管等藥物,以及冠狀動脈介入來盡快開通閉塞血管[1]。然而大量研究表明心肌恢復(fù)血氧供應(yīng)會造成周圍心肌細胞進一步死亡,心肌功能損傷加重,即心肌缺血再灌注損傷[2]。目前的臨床處理手段僅解決了血管病變,未考慮周圍心肌損傷的修復(fù)。因此,尋找安全有效的藥物,并深入解析其藥理作用,對改善臨床急性心肌梗死患者預(yù)后具有重要意義。

葛根素(Puerarin)是從中藥葛根的干燥根中提取的異黃酮類化合物,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種活性[3]。近年來有研究表明,葛根素具有減輕冠心病大鼠心功能障礙的作用[4],可通過抑制TRPC6-CaN-NFATc3通路改善心功能,減輕心肌重構(gòu)[5],表明葛根素在治療心血管疾病中具有積極作用。不僅如此,葛根素還可能通過調(diào)控SIRT1、核因子κB(NF-κB)等通路減輕心肌缺血介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[6]。但葛根素的具體藥理作用靶點和機制,未見報道,還有待進一步研究。

中藥因其有效性和高安全性的特點已受到越來越多關(guān)注,利用現(xiàn)代計算機輔助藥物研發(fā)技術(shù)聯(lián)合體內(nèi)傳統(tǒng)藥理研究策略,可準(zhǔn)確揭示藥物具體作用靶點和作用機制[7]。因此,本研究擬通過分子對接及分子動態(tài)模擬評估葛根素緩解心肌缺血再灌注損傷的主要作用靶點,并通過整體動物實驗進一步驗證其作用與調(diào)控機制,以此為葛根素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 分子對接

于PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中(https://www.rcsb.org/)下載SIRT1(PDBID:4ZZI)的蛋白結(jié)構(gòu)文件。從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載葛根素的晶體結(jié)構(gòu)文件。使用Discovery studio 2020軟件處理蛋白與葛根素的結(jié)構(gòu)文件。使用Autodock Vina程序進行SIRT1與葛根素的分子對接,并根據(jù)能量匹配做出評價。

1.2 分子動力學(xué)(MD)模擬

使用GROMACS 2018.8軟件對SIRT1葛根素復(fù)合物進行100 ns的分子動力學(xué)模擬。在300 K的溫度下使用2.0fs步長執(zhí)行NVT平衡,執(zhí)行時間為500 ps。在一個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下執(zhí)行NPT平衡,執(zhí)行時間為500 ps;使用NPT平衡之后的復(fù)合物在300 K下進行動態(tài)模擬。計算空白SIRT1蛋白與葛根素-SIRT1復(fù)合物的均方根偏差(RMSD),單端氨基酸殘基的均方根波動(RMSF)軌跡及氫鍵變化。應(yīng)用g_mmpbsa程序分析模擬平衡期間的最后5 ns的平均動態(tài)結(jié)合能。使用g_covar和g_anaeig進行主成分分析(PCA)。使用PyMOL 1.5軟件進行可視化分析。

1.3 動物分組

6周齡SPF級雄性SD大鼠,體重250～280 g,購自湖北省疾病預(yù)防控制中心(編號42000600039604)。分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中(實驗動物使用許可證號:SYXK鄂2018-0045),常溫、常規(guī)大鼠飼料喂養(yǎng),自由飲水。利用隨機數(shù)字法將SD大鼠均分為4組,每組20只。Sham組:僅打開胸腔,未結(jié)扎冠狀動脈左前降支;Model組:結(jié)扎冠狀動脈左前降支缺血40 min再灌注120 min;Puerarin組:腹腔注射葛根素[(純度>98.0%)上海源葉生物科技有限公司;20 mg/(kg·d),1次/d)]連續(xù)3 d后,構(gòu)建模型;EX527組:腹腔注射葛根素[20 mg/(kg·d),1次/d]連續(xù)3 d后,給予EX527(美國Selleckche公司;5 mg/kg)處理20 min后構(gòu)建模型。

1.4 動物實驗方法

1.4.1 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 再灌注結(jié)束后,將心臟取下凍存于-20℃約1 h。沿縱軸將心臟切成4～6片厚度均勻的切片,并將切片放入盛有1%TTC溶液(中國武漢科瑞)的12孔板中,37℃避光水浴15 min。然后放入10%多聚甲醛中室溫固定2 d。將染好的心臟切片用數(shù)碼相機拍照,使用Image J軟件測量心肌梗死面積。心肌梗死面積百分比的計算公式為:心肌梗死面積/總面積×100%。

