周 方, 王 猛, 程世釗, 王 崢, 盧喜科

天津大學(xué)胸科醫(yī)院胸外科,天津 300222

肺癌發(fā)病隱匿,發(fā)病率和死亡率較高[1]。circFOXK2被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中表達(dá)上調(diào),通過競爭性吸附miR-370并上調(diào)IGF2BP3的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲,可作為乳腺癌治療的分子靶點(diǎn)[2]。研究還顯示,circFOXK2在胰腺導(dǎo)管腺癌中也表達(dá)上調(diào),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長、遷移及侵襲,對胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用[3]。但是目前,circFOXK2在肺癌發(fā)展中的作用及機(jī)制尚不清楚。通過Starbase軟件預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)circFOXK2可能與miR-409-3p互補(bǔ)結(jié)合。既往的研究顯示miR-409-3p在肺癌組織及細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-409-3p可通過抑制SPIN1表達(dá)降低肺癌細(xì)胞的惡性行為,進(jìn)而延緩肺癌的發(fā)展進(jìn)程[4]。本研究探究circFOXK2是否靶向miR-409-3p調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

從天津大學(xué)胸科醫(yī)院招募45例肺癌患者,收集手術(shù)切除腫瘤獲取的癌組織及癌旁組織樣本。研究獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)并遵循《赫爾辛基宣言》準(zhǔn)則。

1.2 細(xì)胞和試劑

A549和H1299細(xì)胞,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液,美國Gibco;PCR相關(guān)試劑盒,日本TaKaRa;LipofectamineTM2000試劑盒,美國Invitrogen;抗體,美國Abcam;CCK-8試劑盒、雙熒光素酶試劑盒和BCA試劑盒,北京索萊寶;引物序列、熒光素酶報(bào)告基因,上海生工。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測 提取總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549及H1299細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。用LipofectamineTM2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,分為circFOXK2小干擾RNA組(si-circFOXK2組)、si-NC組、miR-409-3p模擬物組(miR-409-3p組)、miR-NC組、miR-409-3p抑制劑組(anti-miR-409-3p組)、anti-miR-NC組、si-circFOXK2+anti-miR-409-3組、si-circFOXK2+anti-miR-NC組。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將wt/mut-circFOXK2和miR-409-3p mimics/miR-NC轉(zhuǎn)染入A549和H1299細(xì)胞,使用雙熒光素酶試劑盒分析相對熒光素酶活性。

1.3.4 CCK-8法檢測 A549和H1299細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h。細(xì)胞與CCK-8孵育2 h,酶標(biāo)儀檢測吸光度值,評估細(xì)胞存活率。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)14 d。細(xì)胞經(jīng)多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色,在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn) A549和H1299細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液重懸,接種于預(yù)先包被或不包被基質(zhì)膠的Transwell上室,下室加入完全培養(yǎng)液。24 h后,細(xì)胞用多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法 提取總蛋白,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后,分別與一抗和二抗孵育。最后使用ECL顯影,Image J軟件分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circFOXK2和miR-409-3p在肺癌組織中的表達(dá)水平

肺癌組織中,circFOXK2水平明顯上升(P<0.05),miR-409-3p水平明顯下降(P<0.05)。見圖1。

A:肺癌組織中circFOXK2高表達(dá);B:肺癌組織中miR-409-3p低表達(dá);*P<0.05

2.2 circFOXK2和miR-409-3p轉(zhuǎn)染效果

si-circFOXK2組A549和H1299細(xì)胞中circFOXK2表達(dá)低于si-NC組(均P<0.05)。miR-409-3p組A549和H1299細(xì)胞中miR-409-3p表達(dá)高于miR-NC組(均P<0.05)。anti-miR-409-3p組A549和H1299細(xì)胞中miR-409-3p表達(dá)低于anti-miR-NC組(均P<0.05)。見圖2。

A、D:si-circFOXK2轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證,與si-NC組比較,*P<0.05;B、E:miR-409-3p mimics轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證,與miR-NC組比較,#P<0.05;C、F:anti-miR-409-3p轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證,與anti-miR-NC組比較,&P<0.05

2.3 circFOXK2靶向miR-409-3p

圖3A顯示了Starbase軟件預(yù)測的circFOXK2與miR-409-3p的結(jié)合位點(diǎn)。A549和H1299細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimics和wt-circFOXK2的熒光素酶活性顯著下降(均P<0.05),證實(shí)circFOXK2和miR-409-3p存在互作關(guān)系,見圖3B和3C。si-circFOXK2組A549和H1299細(xì)胞中miR-409-3p表達(dá)較si-NC組顯著升高(均P<0.05),說明circFOXK2負(fù)調(diào)控miR-409-3p,見圖3D和3E。