1.4.2 TUNEL法聯(lián)合免疫熒光檢測 將處理完的大鼠經(jīng)左室心肌組織注入500 mL生理鹽水后,再用4%多聚甲醛固定,取心臟缺血區(qū)組織行常規(guī)石蠟包埋、切片,片厚4～5μm。石蠟切片60℃烤片1 h,二甲苯脫蠟后梯度乙醇復(fù)水,Proteinase K工作液37℃恒溫孵育30 min,加入TUNEL(Meilunbio)反應(yīng)液,37℃孵育1 h,滴加50 μL FITC液,37℃避光孵育1 h。10%山羊血清封閉30 min,濕盒中孵育一抗(SIRT1,Bioss公司,1∶150)4℃冰箱過夜,孵育二抗(Cy3,Solarbio公司,1∶200),甘油封片。TUNEL陽性細胞呈綠色熒光,SIRT1表達呈紅色熒光,激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯,FV1000)觀察拍照,隨機選取5個視野用于分析凋亡率及SIRT1平均熒光強度。

1.4.3 透射電鏡(TEM)觀察 取大鼠心臟缺血區(qū)組織(約1 mm3),用生理鹽水洗滌,然后用2.5%戊二醛砷酸二甲酯鈉固定液浸泡2～3 h。樣品脫水后,用二甲砷酸鈉緩沖液洗滌2次。用1%的四氧化鋨固定后,包埋樣品,制作超薄切片,然后用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染色。最后,用透射電鏡(Talos L120C,由中國科學(xué)院武漢病毒研究所分析測試中心提供)觀察心肌超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4.4 Western blot檢測 取心臟梗死區(qū)組織,提取組織總蛋白,采用BCA法進行蛋白定量分析,配制10%或12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠,30 μg蛋白變性后上樣,電泳,電轉(zhuǎn)。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,將脫脂奶粉洗去,分別加入一抗SCL7A11(CST公司,1∶1000)、GPX4(Boiss公司,1∶500)、IEBR2(Bioss公司,1∶1000)和β-actin(武漢博士德生物工程有限公司,1∶5000)4℃靜置過夜;第二天,洗膜緩沖液洗去非特異性結(jié)合的一抗,二抗(武漢博士德生物工程有限公司,1∶5000)室溫孵育2 h,洗膜緩沖液洗去非特異性結(jié)合的二抗,ECL顯色,用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析,以目的蛋白和β-actin的比值進行相對定量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 葛根素與SIRT1蛋白的分子對接

采用分子對接實驗對葛根素和SIRT1蛋白的結(jié)合潛力進行了評估。結(jié)果顯示葛根素與SIRT1的結(jié)合能為-9.4 kcal/mol,表明葛根素與SIRT1蛋白具有良好的結(jié)合潛力。如圖1所示,葛根素可與SIRT1蛋白的HIS-363蛋白殘基形成氫鍵,與PHE-273、PHE-297及PHE-414蛋白殘基形成Pi-Pi堆積鍵,說明葛根素可以與SIRT1對接,并形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

A:葛根素化學(xué)結(jié)構(gòu);B:研究過程和設(shè)計;C、D:在分子對接實驗中葛根素與SIRT1相互作用的二維(C)和三維(D)圖

2.2 葛根素與SIRT1的分子動力學(xué)模擬

選取分子對接結(jié)果中葛根素與SIRT1結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象進行MD模擬分析并從100 ns內(nèi)每隔20 ns抽取一幀觀察其結(jié)合狀態(tài)(圖2A)。整個過程中葛根素均未脫離蛋白活性區(qū)域,說明葛根素與SIRT1蛋白具有比較優(yōu)越的結(jié)合穩(wěn)定性,能夠穩(wěn)定結(jié)合。

A:分子動態(tài)模擬過程中葛根素和SIRT1形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)變化(20 ns、40 ns、60 ns、80 ns、100 ns);B:空白SIRT1蛋白與葛根素-SIRT1復(fù)合物的RMSD分析;C:空白SIRT1蛋白與葛根素-SIRT1復(fù)合物的RMSF分析;D:葛根素-SIRT1復(fù)合物在模擬期間的氫鍵變化分析;E:葛根素-SIRT1復(fù)合物殘基結(jié)合能量貢獻分析;F～G:空白SIRT1蛋白和葛根素-SIRT1復(fù)合物的PCA分析

為了更好地分析葛根素與SIRT1蛋白的結(jié)合穩(wěn)定性,對SIRT1-葛根素復(fù)合物的骨架原子的RSMD與空白SIRT1蛋白進行了比較(圖2B)。葛根素-SIRT1復(fù)合物的RMSD值為(0.3221±0.0380)nm?？瞻譙IRT1蛋白的RMSD值為(0.3631±0.0549)nm。在相同的模擬條件下,SIRT1-葛根素復(fù)合物的遷移率相較于空白SIRT1受體更低,表明葛根素與SIRT1蛋白結(jié)合穩(wěn)定。

SIRT1-葛根素復(fù)合物與空白SIRT1的RMSF對比分析結(jié)果(圖2C)發(fā)現(xiàn),相較于SIRT1受體,SIRT1-葛根素復(fù)合物在GLY-319～GLN-322間表現(xiàn)出單峰波動;CYS-398～PRO-403區(qū)域出現(xiàn)較大波動。但在活性位點區(qū)域沒有觀察到大的構(gòu)象波動,SIRT1與葛根素的結(jié)合較為穩(wěn)定。這些差異可能與蛋白質(zhì)的體積和結(jié)合能力的差異有關(guān)。

通過葛根素和SIRT1之間在模擬期間的氫鍵變化(圖2D)發(fā)現(xiàn),葛根素與SIRT1顯示出持續(xù)穩(wěn)定的氫鍵相互作用,最高達到20個氫鍵相互作用。這些結(jié)果表明,葛根素與SIRT1的分子間氫鍵相互作用非常穩(wěn)定且連續(xù)。

本研究結(jié)合上述結(jié)果分析模擬平衡期間的最后5 ns的平均動態(tài)結(jié)合能(圖2E)。SIRT1與葛根素的總結(jié)合能為-(65.67 ± 3.17) kcal /mol,SIRT1中的殘基ASP204、ASP-272、ARG-274、LYS-444和GLU-467貢獻了主要的結(jié)合能(<-5.0 kcal/mol),這與分子對接實驗的結(jié)果一致。

主成分分析(PCA)有助于分析動態(tài)軌跡中最重要的運動模式,是分析蛋白質(zhì)動力學(xué)行為的一種有效方法。為了深入研究葛根素與SIRT1蛋白結(jié)合后,其運動方向和運動模式發(fā)生如何變化,我們提取MD軌跡中每個α-碳原子的主要運動軌跡。圖2F為空白SIRT1蛋白與SIRT1-葛根素復(fù)合物在模擬過程中蛋白α-碳原子的協(xié)方差矩陣分析,結(jié)果表明在與葛根素結(jié)合后SIRT1蛋白中的α-碳原子運動幅度顯著降低,特別是MET-193～GLY-195,GLU-208～THR-209,VAL-285～PRO-288,ARG-397～ASP-401,ALA-425～ASP-429殘基中的α-碳原子運動幅度降低最為顯著;同時蛋白活性區(qū)域中的ALA-262、ILE-270、ASP-272、PHE-273、PHE-297、ASN-346、ILE-347、HIS-363、PHE-413、PHE-414、LEU-418、VAL-445、ARG-446、PRO-447殘基α-碳原子運動皆出現(xiàn)了明顯降低。圖2G為空白SIRT1蛋白與SIRT1-葛根素復(fù)合物在模擬過程中的α-碳原子運動趨勢對比。如圖所示,空白SIRT1蛋白中的α-碳原子運動方向雜亂無序,整體趨于膨脹;與葛根素結(jié)合后,SIRT1蛋白α-碳原子的運動整體呈現(xiàn)出收縮趨勢,蛋白的活性區(qū)域變得更加穩(wěn)定,這可能與葛根素和SIRT1之間的氫鍵作用有關(guān)。

2.3 葛根素通過調(diào)控SIRT1蛋白緩解心肌缺血再灌注損傷

在心肌缺血再灌注損傷大鼠體內(nèi)給予葛根素處理,并進一步使用EX527干預(yù)抑制SIRT1表達。通過TTC染色發(fā)現(xiàn)(圖3A、3B),模型構(gòu)建明顯增加大鼠心肌梗死面積;與模型組對比,葛根素治療組的心肌梗死面積顯著減小;與單純葛根素治療組相比,EX527干預(yù)后心肌梗死面積再次升高。通過TUNEL聯(lián)合免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)(圖3C～3E),相比假手術(shù)組,模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯上升,且SIRT1的表達下降;與模型組對比,葛根素治療組的心肌細胞凋亡率顯著降低,SIRT1的表達量增加;而EX527干預(yù)后SIRT1表達被抑制且心肌細胞凋亡率再次升高。說明葛根素具有緩解心肌缺血再灌注損傷的作用,且這一作用是通過作用于SIRT1實現(xiàn)的。