A:circFOXK2和miR-409-3p的結(jié)合位點(diǎn);B、C:雙熒光素酶分析,*P<0.05;D、E:敲低circFOXK2促進(jìn)miR-409-3p表達(dá),#P<0.05

2.4 circFOXK2和miR-409-3p對肺癌細(xì)胞增殖的影響

si-circFOXK2組A549和H1299細(xì)胞存活率分別為(59.67±4.38)%、(50.36±5.62)%,克隆數(shù)分別為(62.00±2.58)、(46.25±1.96)個(gè);si-NC組A549和H1299細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(100.00±0.00)%,克隆數(shù)(121.78±6.03)、(105.32±5.41),si-circFOXK2組較si-NC組均顯著降低(A549:t=27.623,P<0.05;t=27.344,P<0.05)、(H1299:t=17.30,P<0.05;t=30.80,P<0.05)。miR-409-3p組A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞存活率分別為(51.90±2.99)%、(40.23±3.24)%,克隆數(shù)分別為(52.67±2.05)、(44.35±2.51)個(gè),較miR-NC組[細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(100.00±0.00)%,克隆數(shù)分別為(122.22±8.38)、(98.63±5.62)個(gè)]均顯著降低(A549:t=48.261,P<0.05;t=24.185,P<0.05)、(H1299:t=55.34,P<0.05;t=26.46,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組A549和H1299細(xì)胞存活率分別為(85.21±2.81)%、(88.36±4.21)%,克隆數(shù)分別為(100.11±7.03)、(89.31±5.42)個(gè),較si-circFOXK2+anti-miR-NC組[細(xì)胞存活率分別為(60.21±5.89)%、(55.89±4.68)%,克隆數(shù)分別為(60.89±4.23)、(51.23±3.65)個(gè)]均顯著升高(A549:t=12.026,P<0.05;t=14.341,P<0.05)、(H1299:t=15.47,P<0.05;t=17.48,P<0.05)。見圖4。

2.5 circFOXK2和miR-409-3p對肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

si-circFOXK2組A549和H1299細(xì)胞遷移數(shù)分別為(106.11±6.49)、(90.32±5.42)個(gè),侵襲數(shù)分別為(88.22±4.61)、(73.62±3.58)個(gè),較si-NC組[細(xì)胞遷移數(shù)分別為(201.56±9.18)、(172.69±8.51)個(gè),侵襲數(shù)分別為(160.11±7.92)、(162.52±5.88)個(gè)]均顯著降低(A549:t=24.470,P<0.05;t=23.535,P<0.05)、(H1299:t=24.49,P<0.05;t=38.74,P<0.05)。miR-409-3p組A549和H1299細(xì)胞遷移數(shù)分別為(87.89±4.12)、(74.55±3.56)個(gè),侵襲數(shù)分別為(70.78±6.63)、(67.42±5.86)個(gè),較miR-NC組[細(xì)胞遷移數(shù)分別為(203.00±11.33)、(175.62±10.54)個(gè),侵襲數(shù)分別為(156.67±8.65)、(161.75±6.58)個(gè)]均顯著降低(A549:t=28.644,P<0.05;t=23.642,P<0.05)、(H1299:t=27.25,P<0.05;t=32.12,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組A549和H1299細(xì)胞遷移數(shù)分別為(177.44±6.53)、(184.65±7.58)個(gè),侵襲數(shù)分別為(141.00±6.85)、(149.36±7.69)個(gè),較si-circFOXK2+anti-miR-NC組[細(xì)胞遷移數(shù)分別為(104.56±8.01)、(112.56±8.12)個(gè),侵襲數(shù)分別為(84.78±5.20)、(78.62±5.84)個(gè)]均顯著升高(A549:t=21.156,P<0.05;t=19.611,P<0.05)、(H1299:t=19.47,P<0.05;t=21.98,P<0.05)。見圖5和圖6。

1:si-NC組;2:si-circFOXK2組;3:miR-NC組;4:miR-409-3p組;5:si-circFOXK2+anti-miR-NC組;6:si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組

1:si-NC組;2:si-circFOXK2組;3:miR-NC組;4:miR-409-3p組;5:si-circFOXK2+anti-miR-NC組;6:si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組

2.6 circFOXK2和miR-409-3p對肺癌細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