A:大鼠心肌TTC染色;B:心肌梗死面積百分比分析;C:TUNEL和免疫熒光檢測SIRT1;D:SIRT1蛋白平均熒光強度分析;E:心肌細胞凋亡率分析;**P<0.01;n=5

2.4 葛根素通過SIRT1調(diào)節(jié)鐵死亡改善心肌缺血再灌注的超微結(jié)構(gòu)損傷

透射電鏡發(fā)現(xiàn)(圖4A～4C),模型組的心肌纖維斷裂,結(jié)構(gòu)異常,線粒體嵴坍塌,形態(tài)模糊,線粒體評分降低;與模型組對比,葛根素治療組的心肌纖維結(jié)構(gòu)完整,線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰,線粒體評分顯著上升;與葛根素治療組相比,EX527干預(yù)后心肌纖維超微結(jié)構(gòu)和線粒體損傷增加。通過Western blot技術(shù)檢測鐵死亡相關(guān)通路蛋白表達(圖4D～4G)發(fā)現(xiàn),相比假手術(shù)組,模型組SLC7A11、GPX4蛋白的表達明顯下降,IREB2的蛋白表達明顯上升。與模型組對比,葛根素治療組SCL7A11、GPX4的表達顯著增加,IREB2的表達顯著下降。與葛根素治療組對比,EX527干預(yù)后SLC7A11、GPX4蛋白表達量下降,IREB2的表達明顯上升。說明葛根素能夠通過激活SIRT1蛋白抑制鐵死亡發(fā)生,改善心肌缺血再灌注引起的心肌超微結(jié)構(gòu)損傷性改變。

A:透射電鏡觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu);B:心肌纖維長度分析;C:心肌細胞線粒體評分;D～G:Western blot檢測鐵死亡相關(guān)蛋白的表達;*P<0.05,**P<0.01;n=5

3 討論

天然藥物安全性高,但由于作用機制不明確使得其在藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用過程中受到一定的阻礙[8-9]。天然藥物藥理研究需要確定藥物作用靶點并揭示其可能調(diào)控的機制,如果使用文獻參考、蛋白檢測或高通量測序等傳統(tǒng)方法對可能的靶標(biāo)進行一一篩選,費時、費力、耗費高[10]。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的迅速發(fā)展,采用分子對接及分子動態(tài)模擬等先進計算機虛擬篩選技術(shù),可高效、精準(zhǔn)、經(jīng)濟地評估藥物與潛在靶點的作用潛力,大大加快了天然產(chǎn)物活性成分篩選工作[7,11]。分子對接可預(yù)測分子與靶點的結(jié)合潛力,從而為藥物設(shè)計和藥物篩選提供指導(dǎo)。對篩選結(jié)果的分子動力學(xué)模擬有助于我們進一步揭示受體與蛋白質(zhì)相互作用的機制,提高虛擬篩選的可靠性[12]。此外,通過化合物與某些疾病的關(guān)鍵蛋白質(zhì)計算機預(yù)測結(jié)果,可以為我們進一步的實驗指明方向,更好地揭示化合物的藥理機制。

葛根素作為葛根主要活性成分,已被證實對心肌損傷具有一定的修復(fù)作用,可調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注后心肌酶學(xué)指標(biāo),并減少心肌梗死面積[13],這一點與我們的研究結(jié)果一致。我們的研究不僅證實了葛根素能夠減少心肌梗死面積,同時還明確了葛根素可顯著減少梗死區(qū)心肌細胞的凋亡,有效抑制心肌的損傷。在明確葛根素抗心肌缺血再灌注損傷藥效的基礎(chǔ)上,揭示分子機制的過程具有關(guān)鍵作用。雖然有少量研究發(fā)現(xiàn)葛根素通過調(diào)控組蛋白乙?；?、抑制炎癥因子等達到緩解心肌缺血損傷的作用[14],但無進一步的研究證實葛根素的具體作用靶點。

SIRT1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的組蛋白/非組蛋白去乙?；竅15],參與機體多種生理調(diào)控、代謝[16-18]。已有研究證實葛根素可影響SIRT1的表達活性,調(diào)控NF-κB/含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3(NLRP3)炎癥通路、降低叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞型1(FOXO1)乙?；?從而緩解心肌缺血再灌注損傷[6,19],說明SIRT1可能是葛根素發(fā)揮保護心肌作用的關(guān)鍵靶點。為確定這一問題,本研究利用計算機預(yù)測模型,重點關(guān)注葛根素和SIRT1蛋白的對接能力,并通過分子動態(tài)學(xué)模擬揭示了葛根素與SIRT1的相互作用。不僅如此,動物水平的研究也驗證了葛根素在抗心肌缺血再灌注損傷的過程中具有調(diào)控SIRT1蛋白表達的能力。一旦SIRT1表達被抑制,葛根素的藥理作用就會明顯降低,以此初步確定了葛根素的潛在作用靶點為SIRT1。

研究證明SIRT1能夠通過調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)基因,影響細胞內(nèi)鐵離子的平衡[20]。如:SIRT1可抑制鐵轉(zhuǎn)運蛋白的表達,減少細胞內(nèi)鐵離子的攝取和積累,從而降低鐵死亡的發(fā)生[21]。在心肌損傷發(fā)生過程中,炎癥小體NLRP3可促進心肌鐵死亡的發(fā)生[22-23],下調(diào)Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB炎癥通路活性可抑制鐵死亡[24],提示鐵死亡與心肌組織的炎癥反應(yīng)有直接作用關(guān)系。由于葛根素可通過SIRT1抑制心肌缺血再灌注介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[6],那么葛根素是否能通過調(diào)控鐵死亡抑制心肌缺血再灌注損傷,且這一作用是否是通過作用于SIRT1實現(xiàn)的?因此,為了系統(tǒng)揭示葛根素的調(diào)控機制,本研究在驗證上述計算機預(yù)測結(jié)果的基礎(chǔ)上,進一步在體內(nèi)實驗中對比SIRT1表達被抑制前后,葛根素抗心肌缺血損傷以及調(diào)控下游鐵死亡相關(guān)蛋白表達的變化,以此證明葛根素藥理活性與SIRT1活性密切相關(guān)。

線粒體作為細胞能量廠影響細胞氧化磷酸化并提供腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)[25-26],并同時參與多種細胞死亡類型,包括:凋亡、焦亡和鐵死亡等[27]。由于機體損傷導(dǎo)致線粒體形態(tài)發(fā)生變化,使其嵴增大、外膜破裂,異常線粒體結(jié)構(gòu)功能障礙增加了細胞鐵死亡易感性[28-29]。本研究在透射電鏡下觀察到心肌缺血再灌注損傷過程中,大鼠心肌缺血組織中不僅心肌纖維結(jié)構(gòu)異常改變,線粒體超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷,提示心肌缺血損傷會引發(fā)鐵死亡的發(fā)生,這一結(jié)果與以往的研究是一致的。葛根素抗心肌細胞凋亡同時,伴隨著心肌纖維和線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)至正常水平,這就說明葛根素可能就是通過調(diào)控鐵死亡抑制心肌缺血再灌注損傷的。而EX527作為SIRT1特異性蛋白表達抑制劑,其干預(yù)結(jié)果也進一步體現(xiàn)了SIRT1活性水平在葛根素調(diào)控鐵死亡影響心肌缺血損傷中的重要性。

基于此,本研究也重點關(guān)注了SIRT1表達被抑制前后,葛根素對心肌缺血區(qū)鐵死亡關(guān)鍵蛋白表達的影響變化,發(fā)現(xiàn)葛根素可增加缺血區(qū)SCL7A11、GPX4的蛋白表達,降低IREB2的蛋白表達;且葛根素的這一作用在SIRT1活性被抑制后則降低?，F(xiàn)有研究證實,SLC7A11與其亞基溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)形成系統(tǒng)Xc-(xCT),吸收胞外胱氨酸交換細胞內(nèi)谷氨酸,入胞的胱氨酸最終合成谷胱甘肽(GSH),GPX4將GSH氧化成氧化型谷胱甘肽,抑制脂質(zhì)過氧化物進而抑制鐵死亡[30-32]。另一方面,IREB2作為細胞鐵死亡的關(guān)鍵因素之一,通過與內(nèi)部核糖體進入位點(IREs)結(jié)合來響應(yīng)細胞內(nèi)鐵水平變化,IREB2的上調(diào)可以阻止轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Tfr)的降解,增加細胞內(nèi)鐵含量[33-34]。本研究證實葛根素逆轉(zhuǎn)了心肌缺血介導(dǎo)的鐵死亡蛋白的異常表達,并與SIRT1的活性息息相關(guān)。

綜上所述,本研究利用計算機分子對接和動態(tài)模擬揭示了葛根素與SIRT1蛋白相互作用的潛在能力,并聯(lián)合整體動物水平實驗揭示了葛根素緩解心肌缺血再灌注損傷介導(dǎo)的鐵死亡與SITR1活性的相關(guān)性。不僅為中藥藥理研究和藥物研發(fā)提供了新思路,同時為臨床應(yīng)用葛根素作為心肌保護劑提供了理論依據(jù)。