si-NC組、si-circFOXK2組、miR-NC組、miR-409-3p組、si-circFOXK2+anti-miR-NC組和si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)分別為(0.22±0.03)、(0.56±0.05)、(0.21±0.02)、(0.71±0.06)、(0.56±0.04)和(0.27±0.03),H1299細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)分別為(0.30±0.03)、(0.65±0.06)、(0.25±0.02)、(0.52±0.05)、(0.63±0.05)和(0.34±0.04)。N-cadherin蛋白表達(dá)在A549細(xì)胞中分別為(0.70±0.06)、(0.33±0.03)、(0.68±0.06)、(0.22±0.02)、(0.33±0.04)和(0.57±0.05),在H1299細(xì)胞中分別為(0.85±0.08)、(0.42±0.05)、(0.78±0.09)、(0.37±0.04)、(0.30±0.03)和(0.69±0.07)。si-circFOXK2組A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)高于si-NC組(t=17.493,P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)低于si-NC組(t=16.547,P<0.05)。si-circFOXK2組H1299細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)高于si-NC組(t=15.65,P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)低于si-NC組(t=16.55,P<0.05)。miR-409-3p組A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)高于miR-NC組(t=23.243,P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)低于miR-NC組(t=21.820,P<0.05)。miR-409-3p組H1299細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)高于miR-NC組(t=15.04,P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)低于miR-NC組(t=12.49,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)低于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(t=17.400,P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)高于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(t=11.245,P<0.05)。si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組H1299細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)低于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(t=13.59,P<0.05),N-cadherin蛋白表達(dá)高于si-circFOXK2+anti-miR-NC組(t=15.36,P<0.05)見圖7。

1:si-NC組;2:si-circFOXK2組;3:miR-NC組;4:miR-409-3p組;5:si-circFOXK2+anti-miR-NC組;6:si-circFOXK2+anti-miR-409-3p組;A、E:蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)(A:A549細(xì)胞,E:H1299細(xì)胞);B、F:1、2組中circFOXK2對A549及H1299細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響,與si-NC組比較,*P<0.05;C、G:3、4組中miR-409-3p對A549及H1299中蛋白表達(dá)的影響,與miR-NC組比較,*P<0.05;D、H:5、6組中circFOXK2和miR-409-3p對A549及H1299中蛋白表達(dá)的影響,與si-circFOXK2+anti-miR-NC組比較,*P<0.05

3 討論

circRNA是腫瘤進(jìn)程的重要調(diào)控子,對腫瘤發(fā)展具有重要影響。既往研究表明,circHIPK3、circ-PRKCI和circ_0046264等均是肺癌中表達(dá)上調(diào)的circRNA,這些circRNA促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性表型,敲減其表達(dá)有利于延緩肺癌的發(fā)展進(jìn)程[5-7];研究顯示circ_EPB41L2、circ_0015278和circ_0001073在肺癌中表達(dá)下調(diào),它們在肺癌中起抑癌基因的作用[8-10]。

在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)circFOXK2在肺癌中表達(dá)上調(diào),其敲減降低了肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中,上皮標(biāo)志物E-cadherin水平下降,而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin水平上升[11],進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)[12]。在本研究,circFOXK2敲低后,E-cadherin水平上升,N-cadherin水平下降,這進(jìn)一步證實(shí)circFOXK2敲減抑制了細(xì)胞遷移和侵襲。circRNA是高度穩(wěn)定的,且具有組織或細(xì)胞類型特異性表達(dá)的特點(diǎn),被認(rèn)為是有前途的疾病治療靶標(biāo)。目前,被稱為RNA干擾(RNA interference,RNAi)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制已被確定具有巨大的臨床應(yīng)用潛力,Onpattro注射液是一種siRNA藥物,已被批準(zhǔn)用于治療成人患者遺傳性經(jīng)甲狀腺視黃醛介導(dǎo)的淀粉樣變性(hATTR)引起的周圍神經(jīng)疾病(多神經(jīng)病變),此外,有50多種基于RNA的藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。因此circFOXK2 siRNA可能是用于肺癌臨床治療的有希望的分子。

大量的研究證實(shí)了circRNA的miRNA分子海綿作用。例如,circ_0001869在肺癌組織及細(xì)胞系表達(dá)增加,其通過發(fā)揮miR-638分子海綿作用并上調(diào)FOSL2的表達(dá)促進(jìn)肺癌腫瘤生長[13]。本研究證實(shí)了circFOXK2靶向負(fù)調(diào)控miR-409-3p。miR-409-3p是乳腺癌、卵巢癌和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)的一個(gè)miRNA,上調(diào)miR-409-3p可分別靶向抑制TWIST1、Rab10、PDK1的表達(dá)降低乳腺癌、卵巢癌和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞的惡性行為,可作為這些腫瘤治療的分子靶點(diǎn)[14-16]。本研究結(jié)果顯示,miR-409-3p在肺癌組織中低表達(dá),其過表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。與既往的研究結(jié)果[17]一致,這些數(shù)據(jù)表明miR-409-3p作為腫瘤抑制子調(diào)控肺癌進(jìn)程。此外,miR-409-3p抑制劑可以逆轉(zhuǎn)circFOXK2敲減對細(xì)胞的影響,這提示circFOXK2可靶向miR-409-3p調(diào)控肺癌細(xì)胞的惡性行為。

綜上,circFOXK2可能是肺癌治療的潛在靶點(diǎn),其通過靶向抑制miR-409-3p的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。